全 文 ：缙云黄芩 ＨＰＬＣ指纹图谱的建立及其不同部位
活性成分含量研究
张家辉，杨蕊，邓洪平
（西南大学 生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 ４００７１５）
［摘要］ 目的：建立重庆特有药用植物缙云黄芩ＨＰＬＣ指纹图谱，对其根、茎、叶中４种主要的黄酮类活性成分进行分离、
含量测定和比较研究。方法：采用梯度洗脱方法进行色谱分离和含量测定，记录１０个种群缙云黄芩指纹图谱，采用国家药典
委“中药色谱指纹图谱相似度评价系统２００４Ａ版”建立指纹图谱共有模式。结果：建立了同时分离和测定４种活性成分的梯
度洗脱程序；缙云黄芩指纹图谱１４个共有峰分离度良好、保留时间稳定、重现性好；供试样品间相似度较高；４种活性成分总
量多少依次为根＞茎＞叶，尤其是黄芩苷在根中的积累量达茎中的５倍以上。结论：本研究建立的色谱指纹图谱分析方法稳
定、可靠，能为缙云黄芩种源的宏观分析、探明其遗传变异模式及其保护和合理开发利用等提供重要的理论依据。
［关键词］ 缙云黄芩；ＨＰＬＣ；指纹图谱；黄芩苷；黄芩素；汉黄芩苷；汉黄芩素
［收稿日期］ ２００９０４０１
［基金项目］ 重庆市自然科学基金计划项目（ＣＳＴＣ，２００８ＢＢ５２５６）；
国家“２１１工程”三期建设项目
［通信作者］ 邓洪平，Ｔｅｌ：１３８８３３９５６８７，Ｅｍａｉｌ：ｄｅｎｇｈｐ＠ｓｗｕ．ｅｄｕ．
ｃｎ
黄芩属植物体内含多种化学成分，其主要药
用成分为黄酮类化合物，有清热泻火、解毒、止血、
安胎以及抗肿瘤等作用，其中含量较高的活性成
分是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素［１２］。
缙云黄芩 ＳｃｕｔｅｌａｒｉａｔｓｉｎｙｕｎｅｎｓｉｓＣ．Ｙ．ＷｕｅｔＣｈｏｗ
是唇形科黄芩属多年生草本植物，为重庆市缙云
山特有种，现仅残存于缙云山几个狭窄的岛状区
域内，由于受各种生态因子的影响，缙云黄芩种群
与个体间在化学成分组成及含量上存在一定差
异。以往对该物种的研究仅限于表观形态、种群
特征等，而对其化学成分的研究尤其是对其活性
成分含量的研究尚未见报道［３５］。本研究首次报
道缙云黄芩 ＨＰＬＣ指纹图谱研究方法，能对黄芩
苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素４种活性成分同
时进行测定，并就 ４种活性成分在根、茎、叶中的
含量进行了比较研究，以期为缙云黄芩种质资源
鉴别、遗传多样性分化研究及资源保护和合理开
发利用提供理论与实践依据。
１ 材料
岛津（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）高效液相系统，包括 ＣＢＭ
２０Ａ 型 系 统 控 制 器、ＬＣ２０ＡＤ／２０ＡＴ泵、ＣＴＯ
１０ＡＳＶＰ型柱温箱、ＳＰＤ２０Ａ检测器。
黄芩苷（批号１０８４０７０１１０，纯度≥９８％），由中
药固体制剂制造技术国家工程研究中心提供；汉黄
芩素（批号１１１５１４２００４０３，供鉴定用），购自中国药
品生物制品检定所；黄芩素（批号 ０８１００９，纯度
!
９８％）、汉黄芩苷（批号０７１１１２，纯度
!
