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Vol.34，Issue 4
February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
用抑制性差减杂交构建 As2O3诱导的 NB4
细胞凋亡相关基因文库
狄春红 1，2， 顾少华 4， 谭晓华 2， 仙玲玲 2， 吴奇涵 3， 杨 磊 2*
（1.石河子大学 医学院 第一附属医院 医学实验室，新疆 石河子 832008；
2.石河子大学 新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002；
3.华东师范大学 生命科学学院，上海 200062；
4.复旦大学 生命科学学院 遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海 200433）
[摘要] 目的： 构建三氧化二砷（As2O3）诱导的急性早幼粒细胞白血病细胞株 NB4 细胞凋亡相关基因文库。方法：用
含 4 μmol·L-1 As2O3和正常培养基培养 NB4 细胞 24 h，抽提总 RNA，经逆转录酶合成双链 cDNA，分别以砷诱导凋亡组和对
照组作为 tester 和 driver，进行双向抑制性差减杂交（suppress-ion subtractive hybridization，SSH），筛选 As2O3诱导的 NB4
细胞凋亡相关基因，将差异表达基因进行 PCR 扩增并与 pGEM-Teasy 克隆载体连接，转化 DH5α大肠杆菌，经蓝白斑筛选
获得白色阳性克隆，PCR 扩增出未知基因片段。结果： 成功构建了分别代表在 NB4 细胞中表达上调和下调的基因文库。结
论： 经双向抑制性差减杂交获得了 NB4 细胞差异表达基因文库，为克隆 NB4 细胞凋亡相关基因奠定了基础。
[关键词] 白血病；NB4 细胞；三氧化二砷；抑制性差减杂交；凋亡
3中国传统中药 As2O3 治疗白血病疗效显著，其
主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡，在此过程中有多条
基因参与了凋亡过程，目前参与 NB4 细胞凋亡的基
因还未全部明确[1-2]。有研究用基因芯片技术和/或
抑制性差减杂交技术筛选其他白血病细胞株差异
表达基因[3-4]。本课题组前期研究中用 As2O3 诱导
NB4 细胞凋亡并用基因芯片技术筛选了差异表达
基因，为更加全面的筛选 NB4 细胞凋亡相关基因，
本研究用抑制性差减杂交方法进行 NB4 细胞凋亡
基因的筛选，构建差异表达基因文库，为联合用药
提供新的可能药物靶点和研发新的抗肿瘤药提供
基础。
1 材料和方法
1.1 材料 急性粒细胞性白血病细胞株 NB4 细胞
由上海瑞金医院血液学研究所惠赠。E. Coli DH5α
为复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验

[收稿日期] 2008-07-20
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30560129);上海市科委基金项目
(045458032)；石河子大学科研启动基金项目(RCZX200685，ZRKX2008083)
[通信作者] *杨磊，Tel：(0993)2057882，E-mail：yanglei62@yahoo.com
[作者简介] 狄春红，主管检验师，主要从事分子生物学基础研究以及
流式细胞仪的临床检测。E-mail：chunhongdi@163.com
室贮藏。 PCR select cDNA subtraction kit 和
Advantage cDNA PCR kit （美国 Clontech 公司），
三氧化二砷（As2O3，Sigma 公司），Trizol（德国
Invitrogen 公司），Oligotex mRNA Kit （德国
QIAGEN 公司）spGEM-Teasy vector system I （美
国 Promega 公司），ф×174/Hae Ⅲ （MBI），IPTG，
X-Gal（上海生工生物工程技术服务有限公司），Taq
DNA polymerase ， DNA Marker DL2000 ， PCR
Product Purification Kit（宝生物工程大连有限公
司）。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 抽提和 mRNA 纯化 NB4 细胞加
入含和不含 4 μmol·L-1 的 As2O3 培养 24 h，流
式细胞仪检测细胞凋亡率，同时收集细胞迅速加
入 Trizol，采用 Trizol 抽提法提取总 RNA。将 Total
RNA 用 Rnase-free water 溶解至 500 μL，按照
QIAGEN 公司的 Oligotex mRNA Kits 使用说明书
进行 RNA 纯化操作，紫外分光光度计测定浓度和
纯度。
1.2.2 抑制性差减杂交 按 Clonech 公司的抑制性
差减杂交试剂盒说明书推荐条件进行操作。


