全 文 ：活血化瘀方对 ＡＤＰ诱导的家兔血小板聚集和
凝血酶时间的影响及量效关系研究
张彦华，唐于平，郭建明，丁安伟，段金廒
（南京中医药大学 江苏省方剂研究重点实验室，江苏 南京 ２１００４６）
［摘要］　目的：探讨５个活血化瘀方（血府逐瘀汤、少腹逐瘀汤、膈下逐瘀汤、身痛逐瘀汤、通窍活血汤）对家兔血小板聚
集及凝血酶时间的作用及其量效关系。方法：采用比浊法测定ＡＤＰ诱导家兔血小板聚集率和凝血酶时间（ＴＴ）法测定家兔血
浆凝血时间。结果：活血化瘀方能显著抑制ＡＤＰ诱导的家兔血小板聚集、延长凝血时间，５个方剂醇沉上清液部位抗血小板
聚集效果比其全方和醇沉沉淀部位效果好（Ｐ＜００１），其中少腹逐瘀汤和膈下逐瘀汤醇沉上清液部位抗血小板聚集效果比其
他方剂好，而在延长家兔血浆凝血时间方面全方效果最好（Ｐ＜００１），醇沉上清液部位效果最差。结论：５个活血化瘀方对
ＡＤＰ诱导血小板聚集和凝血酶时间均有显著影响，且不同部位样品侧重的药效强弱不同。通过本实验研究为进一步的方剂
活血化瘀整体评价奠定了基础，为中医临床治疗心脑血管疾病提供了科学依据。
［关键词］　活血化瘀方；血小板聚集；ＡＤＰ；凝血酶时间
［收稿日期］　２００９０６１５
［基金项目］　江苏高校自然科学重大基础研究项目（０６ＫＪＡ３６０２２，
０７ＫＪＡ３６０２４）
［通信作者］　唐于平，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｐｉｎｇｔａｎｇ＠ｎｊｕｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ；丁安
伟，Ｅｍａｉｌ：ｌｔｃｍｆ＠ｎｊｕｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　活血化瘀方上千种，尤其以王清任的活血化瘀
医方最为常用。其治疗“胸中血府血瘀”的血府逐
瘀汤、治疗“瘀血阻于少腹”的少腹逐瘀汤、治疗“肚
腹血瘀”的膈下逐瘀汤、治疗“久痹有瘀血”的身痛
逐瘀汤、治疗“头面四肢周身血管血瘀”的通窍活血
汤，组成了以活血化瘀为主要立方原则的活血化瘀
系列方剂，形成了《医林改错》活血化瘀法临床应用
的完整体系［１］。活血化瘀类方药具有改善心脑血
管功能、血小板及凝血系统功能、微循环等生理功
能，抗心肌缺血、脑缺血，抑制血小板聚集，抗凝、抗
血栓形成等［２］。
本研究采用体外 ＡＤＰ诱导家兔血小板聚集的
检测方法和体外家兔血浆凝血酶时间的检测方法分
别对５个活血化瘀方的抗血小板聚集作用和抗凝血
作用进行初步研究，为活血化瘀方的临床应用提供
进一步的药理学实验依据。
１　材料
１．１　动物　新西兰家兔，体重２０～２５ｋｇ，雌雄均
用，１１只雄性，１只雌性。由南京江宁县汤山青龙山
动物繁殖场提供，实验动物生产许可证：ＳＣＸＫ（苏）
２００７０００８。
１．２　仪器　ＬＧＰＡＢＥＲＩ型血小板聚集凝血因子分
析仪（北京世帝科学仪器公司）；Ａｎｋｅ（ＬＸＪ１１Ｂ）离
心机（上海安寿科学仪器厂）；ＡＹ１２０型电子天平
（赛多利斯科学仪器有限公司）。
１．３　药品和试剂　ＡＤＰ（北京中勤世帝科学仪器公
司，ＡＤＰ粉剂：１瓶，ＡＤＰ缓冲液：１０ｍＬ／瓶）；凝血
酶（希森三和集团生物制品有限公司，批号
２００８０８１６）；三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ碱，南京生兴生
物技术有限公司，批号８Ｄ０９８Ｉ２３）；枸橼酸钠（南京
化学试剂有限公司，批号０５０５８００５２）。活血化瘀方
组方药材桃仁、红花、当归、生地、赤芍、川芎、柴胡、
枳壳、桔梗、牛膝、甘草、小茴香（炒）、干姜（炒）、延
胡索、没药、官桂、蒲黄、五灵脂（炒）、丹皮、乌药、香
附、枳壳、秦艽、羌活、地龙（去土）、麝香、生姜、大
枣，均购自安徽丰原铜陵中药饮片公司，经南京中医
药大学中药鉴定教研室乐巍博士鉴定，符合《中国
药典》２００５年版项下标准。
１．４　受试药物的制备　称取血府逐瘀汤组方药材
（桃仁红花当归生地黄川芎赤芍牛膝桔梗柴