９８％），购自
上海融禾医药科技发展有限公司。色谱乙腈（ＳＫ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ公司），色谱甲醇（成都科龙化工），双蒸
水，其他试剂均为分析纯。
缙云黄芩采自重庆市缙云山现存的１０个自然
种群，样品来源见表１。供试样品采自各种群的同
一植株系，于２００８年７月采集，采集后将根、茎、叶
分开，３０℃低温烘干后研磨成细粉。样品经西南大
学生命科学学院何平教授鉴定。
表１ 重庆市缙云黄芩样品来源
Ｎｏ． 样品来源 Ｎｏ． 样品来源
Ｓ０１ 三花石 Ｓ０６ 青龙寨后门
Ｓ０２ 北温泉后山 Ｓ０７ 海螺洞
Ｓ０３ 绍龙观 Ｓ０８ 洛阳桥
Ｓ０４ 园艺场 Ｓ０９ 白云竹海
Ｓ０５ 狮子峰 Ｓ１０ 马中咀
２ 方法与结果
２．１ 色谱条件
ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８ＰＡＱ色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，
５μｍ）；流动相Ａ为乙腈，流动相 Ｂ为 Ｈ２ＯＴＨＦ磷
酸（８５∶１２∶０３）；梯度洗脱时间程序见表２。检测波
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长２７５ｎｍ；流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温３０℃；进样量
２０μＬ。所有组分在６０ｍｉｎ内被检测完。
表２ 梯度洗脱时间程序
ｔ／ｍｉｎ Ａ Ｂ
０～７ １５ ８５
１４ ２１ ７９
１７～３０ ２８ ７２
４５ ３９ ６１
５５～６０ １５ ８５
２．２ 对照品溶液的制备
分别精密称定黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄
芩素各１０ｍｇ，分别加甲醇（色谱级）使溶解，制成
各含１０ｇ·Ｌ－１的溶液，作为对照品溶液。
２．３ 供试品溶液的制备
精密称定样品粉末０１ｇ，加入甲醇（分析纯）
１０ｍＬ超声（功率７０Ｗ，频率１３ｋＨｚ）提取２次，每
次２５ｍｉｎ，摇匀，过滤，滤液转于旋转蒸干仪上浓缩
蒸干（３０℃），甲醇（色谱级）定容至５ｍＬ，作为供试
样品溶液。
２．４ 方法学考察
２．４．１ 稳定性考察 取缙云黄芩供试品溶液，分别
于０，２，４，８，１６，２４ｈ进样２０μＬ，检测。结果表明，
各共有峰相对保留时间和其相对峰面积的 ＲＳＤ分
别为０２％～０９％和０４％～１２％，供试品溶液在
２４ｈ内稳定。
２．４．２ 精密度考察 取缙云黄芩供样品溶液，连续
重复进样６次，记录指纹图谱。结果表明，各共有峰
相对保留时间和其相对峰面积的ＲＳＤ分别为０２％
～０８％和０４％～１０％，仪器精密度良好。
２．４．３ 重现性考察 取缙云黄芩样品６份，制备成
供试品溶液，分别进样２０μＬ，记录指纹图谱。结果
表明，各共有峰相对保留时间和其相对峰面积的
ＲＳＤ分别为０３％～１２％和０６％～１５％，实验方
法重现性良好。
２．５ 线性关系考察
分别吸取上述黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄
芩素对照品溶液各５，１７５，３５，７０，１４０，２８０μＬ，用
色谱甲醇分别定容至１０ｍＬ，混匀，用０２２μｍ滤
膜过滤后，分别取２０μＬ按２１色谱条件进样，检
测，对照品色谱图见图１。以对照品进样浓度为横
坐标、峰面积积分值为纵坐标进行线性回归，其回归
方程为：黄芩苷Ｙ＝４７６３９Ｘ－１９９８９，Ｒ２＝０９９８３，线
性范围１７５～２８０ｍｇ·Ｌ－１；黄芩素 Ｙ＝８２７２５Ｘ－
６１８００，Ｒ２＝０９９９４，线性范围５～２８０ｍｇ·Ｌ－１；汉
黄芩苷Ｙ＝５２２２８Ｘ－１１６５４，Ｒ２＝０９９９２，线性范
围５～２８０ｍｇ·Ｌ－１；汉黄芩素Ｙ＝９６３５１Ｘ＋６７７２８，
Ｒ２＝０９９８４，线性范围１７５～２８０ｍｇ·Ｌ－１。
１．黄芩苷；２．汉黄芩苷；３．黄芩素；４．汉黄芩素。
图１ ４个黄酮对照品ＨＰＬＣ图
２．６ 样品的测定
