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Vol.34，Issue 4
February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
基于寒/热性对照抗原的斑点免疫印迹法
中药药性研究
王厚伟*，窦彦玲，田景振，李 峰，王世军，王振国*
（山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355）
[摘要] 目的：从免疫原性上探讨中药药性的物质基础。方法：以高良姜、肉桂与仙茅 3 味典型热性中药水提物的混合
品作为热性对照抗原，以黄连、大黄与知母 3 味典型寒性中药水提物的混合品作为寒性对照抗原，免疫家兔后，制备相应多
克隆抗体，分别应用寒、热性对照抗原抗体与 9 味中药水提物作斑点免疫印迹，杂交信号应用 Quantity One 定量扫描分析。
结果：9 味中药与热性对照抗原多克隆抗体的印迹信号大小顺序为：干姜、附子、杜仲、秦皮、金银花、知母、黄连、大黄、
黄柏；与热性对照抗原多克隆抗体的印迹信号相似度分别为：57.33 %，43.56 %，34.16 %，30.2 %，28.81 %，26.53 %，21.68
%，17.62 %，14.85 %；9 味中药与寒性对照抗原多克隆抗体的印迹信号大小顺序为：大黄、知母、黄连、黄柏、干姜、金
银花、秦皮、杜仲、附子；与寒性对照抗原多克隆抗体的印迹信号相似度分别为：55.22 %，54.23 %，46.72 %，34.08 %，
30.3 %，24.48 %，24.33 %，20.35 %，15.17 %。以印迹信号相似度为聚类变量，经 Wistar’s Method 聚类分析，9 味中药被
聚为 2 大类，一大类为：黄柏、知母、黄连、大黄，该大类与寒性对照抗原距离小，与寒性对照抗原的距离依次增大；另一
大类为：干姜、附子、杜仲、秦皮、金银花，该大类与热性对照抗原距离小，与热性对照抗原的距离依次增大。结论：总体
上，测试中药与对照抗原抗体的印迹信号相似度越小，其药性与对照抗原的距离越大；斑点免疫印迹法是中药药性物质基础
研究的一种实用、有效的新方法。
[关键词] 寒/热性中药；多克隆抗体；斑点免疫印迹

中药功效是其本质属性的客观表现，药性是其
本质属性的主观反映，成分是构成药效的物质基
础。构成中药四性理论的 3 个核心元素是功效、物
质、药性。就中药四性成分要素表征体系的研究而
言，主要的研究目标是探求构成中药的初生物质、
次生物质、无机成分与寒、热药性间的关系及其规
律性。然而，相同药性的中药之间是否存在相近的
物质构成呢？该问题的回答对于中药药性物质基
础的研究具有方向性的指导意义。
中药的不同化学组成和空间结构的抗原物质
在免疫动物体内可以产生针对不同特异抗原的多
克隆抗体，基于这些多克隆抗体的免疫识别作用，
可以反向探求与平行比较不同药性中药水提物的
物质构成及其空间结构的差异。本研究尝试应用斑
点免疫印迹的新方法，从免疫学的角度探讨中药药

[收稿日期] 2008-05-20
[基金项目] 国家重点基础研究发展计划（973）项目（2007CB51 2601）；
山东省优秀中青年科学家奖励基金（2007BSB14087）
[通信作者] *王厚伟，E-mail：houweiw@163.com，*王振国，E-mail：
zhenguow@126.com
性的物质基础。以 3 味经典热性中药：高良姜、肉
桂与仙茅的水提物为热性对照抗原，以 3 味经典寒
性中药：黄连、大黄与知母的水提物为寒性对照抗
原，应用斑点免疫印迹法对 9 味中药（大黄、知母、
黄连、干姜、黄柏、金银花、秦皮、杜仲、附子）
药性中具有免疫原性的物质基础做了比较研究。
1 材料
1.1 动物 新西兰大耳白兔，体重 2.0 kg，雄性，
由山东大学动物中心提供，动物合格证号
SCXK(鲁)200301004，饲养环境温度 25 ℃。
1.2 药材 高良姜 Alpinia officinarum Hance，肉桂
Cinnamomum cassia Presl，仙茅 Curculigo orchioides
Gaertn，大黄 Rheum palmatum L.，知母 Anemarrhena
asphodeloides Bge.，黄连 Coptis chinensis Franch.，
黄柏 Phellodendron chinense Schneid，干姜 Zingiber
officinale Rosc.，金银花 Lonicera japonica Thunb.，
秦皮 Fraxinus rhynchophylla Hance.，杜仲 Eucommia
ulmoides Oliv.，附子 Aconitum carmichaeli Debx.，
购自山东中医药大学附属中鲁医院，由本院教研室