胡枳壳甘草＝１２∶９∶９∶９∶５∶６∶９∶５∶３∶６∶３）６０８ｋｇ，
少腹逐瘀汤组方药材［小茴香（炒）干姜（炒）延胡
索没药当归川芎官桂赤芍蒲黄五灵脂（炒）＝
１５∶３∶３∶３∶９∶３∶３∶６∶９∶６］３２６ｋｇ，膈下逐瘀汤组方
药材［五灵脂（炒）当归川芎桃仁（研泥）丹皮赤
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芍乌药延胡索甘草香附红花枳壳＝６∶９∶６∶９∶６∶
６∶６∶３∶９∶５∶９∶５］３１６ｋｇ，身痛逐瘀汤组方药材［秦
艽川芎桃仁红花甘草羌活没药当归五灵脂
（炒）香附牛膝地龙（去土）＝３∶６∶９∶９∶６∶３∶６∶９∶６
∶３∶６∶６］２８８ｋｇ，这４个组方药材分别水提２次，第
１次加１０倍量，煎煮２ｈ，第２次加８倍量，再煎煮２
ｈ；通窍活血汤组方药材［赤芍桃仁（研泥）川芎红
花老葱生姜（切片）大枣（去核）麝香（绢包）＝３
∶９∶３∶９∶６∶９∶１２∶０１５］３１１ｋｇ，用２０％的乙醇提取，
第１次加１０倍量，煎煮２ｈ，第２次加８倍量，再煎
煮２ｈ。各方煎出液合并后浓缩，浓缩液加入乙醇至
含醇量为８０％，搅匀，放置过夜，过滤沉淀，上清液
浓缩得干浸膏。每个组方制得３个样品，分别为全
方，醇沉上清液，醇沉沉淀。精密称定各样品，前４
个方用 ５％的 ＤＭＳＯ溶解，通窍活血汤用 １０％的
ＤＭＳＯ溶解，配制成最高浓度为０７００００ｇ生药／ｍＬ
的受试品溶液，离心，吸取上清液，稀释成浓度为
０３５０００，０１７５００，００８７５０，００４３７５ｇ生药／ｍＬ４
个浓度。稀释所用的溶液为溶解样品的溶液。
２　方法
２．１　家兔体外血小板聚集的检测方法　新西兰大
耳白兔，雄性，１０只，禁食８ｈ后，戊巴比妥钠麻醉，
颈动脉插管放血，按枸橼酸钠（３８％）１∶９抗凝，以
８００ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０ｍｉｎ，取上层富血小板血浆
（ＰＲＰ），剩余部分以３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，取
贫血小板血浆（ＰＰＰ）。测试杯通道加入搅拌珠，加
受试药物１０μＬ，再加２５０μＬＰＲＰ。对照组加入等
量溶解样品溶液，温育３ｍｉｎ，放入测试通道，加１０
μＬＡＤＰ诱导剂，终浓度为 ５μｍｏｌ·Ｌ－１。用 ＰＰＰ
（加入与待测样本相同的药物１０μＬ，消除药物自身
颜色影响）调零，对照组加入等量的溶解样品溶液，
用ＬＧＰＡＢＥＲＩ型血小板聚集凝血因子分析仪测定
血小板６ｍｉｎ内的最大聚集率，并按下述公式计算
药物对血小板聚集的抑制率。
　　血小板聚集抑制率（％）＝
对照组最大聚集率－给药组最大聚集率
对照组最大聚集率 ×１００％
２．２　家兔体外血浆凝血酶时间的检测方法　取新
西兰大耳白兔，雌雄均可，２只，雌雄各半，禁食８ｈ
后，戊巴比妥钠麻醉，颈动脉插管放血，按枸橼酸钠
（３８％）１∶９抗凝，以３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，吸
取上层，制备待测血浆。在测试杯每个通道中加入
搅拌珠，加１０μＬ不同浓度的药物，再加待测血浆
５０μＬ，３７℃预温３ｍｉｎ后，加入０１ｍｏｌ·Ｌ－１ｐＨ
７４ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液稀释的１５Ｕ·ｍＬ－１凝血酶溶液
５０μＬ，对照组加入等量的溶解样品的溶液。用 ＬＧ
ＰＡＢＥＲＩ型血小板聚集凝血因子分析仪测定凝血时
间，并按下述公式计算药物对血浆凝血时间延长率。
　　凝血时间延长率（％）＝
给药组凝血时间－对照组凝血时间
对照组凝血时间 ×１００％
２．３　统计分析　实验数据统计采用 ＳＰＳＳ１１５软
件中的 ｏｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ完成，与空白组比较采用
Ｄｕｎｎｅｔ检验，两两比较采用ＬＳＤ法。
３　结果
３．１　体外抗家兔血小板聚集作用　活血化瘀方提