按２３方法制备１０个种群根、茎、叶供试样品
各３份，各样品按照选定的色谱条件连续进样３次，
记录色谱图，见图２。
图２ 不同种群缙云黄芩（茎）的ＨＰＬＣ图
２．７ 缙云黄芩指纹图谱的建立和分析
２．７．１ 共有峰的确定 将１０个种群样品（茎）的色
谱图（ＡＩＡ文件）导入国家药典委“中药色谱指纹图谱
相似度评价系统２００４Ａ版”软件进行比较，选择稳定
性好、出峰特征明显的色谱峰为共有峰，生成缙云黄
芩共有模式对照指纹图谱（图３），共得到１４个共有
峰（根据图１，可知８号峰为指标成分黄芩苷、１１号为
汉黄芩苷、１３号为黄芩素、１４号为汉黄芩素），其保留
时间（峰面积）分别为 ５６１（２５０５５６２３），６０３
（２８９８０９９０），８３２（１７８６９１３２），１３４１（１４４３０７６７），
１５３６（７３ ０１４８１），１６４３ （３４７５５９９），１７６９
（９４２８２２６），１９６８（３４４０６９１６０），２１４９（４５７７７０８２），
２２７８（２６２７５７２８），２４０５（３７６９４００８８），２５２４
（３５７５２４３），３２８４（３２０９８６０７），４４７１（７３５８６８９７）。
２．７．２ 缙云黄芩（茎）指纹图谱相似度分析 １０个
缙云黄芩样品与共有模式对照指纹图谱的相似度分
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８．黄芩苷；１１．汉黄芩苷；１３．黄芩素；１４．汉黄芩素。
图３ 缙云黄芩（茎）共有模式对照指纹图谱
别为 ０９８７，０９９４，０９９３，０９７１，０９８３，０９９４，
０９８１，０９８１，０９８８，０９７２；平均相似度为０９８４。
２．７．３ 样品（茎）指纹图谱分析 测试样品来自缙
云山现已知的１０个仅存缙云黄芩种群，各种群样品
（茎）色谱图中均含有上述１４个共有特征峰（包含４
种主要的活性成分），共有峰的分离度良好、保留时
间稳定、重现性好，且在不同种群间相互间吻合较
好，可作为缙云黄芩的特征指纹。以黄芩苷色谱峰
为内参比峰（Ｓ峰），将所得的共有峰面积相当于内
参照峰的峰面积量化，对各样品共有峰相对峰面积
值进行比较，结果见表３。
表３缙云黄芩指纹图谱共有峰相对峰面积值
Ｎｏ．
共有峰相对面积
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８（Ｓ） ９ １０ １１ １２ １３ １４
Ｓ０１ ００６３ ００８２ ００５４ ００３２ ００３５ ００１７ ００３４ １０００ ００５３ ００９４ １４４７ ００１４ ００４８ ０２０７
Ｓ０２ ０１０２ ０１５０ ００５６ ００２９ ００２０ ００１７ ００２９ １０００ ００９２ ０１１０ １２９６ ００１５ ０１０３ ０２０１
Ｓ０３ ００４９ ００７０ ００４３ ００４８ ００２２ ０００９ ００２４ １０００ ００８３ ００８７ １３２８ ０００９ ００７９ ０１８９
Ｓ０４ ００８４ ０１５６ ００７５ ００３９ ００２４ ０００７ ００１７ １０００ ０１９６ ００９３ ０７２８ ０００８ ０１０５ ００８２
Ｓ０５ ００６２ ００６５ ００４８ ００６３ ００１３ ００１８ ００２９ １０００ ０１８９ ０１１７ ０７９４ ００２１ ０１１０ ０１７０
Ｓ０６ ００６８ ００５４ ００４７ ００５３ ００１９ ０００８ ００２７ １０００ ０２２４ ００５１ １０１０ ０００８ ０１１５ ０２８４
Ｓ０７ ００４１ ００２８ ００１３ ００３１ ００１０ ０００６ ００２５ １０００ ０１００ ００３９ ０７５２ ０００５ ００９８ ０１６３
Ｓ０８ ００６１ ００４２ ００２１ ００３９ ００１８ ０００８ ００３３ １０００ ００９１ ００５５ １５７３ ０００９ ００７９ ０３５９
Ｓ０９ ００５８ ００５７ ０００４ ００２２ ０００４ ０００３ ００１６ １０００ ０１２３ ００２６ ０８４２ ０００８ ００８１ ０１６６
Ｓ１０ ０１５２ ０１１０ ０１８３ ００８４ ００５７ ００１２ ００５４ １０００ ０１５７ ０１０２ １６５８ ００１２ ０１０９ ０４６３