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周风琴教授鉴定。
1.3 试剂 硝酸纤维素膜（北京中山公司，生产批
号 051086），辣根酶标记山羊抗兔 IgG（北京中山
公司，生产批号 060812）、ECL 试剂盒（北京中山
公司，生产批号 063277）。
2 方法
2.1 供试样品溶液的制备 分别将上述 12 味药材
粉碎，过 60 目筛，准确称量药材粉末各 20 g，加
入 20 mL，25 mmol·L-1PBS（磷酸盐溶液），搅拌浸
润 30 min 后，充分研磨浸提 30 min，其间，分 3
次加入 60 mL PBS，1 万×g 离心 10 min，上清收集
于 250 mL 量瓶中；沉淀加入 20 mL PBS 重新悬浮，
研磨浸提，离心，重复上述操作 3 次，上清液合并
于量瓶中，定容至 250 mL，4 ℃保存备用。
2.2 寒、热性对照抗原的制备 3 味热性中药高良
姜、肉桂与仙茅的样品溶液各取 200 mL，冷冻干燥，
3 种药材冻干品各称取 1 mg 混匀，加 3 mL 生理盐
水溶解，用作热性对照抗原；按上述方法，将 3 味
寒性中药知母、黄连、黄柏的冻干品各 1 mg 混匀
并用生理盐水充分溶解后，用作寒性对照抗原。
2.3 寒、热性对照抗原多克隆抗体的制备 取 1
mL 热性对照抗原溶液，用等量的完全弗氏佐剂充
分混匀乳化，于新西兰大耳白兔背部皮下多点注
射，2 mL/只，每 10 d 加强免疫 1 次，加强免疫以
不完全弗氏佐剂取代完全弗氏佐剂，剂量与初次免
疫相同。4 次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间
接 ELISA 法快速测定抗血清效价[1]，待效价达到要
求后，心脏放血获得热性对照抗原的抗血清，4 ℃
保存备用。同法制备寒性对照抗原的抗血清。
2.4 斑点免疫印迹 基于寒、热性对照抗原多克隆
抗体对不同寒、热性药材中相同、相近或相似的抗
原物质的免疫识别作用，以兔抗对照抗原多克隆抗
体为一抗，与 9 味中药的提取物在硝酸纤维素膜上
作免疫杂交，经 HRP 标记二抗催化底物 ECL 显色，
应用 Quantity one 软件对杂交斑点作定量分析。
参考文献[2]，各取 50 μL 的对照抗原溶液与 9
味中药的提取液分别滴加到硝酸纤维素膜上，用 5
%脱脂奶粉（安怡高钙脱脂奶粉, 新西兰）封闭 2 h
后，室温下先用对照抗原多克隆抗体（1∶1 000 稀
释）孵育 2 h，PBS-T（磷酸盐-山梨醇甲酯溶液）
洗膜 1 h，再用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG
二抗（1∶2 000 稀释）孵育 1 h，PBS-T 洗膜 30 min
后，按Amersham公司试剂盒说明书进行ECL显影。
免疫杂交斑点应用 Quantity One 软件作定量分析，
分析方法采用轨迹定量法，背景排除 Rolling Disk
Size 值设为 10。
各药材与寒、热性对照抗原之间物质基础的相
似度，等于各抗原斑点印迹信号与寒、热性对照抗
原的印迹信号的百分比。相似度（%）=样品印迹信
号/对照抗原印迹信号×100%。
2.5 统计分析 各项数据以 ±x s 表示，采用 SPSS
13.0 统计软件对实验结果作 LSD 检验。
2.6 精密度试验 取干姜与黄连样品溶液各 50
μL，点加到硝酸纤维素膜上，分别与热性对照抗原
多克隆抗体和寒性对照抗原多克隆抗体作斑点免
疫印迹，每组重复 5 次；应用轨迹定量法测定杂交
斑点的轨迹信号，计算得干姜的免疫印迹信号 RSD
1.7 %，黄连的 RSD 1.2%，表明实验精密度良好。
2.7 稳定性试验 取干姜与黄连样品溶液各 50
μL，点加到硝酸纤维素膜上，每组重复 5 次，分别
于 0, 2, 4, 6, 8 h 后与对照抗原抗体作免疫杂交，对
杂交信号作轨迹定量扫描分析，计算得干姜的印迹
信号 RSD 2.9 %，黄连的 RSD 2.3 %，表明干姜与
黄连样品溶液在 8 h 内是稳定的，实验方法的稳定
性良好。
2.8 重现性试验 称取干姜、黄连各 5 份，每份
20 g，制备样品溶液，各取 50 μL 点加到硝酸纤维
素膜上，与对照抗原抗体作斑点免疫印迹，杂交信
号作轨迹定量分析，计算得干姜的免疫印记信号
RSD 3.1 %，黄连的 RSD 4.1 %，表明实验方法的重
现性良好。
3 结果
3.1 样品测定 结果表明（图 1），9 味药材与热性对
照抗原多抗的印迹斑点存在明显差异；定量扫描分析
结果表明，9 味药材与热性对照抗原多抗的印迹信号
大小顺序为：干姜、附子、杜仲、秦皮、金银花、知
母、黄连、大黄、黄柏。9 味药材与寒性对照抗原多
抗的印迹斑点也存在明显差异(图 2)；定量扫描分析
结果表明，9 味药材与寒性对照抗原多抗的印迹信号
大小顺序为：大黄、知母、黄连、黄柏、干姜、金银
花、秦皮、杜仲、附子。9 味药材与对照抗原的印迹
信号相似度值见表 1。


