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Vol.34，Issue 4
February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
黄芪注射液载入修饰胶原促进血管再生的研究
严士海*，朱萱萱，陈晓虎，李七一，龚 韧，姚 昶，朱长乐
（江苏省中医院，江苏 南京 210029）
[摘要] 目的：将黄芪载入胶原支架内，通过对胶原支架进行修饰，观察黄芪是否具有促血管生成活性及探讨可能的生
物学机制。方法：将 5，10 μL黄芪注射液载入修饰后的胶原内，通过鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM，Chicken Chorioallantoic Membrane)
实验模型，从胶原周围微血管再生数量、胶原内血红蛋白含量、胶原干重、CD34 抗原免疫组化标记等指标来考察黄芪注射
液对肝素修饰后胶原促血管再生的作用。结果：黄芪联合肝素修饰后的胶原能够产生与血管内皮生长因子相当的疗效，血管
计数、胶原血红蛋白含量、CD34的表达均显著性增加（P<0.01，与单纯胶原组比较）；与单纯胶原组相比，胶原＋黄芪 10ul
组胶原干重显著增加(P<0.05)。结论：黄芪注射液载入修饰后的胶原具有良好的促血管再生作用。
[关键词] 黄芪；胶原；血管生成
冠心病是冠状动脉粥样硬化致心肌缺血缺氧
而引起的心脏病，在我国，该病引起的死亡人数约
占心脏病总死亡数的 10％～20％，近年有增多的趋
势[1]。因此，冠心病的治疗已经成为当前研究的热
点。随着分子生物学的发展，“治疗性血管新生”
策略被提出[2]。血管再生是指以原血管长出新生血
管的多步骤生物学过程。这一系列过程包括细胞外
物质降解、内皮细胞迁移及增殖，毛细血管化形成
及互相吻合。
黄芪注射液为治疗冠心病最常用的中药制剂，
具有多靶位的作用特性，在临床上治疗血管生成障
碍性疾病方面具有确切的疗效，实验研究表明其具
有促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用[3-4]。如何使
得药物安全的在体内稳定持久的表达，而且获得长
期的促血管生成效应是有待解决的问题，需要一个
良好的药物缓释系统——可控释的生物模拟系统
（生物膜）。胶原是组织工程中应用最广的生物膜。
作者研究了经过黄芪注射液修饰后的胶原对
鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响，并对其机制进行
了初步探讨。
1 材料
1.1 试剂 胶原由 Dr Suwelack Skin & Health Care
公司（Billerback，德国）无偿提供，剪切并用打孔

[收稿日期] 2008-09-10
[基金项目] 江苏省人事厅科研基金项目 (06-B-022)
[通信作者] *严士海，Tel:( 025)86617141，E-mail：yhhy0210@yahoo.
com.cn
器制成直径为 10 mm、厚度为 2 mm 圆柱体备用。
胶原主要为 I 型牛胶原，由冻干法制成，孔径在 15～
25 μm，成孔率约 98%。乙基-碳二亚胺盐酸盐/N-
羟基代琥珀酰亚胺(EDC/NHS，上海延长生化公
司)；2-吗啉乙磺酸（MES，Sigma 公司）；肝素钠
（BioSharp China）；血红蛋白标准品（南京建成试
剂公司）；生长因子 rhVEGF（R&D System 公司）。
CD34 抗原免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）；分
析纯为国产分析纯。
1.2 鸡胚 购于南京生物药厂。
1.3 药物 黄芪注射液，成都地奥九泓制药厂，批
号 0603018。
1.4 仪器 FT-CFC0.3 型半自动孵化器（北京春明
方通电子有限公司）；SW-CJ 型超净工作台（苏州
安泰空气技术有限公司）；HZ-C 型恒温振荡器（太
仓市科教器材厂）；PA1004 型电子分析天平（上海
精密天平厂）；SP-756pc 型紫外线分光光度计（上
海光谱仪器有限公司）；YXQ-LS-50 SⅡ型立式压力
蒸气灭菌器（上海博迅实业有限公司）；倒置显微
镜（Olympous 公司）。
2 方法
2.1 胶原修饰过程 胶原修饰过程与 Wissink et al
等方法基本相同[5]，主要的区别在于肝素结合与胶
原纤维间的交链同时进行，具体过程在 37 ℃下
0.05 mol·L-1 MES 缓冲液中（pH 5.6）以交链剂
EDC/NHS 活化肝素中羟基团 10 min，活化后，将