取物体外实验对 ＡＤＰ诱导的家兔血小板聚集均有
不同程度的影响。
活血化瘀方的醇沉上清液部位抗血小板聚集效
果总体优于全方和醇沉沉淀部位，各方剂有显著差
异（Ｐ＜００１）的浓度见图１。醇沉上清液部位中，除
少腹逐瘀汤和膈下逐瘀汤最高浓度效果与身痛逐瘀
汤最高浓度无显著差异外，此两方剂其他浓度效果
均优于其他方剂（Ｐ＜００１），少腹逐瘀汤和膈下逐
瘀汤比较效果无显著差异（Ｐ＞００５），该部位各方
具有明显量效关系（图２）。全方中，通窍活血汤对
血小板聚集有促进作用，其他４张方对血小板聚集
均有不同的抑制作用，除少腹逐瘀汤外，均显示具有
明显的量效关系（图１）。醇沉沉淀部位中，少腹逐
瘀汤和膈下逐瘀汤有抑制血小板聚集的作用，其他
３张方醇沉沉淀部位都显示有一定的促进血小板聚
集作用，但没有明显的量效关系（图１）。
３．２　体外延长家兔血浆凝血酶时间作用　活血化
瘀方各样品体外实验对凝血酶时间都有不同的延长
作用。全方延长家兔血浆凝血酶时间作用总体优于
醇沉上清液和醇沉沉淀部位，各方剂有显著差异
（Ｐ＜００１）的浓度见图３，除通窍活血汤外均显示具
有明显的量效关系（图３）。除通窍活血汤外，其他４
张方沉淀部位抗凝血效果均优于醇沉上清液部位
（图３）。５张活血化瘀方全方提取物不同浓度的延
长凝血时间效应进行比较，结果显示血府逐瘀汤和
身痛逐瘀汤高浓度样品抗凝血效应比其他方好，而
低浓度样品少腹逐瘀汤比其他方好，其中通窍活血
汤在各浓度下抗凝血效果最差（图４）。
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ＸＦ．血府逐瘀汤；ＳＦ．少腹逐瘀汤；ＧＸ．膈下逐瘀汤；ＳＴ．身痛逐瘀汤；ＴＱ．通窍活血汤（图２～４同）；
在该浓度下醇沉上清液与其他样品比较Ｐ＜００１。
图１　５张活血化瘀方对血小板聚集抑制作用的量效曲线（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
在该浓度下ＳＦ，ＧＸ与其他样品比较Ｐ＜００１。
图２　５张活血化瘀方醇沉上清液对血小板聚集抑制
作用的量效曲线比较（珋ｘ，ｎ＝４）
４　讨论
活血化瘀方可局部应用或口服，近年来静脉滴
注治疗血瘀性心脑血管疾病应用较多。此外，活血
化瘀疗法在治疗肿瘤［３］、眼科血证、妇科疾病［４］、类
风湿性关节炎、慢性肾炎、肝炎以及骨科等方面均有
应用［２］，而且这些疾病大部分伴有止凝血系统和血
小板功能的改变［５９］，本实验以血小板聚集和凝血酶
时间作为指标比较了清代王清任的５首经典活血化
瘀方剂在抗血小板聚集和抗凝血方面的作用。
研究结果表明５首活血化瘀方对血小板聚集和
凝血时间都有显著影响。在抗血小板聚集方面，各
方的醇沉上清液部位效果好于全方，并显示具有明
显差异（Ｐ＜００１）。除少腹逐瘀汤和膈下逐瘀汤醇
沉淀部位有抗血小板聚集作用外，其他３张方的醇
沉沉淀部位却显示有促进血小板聚集作用（Ｐ＜
００１）。
从图２可以看出少腹逐瘀汤和膈下逐瘀汤醇沉
上清液部位比其他方剂抑制血小板聚集效果好，对
每张方每克生药量所含的当归、川芎的量进行比较，
结果显示，少腹逐瘀汤＞膈下逐瘀汤＞血府逐瘀汤＞
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在该浓度下全方与其他样品比较Ｐ＜００１。
图３　５张活血化瘀方对凝血酶时间延长作用的量效曲线（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
图４　５张活血化瘀方全方对凝血酶时间延长作用的
量效曲线比较（珋ｘ，ｎ＝４）
身痛逐瘀汤＞通窍活血汤，和少腹逐瘀汤、膈下逐瘀
汤抑制血小板聚集效果较其他方剂好结果一致，对
血府逐瘀汤、少腹逐瘀汤、身痛逐瘀汤和膈下逐瘀汤
方剂醇沉上清样品每克生药量所含６个芳香酸类成
分含量进行比较［１０］，结果显示，膈下逐瘀汤 ＞少腹
逐瘀汤＞身痛逐瘀汤 ＞血府逐瘀汤，与抗血小板聚
集效应强弱趋势基本一致，说明活血化瘀方中芳香
酸类成分对抗血小板聚集效应可能具有相当大的贡
献。此外通过分析方剂药味组成还发现，５张活血