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1~10. 热性对照抗原、干姜、秦皮、杜仲、黄连、黄柏、
大黄、金银花、附子、知母。
图1 9味中药水提物与热性对照抗原多克隆抗体的
免疫印迹斑点的反相图谱

1~10. 寒性对照抗原、黄连、大黄、干姜、秦皮、
知母、杜仲、金银花、黄柏、附子。
图 2 9 味中药水提物与寒性对照抗原多克隆抗体的
免疫印迹斑点的反相图谱

表 1 9 味中药的斑点免疫印迹信号与对照抗原之间的相似度检测( ±x s )
寒性对照抗原 热性对照抗原
药材
峰值 /Int 相似度/% 峰值/Int 相似度/%
对照抗原 201.0±7.55 100.00±3.76 101.00±3.59 100.00±3.56
干姜 60.9±10.67 30.30±5.31 57.90±3.63 57.33±3.6
附子 30.5±10.00 15.17±4.96 44.00±4.70 43.56±4.65
杜仲 40.9±10.40 20.35±5.18 34.50±5.73 34.16±5.67
秦皮 49.2±11.51 24.48±5.72 30.50±4.72 30.20±4.67
金银花 48.9±9.03 24.33±4.49 29.10±5.48 28.81±5.42
知母 93.9±12.47 46.72±6.21 26.80±6.81 26.53±6.74
黄连 111.0±11.96 55.22±5.95 21.90±6.17 21.68±6.10
大黄 109.0±10.71 54.23±5.33 17.80±4.65 17.62±4.61
黄柏 68.5±8.74 34.08±4.34 15.00±6.49 14.85±6.43

3.2 LSD 检验 与寒性对照抗原多克隆抗体的印
迹信号相似度的 LSD 检验结果可见，黄连与大黄之
间无显著性差异，与其他药味差异极显著；知母与
其他药味差异极显著；干姜、黄柏之间无显著差异，
与其他药味差异显著或极显著；秦皮、金银花与杜
仲之间无显著差异，与其他药味差异显著或极显
著；附子与杜仲差异显著，与其他药味差异极显著
（表 2）。与热性对照抗原多克隆抗体的印迹信号相
似度的结果可见，干姜、附子分别与其他药味之间
差异极显著；杜仲与秦皮无显著差异，与金银花差
异显著，与其他药味差异极显著；秦皮与杜仲、金
银花、知母之间无显著差异，与其他药味差异极显
著；金银花与秦皮、知母无显著差异，与杜仲、黄
连差异显著，与其他药味差异极显著；知母与秦皮、
金银花、黄连无显著差异，与其他药味差异显著或
极显著；黄连与知母、大黄无显著差异，与金银花、
黄柏差异显著，与其他药味差异极显著；大黄与黄
连、黄柏无显著差异，与其他药味差异极显著；黄
柏与大黄无显著差异，与黄连差异显著，与其他药
味差异极显著（表 3）。
表 2 9 味中药与寒性对照抗原多克隆抗体的印迹信号相似度的 LSD 检验
药材 黄连 大黄 知母 黄柏 干姜 秦皮 金银花 杜仲 附子
黄连 0 –0.99 –8.52) –21.142) –24.922) –30.742) –30.892) –34.872) –40.052)
大黄 0.99 0 –7.512) –20.152) –23.932) –29.752) –29.92) –33.882) –39.062)
知母 8.52） 7.512） 0 –12.642) –16.422) –22.242) –22.392) –26.372) –31.552)
黄柏 21.142） 20.152） 12.642) 0 –3.78 –9.62) –9.752) –13.732) –18.912)
干姜 24.922） 23.932） 16.422) 3.78 0 –5.821) –5.971) –9.952) –15.132)
秦皮 30.742） 29.752） 22.242) 9.62) 5.821) 0 –0.15 –4.13 –9.312)
金银花 30.892） 29.92） 22.392) 9.752) 5.971) 0.15 0 –3.98 –9.162)
杜仲 34.872） 33.882） 26.372) 13.732) 9.952) 4.13 3.98 0 –5.181)
附子 40.052） 39.062） 31.552） 18.912) 15.132) 9.312) 9.162) 5.181) 0
注：1)P<0.05，2)P<0.01（表 3 同）。