２．８ 缙云黄芩根茎叶中４种活性成分含量比较
选取Ｓ０８号样品，依法分别测定并计算根、茎、叶中
４种活性成分的含量，结果见表４。
３ 讨论
表４ 缙云黄芩根茎叶中４种活性成分含量（珋ｘ±ＳＤ，ｎ＝３）
部位
活性成分含量／ｍｇ·ｇ－１
黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素
根 ８７３±００５４９ １５７±００３６０ ０１７±０００５４ －
茎 １６４±００４９７ １８２±００５２８ ０１３±０００４４ ０７３±００１４５
叶 ０１１±０００１３ ０２９±００１５７ － ００２±０００１５
注：“－”表示该部位不含此种活性成分。
３．１ 提取方法的选择
采用了超声处理方法进行提取。为尽可能提取
出样本中的黄酮类物质，曾比较相同的超声处理条
件下不同浓度甲醇（５０％，７５％，９０％，１００％）和不
同时间（４０，５０，６０ｍｉｎ）的提取效果，结果表明，以纯
甲醇为提取溶剂超声破碎５０ｍｉｎ（分２次破碎，每次
２５ｍｉｎ），提取比较完全，且供试品溶液较为稳定。
３．２ 色谱条件的考察
本研究所得梯度洗脱程序，６０ｍｉｎ内即可使全
部色谱峰流出，且各主要色谱峰保留时间适中、分离
度较好。与甲醇水流动相相比，有机相使用乙腈可
以更快地完成洗脱，且柱压较低，水相中加入 ＴＨＦ
（四氢呋喃）可使峰形尖锐、避免拖尾。
３．３ 指纹图谱的评价
本研究首次对重庆市特有植物缙云黄芩开展
ＨＰＬＣ指纹图谱研究。因茎中成分数量较根、叶中
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多，且分离度较好，故选择１０个种群茎样品来建立
指纹图谱共有模式。研究发现，不同种群茎的
ＨＰＬＣ图谱间虽存在一定差异，但均具有相同的特
征峰，且能同时将４种极性相似的主要活性成分进
行较好分离，所得到共有峰的保留时间稳定、重现性
好，表明所建立的指纹图谱分析方法稳定、可靠。
３．４ 缙云黄芩种群遗传相似性分析
野外观察发现，缙云黄芩种群呈相互隔离的
“岛屿”状分布，种群内主要以根茎进行无性繁殖，
存在大量的无性系分株［５］。实验结果显示，各种群
均具有１４个共有指纹特征峰，且相对峰面积值间差
异不大；同时１０个缙云黄芩样品与共有模式对照指
纹图谱的相似度均在 ０９７以上，平均相似度为
０９８４，表明样品间存在着显著的相似性，提示不同
种群缙云黄芩间存在较高的遗传同质性和较近的亲
缘关系。
３．５ 活性成分含量比较研究
不同种群根、茎、叶样品中４种活性成分含量情
况与Ｓ０８号样相近。４种活性成分在茎中均有积
累，而在根中未检测到汉黄芩素、在叶中未检测到黄
芩素；叶中活性成分的积累量极少，远少于根和茎；
根与茎中，汉黄芩苷和黄芩素的含量大体相近，而黄
芩苷在根中的积累量却远较茎中多；以苷元形式存
在的黄芩素和汉黄芩素在缙云黄芩体内含量相对较
少。由此证实了根是黄芩属植物黄酮类活性物质的
主要积累部位，因而是常用药用部位。此外，４种活
性成分在缙云黄芩体内的积累情况与同属其他植物
的情形相似［６］。
［参考文献］
［１］ 宋双红，张媛，王?之．ＨＰＬＣ测定不同产地黄芩中黄酮化合物
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１３（４）：１６．
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性研究［Ｊ］．西北植物学报，２００３，２３（４）：５６６．
［５］ 李俊敏，何平，林永慧，等．缙云山特有植物缙云黄芩种群生态
位研究［Ｊ］．西南师范大学学报：自然科学版，２００４，２９（３）：
４５１．
［６］ 张箭，肖丽和，李发美．ＲＰＨＰＬＣ法测定黄芩属四种药材中五
个活性成分的含量［Ｊ］．中药材，２００５，２８（５）：３８９．
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［责任编辑 王亚君］
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