化瘀方中，只有少腹逐瘀汤和膈下逐瘀汤中含有中
药延胡索。延胡索按功能分类，属于活血化瘀药中
的活血止痛药，延胡索主要活性成分为原小檗碱类、
阿朴啡类、原阿片碱类、异喹啉类等生物碱，具有很
强的镇痛、镇静、降压和抗心律失常作用。目前，很
多新的研究表明，延胡索还具有其他广泛的生理活
性，如抗心肌缺血、抗实验性胃溃疡、抗肿瘤、抗氧
化、保肝［１１］等，曾有报道延胡索乙素体外具有抗血
小板聚集的作用［１２］，５张方的差异是否与含延胡索
有关，有待进一步探究。
有文献报道体外给药做血小板聚集实验温育时
间为５ｍｉｎ［１３］，也有文献报道温育时间为３ｍｉｎ［１４］，
仪器使用说明采用温育１ｍｉｎ，为找出最佳温育时
间，本实验比较了温育１，３，５ｍｉｎ对血小板聚集的
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影响（ｎ＝８），对照组与给药组对应温育相同时间。
结果显示，温育３ｍｉｎ血小板聚集抑制率最大，温育
１ｍｉｎ计算所得血小板聚集抑制率与温育３，５ｍｉｎ
有显著差异（Ｐ＜００１），温育３ｍｉｎ与５ｍｉｎ无显著
差异（Ｐ＞００５）。故选择温育３ｍｉｎ为血小板聚集
实验的温育时间。
抗凝血实验一般采用实验动物灌药后取血，
体外检测抗凝血效果［１５］。本实验采用体外给药大
批量筛选活血化瘀方样品的抗凝血活性，但一般
凝血４项试剂盒做体外给药实验，试验结果不稳
定，差异较大。本实验采用牛凝血酶，自配 Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ缓冲液稀释凝血酶，做凝血酶时间（ＴＴ）测定。
空白组凝血时间控制在１１～１５ｓ，实验结果稳定性
好，４个通道数据离散性小，是较理想的大批量筛
选抗凝血药的试剂。仪器使用说明采用温育 ３
ｍｉｎ，为验证温育时间是否对结果有影响，比较了
温育３，６，９ｍｉｎ对凝血时间的影响（ｎ＝８），对照
组与给药组对应温育相同时间。结果显示不同温
育时间凝血延长率３ｍｉｎ＞６ｍｉｎ＞９ｍｉｎ，但差异
无显著性意义（Ｐ＞００５），故选择３ｍｉｎ为抗凝血
实验的温育时间。
文献表明有可能诱聚剂 ＡＤＰ与血小板表面
Ｐ２ｘ１，Ｐ２ｙ１，Ｐ２ＴＡＣ３种亚型的受体结合后，通过 Ｇｉ
和Ｇｑ信号通路激活血小板纤维蛋白原受体，引起
血小板聚集，同时还促进血小板内致密颗粒释放
ＡＤＰ等促聚因子，通过正反馈机制放大了血小板的
聚集反应［１６］。
ＴＴ用于检测血液循环中是否存在过量抗凝血
物质［１７］。抗凝作用是活血化瘀类中药的重要表现
之一。药物抗凝作用，可能是由于药物对凝血酶有
抑制作用，使纤维蛋白原不能形成不可逆的、牢固
的、不可溶的凝块，或由于纤维蛋白溶解系统的增加
所致。国外学者研究证实，纤维蛋白原ＰＦｉｇ含量与
血小板聚集功能呈高度正相关［１８］。
本实验通过对体外给药的抗血小板聚集与抗凝
血作用的研究，比较评价各方活血化瘀作用的强弱，
为进一步的方剂活血化瘀整体评价奠定了基础。
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Ｂｏｒｎ＇ｓｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｒｏｍｂｉｎｔｉｍｅ（ＴＴ）ｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｌｏｔｉｎｇｔｉｍｅ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｆｏｒｍｕｌａｆｏｒｐｒｏｍｏｔｉｎｇｂｌｏｏｄ
ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｔｏｒｅｍｏｖｅｓｔａｓｉｓｓｈｏｗｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｐｌａｔｅｌｅｔａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｌｏｎｇｅｄｃｌｏｔｉｎｇｔｉｍｅ，ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔｅｏｆ
８０％ ａｌｃｏｈｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈｅｍｏｓｔｐｏｔｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙａｍｏｎｇｔｈｅｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｏｎｅｆｏｒｍｕｌａ（Ｐ＜００１），ｅｓｐｅ
ｃｉａｌｙｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔｅｏｆＳｈａｏｆｕｚｈｕｙｕＤｅｃｏｃｔｉｏｎａｎｄＧｅｘｉａｚｈｕｙｕＤｅｃｏｃｔｉｏｎｗｅｒｅｂｅｔｅｒｔｈａｎｏｔｈｅｒｆｏｒｍｕｌａｏｎｐｌａｔｅｌｅｔａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ａｂｏｕｔ
ｔｈｅａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ，ｔｈｅｗｈｏｌｅｆｏｒｍｕｌａｓｈｏｗｅｄｔｈｅｅｖｉｄｅｎｔｌｙｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇｔｈｅｃｌｏｔｉｎｇｔｉｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｔｗｏｆｒａｃｔｉｏｎｓ（Ｐ＜００１）ａｎｄｔｈｅｐｒｅ
ｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｔｈｅｗｏｒｓｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｆｏｒｍｕｌａｆｏｒｐｒｏｍｏｔｉｎｇｂｌｏｏｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｔｏｒｅｍｏｖｅｓｔａｓｉｓｓｈｏｗｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｅｃｔｏｎｐｌａｔｅｌｅｔ
ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｃｌｏｔｉｎｇｔｉｍｅ，ａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｓａｍｐｌｅｓｏｆｔｈｅｆｏｒｍｕｌａｈａｄｄｉｆｅｒｅｎｔｅｆｉｃａｃｙ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒ
ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｆｏｒｍｕｌａｅａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒａｎｄｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｆｏｒｍｕｌａｅｆｏｒｐｒｏｍｏｔｉｎｇｂｌｏｏｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｔｏｒｅｍｏｖｅｓｔａｓｉｓ；ｐｌａｔｅｌｅｔａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ；ＡＤＰ；ＴＴ
［责任编辑　张宁宁］
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第３４卷第２１期
２００９年１１月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　２１
　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００９