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表 3 9 味中药与热性对照抗原多克隆抗体的免疫印迹信号相似度的 LSD 检验
药材 干姜 附子 杜仲 秦皮 金银花 知母 黄连 大黄 黄柏
干姜 0 –13.772) –23.172) –27.132) –28.522) –30.82) –35.652) –39.712) –42.482)
附子 13.772) 0 –9.42) –13.362) –14.752) –17.032) –21.882) –25.942) –28.712)
杜仲 23.172) 9.42) 0 –3.96 –5.351) –7.631) –12.482) –16.542) –19.312)
秦皮 27.132) 13.362) 3.96 0 –1.39 –3.67 –8.522) –12.582) –15.352)
金银花 28.522) 14.752) 5.351) 1.39 0 –2.28 –7.131) –11.192) –13.962)
知母 30.82) 17.032) 7.631) 3.67 2.28 0 –4.85 –8.912) –11.682)
黄连 35.652) 21.882) 12.482) 8.522) 7.131) 4.85 0 –4.06 –6.831)
大黄 39.712) 25.942) 16.542) 12.582) 11.192) 8.912) 4.06 0 –2.77
黄柏 42.482) 28.712) 19.312) 15.352) 13.962) 11.682) 6.831) 2.77 0

3.3 Wistar’s Method聚类分析 以表1中9味中药与
寒、热性对照抗原的免疫印迹信号相似度为聚类变
量，作 Wistar’s Method 聚类分析。由图 3 可见：9 味
中药被聚为 2 大类，一大类为：黄柏、知母、黄连、
大黄，全部为经典的寒性中药，分别与寒性对照抗原
的距离依次增大，该大类与寒性对照抗原之间的平均
距离小；另一大类为：干姜、附子、杜仲、秦皮、金
银花，分别与热性对照抗原的距离依次增加，该大类
与热性对照抗原之间的平均距离小，其中，干姜与附
子为经典的热性中药，杜仲药性温，寒性的秦皮与金
银花 2 味中药在-6~0 水平上被聚为该大类中的小类，
与热性对照抗原的距离最大。

1~9. 干姜、附子、杜仲、秦皮、金银花、知母、
黄连、大黄、黄柏。
图 3 9 味中药对寒、热性对照抗原多克隆抗体的
免疫印迹信号相似度的聚类分析(Wistar’s method)