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胶原浸入反应液，轻微晃动（60 次/min）4 h，反
应前，轻微挤压以排出胶原内气体。反应完成后用
0.1 mol·L-1 Na2HPO4 洗涤 2 h，以中止反应。4 mol·L-1
NaCl 洗涤 24 h（换液 4 次），蒸馏水洗涤 24 h（换
液 5 次）。接着将标本于置于 75％乙醇浸泡至实验
前 24 h。
2.2 rhVEGF、中药注射液植入胶原 胶原修饰后
浸入 75%乙醇灭菌 24 h，然后在超净工作台中予以
无菌生理盐水洗涤 24 h（换液 6 次），在植入鸡胚
前90 min，于超净工作台中相应标本中植入25 mg·L
rhVEGF 及中药注射液（黄芪注射液 5, 10 μL）。
2.3 鸡胚尿囊膜实验（CAM 实验）[6] 鸡胚，4 日
龄，购入后 70%乙醇擦洗灭菌后，置于鸡胚孵箱孵
化 3 d（38 ℃），之后以照蛋器标记出鸡胚“开窗”
位置，进行血管再生实验。
2.4 标本的普通观察 肉眼观察标本降解情况、尿
囊膜血管生长状况、尿囊膜“吞噬”标本状况。于标
本 30 cm 处固定数码照相机，调焦后行大体标本照
相记录。
2.5 微血管计数 取出尿囊膜先浸入生理盐水中
展平，然后贴于玻片表面，固定液固定后（甘油）
上覆盖玻片。固定好的尿囊膜玻片以光镜下，100
倍放大，格子法行微血管（直径在 20～40 μm）计
数，每个标本选 3 个不重叠的视野，结果取均值。
2.6 血红蛋白测定 血红蛋白含量光度计法测定，
标本从鸡胚中取出浸入 1 mL 蒸馏水内 5 min 以去
除表面血液，然后将标本再进入 1 mL 蒸馏水内 24 h
以洗出标本内血红蛋白，溶液在 410 min 处测量吸
光度值，按照标准曲线推算出血红蛋白的浓度，整
个操作过程参照南京建成生物工程研究所的血红
蛋白测试盒说明书。
2.7 标本干重测量 取出的胶原膜，首先将粘连的
组织仔细剔除，然后将其浸入 1 mL 蒸馏水中 3 d，
然后每天更换 1 次蒸馏水，洗涤后干燥，将干燥后
的标本干重与其植入鸡胚前的干重的差值作为评
价组织转入标本的程度的指标。
2.8 CD34 抗原免疫组化标记 标本取出后在室温
下以 4%的甲醛固定，按试剂盒说明书进行 CD34
抗原染色。结果判定：免疫阳性产物为棕黄色，以
PBS 代替一抗染色，作为阴性对照。密封片号情况
下（单盲），在光学显微镜下由同一人观察阳性细
胞染色范围及程度，对切片染色阳性情况进行评
估，用图像分析系统对染色情况进行半定量分析。
每张切片随机抽取 5 个 400 倍视野，以 μm 为单位，
选择合适的门限分割值，测定阳性细胞的染色指
数[7]。
2.9 数据统计 采用 SPSS 统计分析软件对实验结
果进行分析。计数资料以 ±x s 表示，多组数据用方
差分析，两两比较用 t 检验。
3 结果
3.1 胶原植入鸡胚尿囊膜孵化 7 d 血管生长情况的
大体照片 胶原及胶原载入 VEGF、黄芪注射液组
尿囊膜周微血管均成辐辏状生长，在没有胶原的对
照组中，尿囊膜内血管方向不定，数量少于其他各
组(图 1)。

图 1 胶原植入鸡胚尿囊膜孵化 7 d 血管生长情况
的大体照片

3.2 黄芪注射液载入（修饰后）胶原对微血管再生
数目的影响 对照组与单纯胶原组的血管数分别
是(33.75±3.59)与(41.67±2.77)，二者存在显著性差
异，显示胶原具有促进血管再生作用。与对照组相
比，胶原＋黄芪 5 μL 组、胶原＋黄芪 10 μL 组血管
计数均显著性增加，表明黄芪注射液具有促血管生
长作用(表 1)。


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表 1 生长因子与黄芪注射液对微血管再生计数
的影响( ±x s ，n=8)
组别 血管数
对照 33.75±3.59 2)
单纯胶原 41.67±2.77
胶原＋VEGF 53.29±3.29 2)
胶原＋黄芪 5 μL 45.13±2.22 1)
胶原＋黄芪 10 μL 54.17±4.92 2)
注：与单纯胶原组比较 1)P<0.05，2)P<0.01。
3.3 黄芪注射液载入（修饰后）胶原对胶原干重的
影响 与单纯胶原组相比，胶原＋黄芪 10 μL 组
胶原干重显著增加(P﹤0.05)。显示血管充分长入胶
原，而胶原＋VEGF 组及胶原＋黄芪 5 μL 组的胶
原干重增加不明显(表 2)。
3.4 黄芪注射液载入（修饰后）胶原对胶原血红蛋
白含量的影响 与单纯胶原组相比，胶原＋黄芪 10
μL 组胶原血红蛋白含量显著增加(P﹤0.01)。显示血

表 2 生长因子与黄芪注射液对胶原干重的影响( ±x s ，n=8) g
组别 胶原植入前 胶原植入后 植入前后差值
单纯胶原 0.004 4±0.000 2 0.005 4±0.000 6 0.001 0±0.000 5
胶原＋VEGF 0.004 4±0.000 2 0.005 9±0.000 4 0.001 5±0.000 5
胶原＋黄芪 5 μL 0.004 4±0.000 2 0.005 7±0.000 6 0.001 4±0.000 7
胶原＋黄芪 10 μL 0.004 4±0.000 2 0.006 2±0.000 61) 0.001 8±0.000 71)
注：与单纯胶原组比较 1)P<0.05。

管充分长入胶原。胶原＋VEGF 组及胶原＋黄芪 5
μL 组的胶原血红蛋白含量也显著增加(表 3)。
表 3 生长因子与黄芪注射液对胶原血红蛋白含量
的影响( ±x s ，n=8)
组别 血红蛋白/mg·g-1
单纯胶原 28.88±4.29
胶原＋VEGF 50.63±9.94 1)
胶原＋黄芪 5 μL 49.25±10.751)
胶原＋黄芪 10 μL 61.63±6.971)
注：与单纯胶原组比较 1)P﹤0.01 (表 4 同)。

3.5 黄芪注射液载入（修饰后）胶原对胶原中 CD34
的影响 胶原＋黄芪 10 μL 组 CD34 的染色指数达
到 34.94%，说明 CD34 的表达显著增加(P﹤0.01，
与单纯胶原组比较)。进一步显示新生血管充分长入
胶原。胶原+VEGF 组及胶原+黄芪 5 μL 组的胶原中
CD34 的表达也显著增加(表 4)。
表 4 生长因子与黄芪注射液对 CD34 的影响( ±x s ，n=8)
组别 染色指数/%
单纯胶原 10.81±2.43
胶原＋VEGF 25.19±0.99 1)
胶原＋黄芪 5 μL 24.14±3.091)
胶原＋黄芪 10 μL 34.94±5.651)

4 讨论
冠心病作为为心血管系统常见病、多发病，严
重危害人们的身心健康，其发病率、死亡率、致残
率均居高不下。药物治疗、介入治疗、外科手术治
疗为其主要常规治疗方法。随着分子生物学的发
展，促血管生长因子的发现，冠心病的治疗进入了
一个新的领域—冠心病治疗性血管新生疗法。微血
管计数与单位胶原中血红蛋白含量的实验结果都
显示，黄芪注射液能促进鸡胚 CAM 血管生成作用，
这与众多研究者的结论相似[3-4]。而且胶原使黄芪注
射液的释放具有一定的可控性。有资料表明，黄芪
可明显上调 VEGF 水平，有促进血管内皮细胞增殖
及 DNA 合成的作用[8]。因此，推测黄芪注射液可
能通过 VEGF 的高表达来促进血管再生。
CD34 是一种相对分子质量为 110×103的糖基
化跨膜糖蛋白，CD34 内皮细胞抗原在毛细血管、
小血管内皮细胞呈稳定强阳性，被认为是目前血管
内皮细胞的最可靠标记，是目前检验微血管构筑的
最好方法[9]。CD34 免疫组化进一步显示，血管已经
长入胶原。胶原＋黄芪 10 μL 组 CD34 的染色指数
达到 34.94%，与单纯胶原组比较具有显著性差异。
祖国医学中，气能生血，气旺，则化生血的功
能亦强；黄芪素有“补气诸药之最”之称，具有补
气生血之功效。黄芪能够修复血管内皮细胞的损
伤，促进其增生[10]，并增加血管内皮细胞间的黏附
作用[11]。黄芪注射液临床用于治疗缺血性心脏病多


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年，具有良好的疗效[12-13]。本实验选择黄芪注射液
载入肝素修饰后的胶原内，探查其能否代替血管内
皮生长因子的疗效。
本次实验发现在微血管增生方面，黄芪注射液
能够达到与血管内皮生长因子相同的疗效。本文结
果证实黄芪注射液载入修饰后的胶原具有促血管
再生作用，中药黄芪载入修饰后的胶原能产生与生
理结合血管内皮生长因子相同的疗效，黄芪的具体
作用机制还有待进一步探查。
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Effects of collagen matrices by covalent incorporation of heparin and loading
with huangqi injection (HI) on anagenetic blood vessel

YAN Shihai*, ZHU Xuanxuan, CHEN Xiaohu, LI Qiyi, GONG Ren, YAO Chang, ZHU Changle
(Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

[Abstract] Objective: To investigate effects of collagen matrices by covalent incorporation of heparin and loading with
huangqi injection (HI) on anagenetic capillaries, we established the chick chorioallantois model. The collagen matrices by covalent
incorporation of heparin and loading with HI were placed and then the eggs were continuously incubated for 3 days. The number of
capillaries in the vicinity of samples, the hemoglobin content inside the samples, the dry weight and the macroscopic observation
were evaluated. We found the heparinized matrices had comparable angiogenic effects. The number of capillaries, the hemoglobin
content, the expression of CD34 increased remarkably (P﹤0.01). So we concluded that HI might be considered as an alternative or
addition agent to promote the acification of capillaries.
[Key words] Huangqi injection(HI); collagen; angiogenesis
[责任编辑 刘 ]