4 讨论
干姜、附子性热，杜仲性温，其余 6 味中药性
寒。干姜、附子、杜仲、秦皮、金银花、知母、黄
连、大黄、黄柏与热性对照抗原的印迹信号的相似
度依次下降，总体上与 9 味中药药性变化规律相吻
合，依据药性由热转寒而印迹信号减弱。由此可以
推断，秦皮、金银花、知母、黄连、大黄、黄柏 6
味寒性中药的寒性程度是依次增强的。大黄、知母、
黄连、黄柏、干姜、金银花、秦皮、杜仲、附子与
寒性对照抗原的免疫印迹信号相似度依次下降，药
性变化的总体趋势也基本与免疫印迹信号变化规
律一致。9 味中药与寒、热性对照抗原的免疫印迹
结果经 Wistar’s Method 聚类分析，聚为由黄连、黄
柏、大黄、知母组成的寒性大类和以附子、干姜、
杜仲为代表的热性大类。综合以上分析，可以推断：
中药药性的抗原性物质基础存在一定的规律性，相
同药性的中药在某种程度上可能存在着相同、相
近，或者相似的抗原性物质构成。
尽管 9 味中药与寒、热性对照抗原的免疫印迹
结果总体上符合药性变化规律，但存在例外：干姜
与寒性对照抗原的印迹信号强于金银花与秦皮；寒
性中药秦皮与金银花在聚类分析中被聚到温、热性
药物的大类中。推测其原因有以下 5 点：①药材本
身的理化特性。如黄柏的黏液细胞发达，水提液黏
度大，可影响与对照抗原多抗的免疫杂交，进而影
响聚类分析的结果与结论。②构成对照抗原的经典
寒、热性药味较少，还不足以代表大多数寒、热性
药物的通用组分，增加构成对照抗原的经典寒、热
性药物的味数，可使实验结果更具有代表性。③中
药药性是中药本质属性的主观反映，这一主观反映
允许中药的实验检测药性可以与历史文献存在分
歧。④斑点免疫印迹法无法体现不同药味间所含微
量元素和一些低抗原性小分子物质的差异。⑤金银
花与秦皮的药性可能介于寒性与温性之间，是寒性
中的偏温性的一类中药，且受聚类方法分辨率的影
响，使得聚类结果与实际药性不符。
总之，尽管斑点免疫印迹法应用于中药药性物
质基础的研究还存在一定局限性，但该方法对于平
行比较不同性味中药之间主要物质构成及其空间


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结构的差异，不失是一种实用、有效的新方法，可
应用于临床中药药性检测试剂盒的研发。
[参考文献]
[1] 印莉萍, 刘祥林. 分子细胞生物学实验技术[M]. 北京: 首都师范
大学出版社, 2001: 224.
[2] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning:A
LaboratoryManual[M]. 2nd ed. NewYork: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989: 924.


Research on medical speciality of traditional Chinese medicines using
dot-immunoblotting method based on polyclonal antibody prepared from
traditional Chinese medicines with hot / cold nature

WANG Houwei*，DOU Yanling，TIAN Jingzhen，LI Feng，WANG Shijun，WANG Zhenguo*
（College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China）

[Abstract] Objective: To research on the substantial foundation of the medical speciality of Chinese traditional medicines
from immunogenicity. Method: Control antigen with hot nature was prepared from the mixture of the aqueous extracts of three
Chinese traditional medicines with three typical hot nature of Alpinia officinarum, Cinnamomum cassia and Curculigo orchioides,
while that with cold nature prepared with Rheum palmatum，Anemarrhena asphodeloides, Coptis chinensis, and polyclonal antibody
was prepared by immunizing rabbit with control antigen. Dot blotting was performed between the polyclonal antibody of control
antigen and the aqueous extracts of nine Chinese traditional medicines on a piece of PVDF membrane, and the blotting signals were
analyzed by the software of Quantity One. Result: Blotting signals with hot control antigen of nine Chinese traditional medicines in
descending were Zingiber officinale, Aconitum carmichaeli，Eucommia ulmoides, Fraxinus rhynchophylla, Lonicera japonica,
Anemarrhena asphodeloides, Coptis chinensis, Rheum palmatum and Phellodendron chinense, which degree of similarity to control
antigen in peak value were 57.33 %,43.56 %, 34.16 %,30.2 %, 28.81 %, 26.53 %,21.68 %, 17.62 % and 14.85 %, respectively.
Blotting signals with cold control antigen were Rheum palmatum, Anemarrhena asphodeloides, Coptis chinensis, Phellodendron
chinense, Zingiber officinale, Lonicera japonica, Fraxinus rhynchophylla, Eucommia ulmoides and Aconitum carmichaeli in
descending, of which degree of similarity to cold control antigen in peak value were 55.22 %, 54.23 %, 46.72 %, 34.08 %, 30.3 %,
24.48 %, 24.33 %, 20.35 % and 15.17 %, respectively. Results of cluster analysis with Wistar’s method showed that nine medicines
were classified into two groups, one group included Phellodendron chinense, Anemarrhena asphodeloides, Coptis chinensis, Rheum
palmatum, another was Zingiber officinale, Aconitum carmichaeli, Eucommia ulmoides, Fraxinus rhynchophylla, Lonicera japonica.
Conclusion: Blotting signals of nine medicines with control antigen regularly varied with the alteration of medicine nature. The
more similarity degree of the tested medicine to control antigen was smaller, the more distance of the tested medicine to control
antigen was further. Dot immunoblotting was a practical and effective new method in researching the substantial foundation of the
medical speciality of Chinese traditional medicines.
[Key words] traditional Chinese medicine with hot/cold nature; polyclonal antibody; dot immunoblotting.
[责任编辑 古云侠]