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双链 cDNA（dscDNA ）合成：取 As2O3 诱导
凋亡的 NB4 细胞（凋亡组）、正常生长的同步对照
细胞（对照组）mRNA 各 2 μL（2 μg）、骨骼肌同
型对照组（c 组） mRNA 2 μL（2 μg） + 2 μL ddH2O，
加入 cDNA 合成引物 1 μL，在 AMV 逆转录酶（20
U·μL-1）及 dNTP 作用下 42 ℃延伸 90 min，冰浴 5
min 后立即加入 DNA 聚合酶 I，RNase H，DNA 连
接酶，dNTP 组成总体积为 80 μL 的反应体系，16 ℃
孵育 2 h 后加入 6 U T4 DNA 聚合酶，16 ℃再反应
30 min，合成 dscDNA。
酶切、接头的连接： 将合成的 dscDNA 纯化，
按 TaKaRa PCR 纯化试剂盒操作，得到 50 μL 纯化
产物。取 43.5 μL 经 15 U RsaⅠ在 37 ℃酶切反应 4
h。凋亡组和对照组各分为 2 组，分别与 adaptor l，
2 （接头 1，2）连接，c 组混入 150 μg·L-1 的 ф×
174/Hae Ⅲ 分别与 adaptor l，2 连接，16 ℃反应 12
h 后进行连接效率检测。
两轮消减杂交及两轮抑制性 PCR： 在鉴定连
接效率满意后，将连接有 adaptor l 和 adaptor 2 的凋
亡组和对照组 dscDNA 各 1.5 μL 分别作 tester，分
别于未加接头的凋亡组和对照组作 driver 1.5 μL，
进行正反向杂交。同型对照组以加接头的 dscDNA
作为 tester，未加接头的骨骼肌 dscDNA 为 driver。
第 1 次差减杂交为 98 ℃变性 8 min，68 ℃杂交 8 h，
立即将 2 组体系混合，另加少量新变性的作为
driver 的 cDNA，68 ℃杂交 12 h 后稀释（1∶100）。
取 1 μL 稀释后的第 2 次杂交后产物，在
50×advantage cDNA polymerase Mix 聚合酶作用下，
以 adaptor 1 及 adaptor 2 的外侧序列的引物 PCR
primer 1，进行第 1 次 PCR 扩增，取第 1 次 PCR 产
物 1 μL，以 adaptor l 及 adaptor 2 的内侧序列巢式引
物 Nested PCR primer 1， Nested PCR primer R，进
行第 2 次 PCR 扩增（未经抑制差减杂交的实验组加
双接头 dscDNA 同时进行 PCR 对照）。
1.2.3 差异基因文库的构建 纯化扩增后差减杂
交产物，操作步骤参照 Promega 产品使用说明书，
与 pGEM®-Teasy vector system I 载体连接 16 12℃
h，取 10 μL 连接产物，加入 100 μL 新制备的感受
态细胞，转化受体菌 E. coli DH5α，加入 50 μL
X-Gal，最后涂布在含有 100 μg·L－1 氨苄青霉素的
LB 平板上。将平板倒置放置在 37 ℃培养箱中过
夜，将长有菌落的平板于 4 ℃放置 4 h，利用 α互
补现象进行蓝白斑筛选，每个文库随机随机挑取
384 个白斑克隆。
2 结果
2.1 RNA 抽提
诱导组得到总 RNA 1.2 mg，测得 A260/A280 为
1.891，同步对照组得到总 RNA1.05 mg，A260/A280
为 1.899。凝胶电泳显示抽提的 RNA 质量较好，无
降解。
2.2 双链 cDNA 用 RsaI 限制性内切酶消化
消化后的 cDNA 经琼脂糖电泳鉴定，双链
cDNA 酶切后变短，大小主要集中在 1 300×103 以
下，表明 cDNA 合成和消化成功。
2.3 接头连接
分别以 As2O3 诱导凋亡组和对照组做 tester，正
向反向差减同时进行。2 组 tester 与接头连接的效率
鉴定见图 1。结果表明接头连接均较好，可进一步
实验。差减杂交后的两轮 PCR 均符合实验要求，差
减杂交后第 2 轮 PCR 结果见图 2。

1～4. 砷诱导组 cDNA 作为 tester；5～8.对照组 cDNA 作为 tester；
9～12. 骨骼肌 Cdna； M. DL2000；
引物 1. 引物 1 和 G3PDH3；引物 2. G3PDH3和 5；
1，5，9. 各组cDNA与接头1连接作模板，引物为引物1；
2，6，10. 各组cDNA与接头1连接作模板，引物为引物2；
3，7，11. 各组 cDNA 与接头 2 连接作模板，引物为引物 1；
4，8，12. 各组 cDNA 与接头 2 连接作模板，引物为引物 2。
图 1 接头连接效率鉴定


1.砷诱导组差减后；2.砷诱导未差减组；3.对照组未差减组；
4.对照组差减后；5.骨骼肌阳性对照未差减；
6.骨骼肌阳性对照差减后；7.试剂盒提供的差减后结果；
M.φ×174 DNA/Hae Ⅲ。
图 2 差减后 PCR 产物分析


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2.4 差减效率验证
G3PDH 是一种在组织中恒量表达的管家基因，
在砷诱导与对照组中应被视为非差异表达基因，经
过差减杂交后其含量应大幅度下降。从差减前后样
品中 PCR 扩增 G3PDH 理想结果是差减后特异性的
G3PDH 条带出现的循环数远大于未差减的。
3 讨论
诱导肿瘤细胞凋亡是 As2O3 治疗肿瘤的主要机
制之一，在细胞凋亡的过程中有多种机制和多条基
因参与了凋亡过程。许多实验已经证实 As2O3对急
性粒细胞白血病有显著疗效，其作用机制主要包括
As2O3 与还原型谷胱甘肽结合促进细胞凋亡[5]；破
坏线粒体跨膜电位和活化 caspase 3 促进细胞凋
亡[6]；以剂量依赖方式使细胞周期阻滞抑制细胞增
殖[7]等，但参与这些作用机制的基因尚不完全明确。
本研究用抑制性差减杂交法筛选 As2O3作用前
后 NB4 细胞差异性表达的基因，寻找凋亡机制和过
程中的主要基因，可以针对这些基因实施联合用
药，提高药物的疗效减少药物毒副作用提供可供选
择的药物靶点。cDNA 差减杂交法的原理是不同条
件下的同一种细胞的基因表达具有差异性，一组细
胞低表达靶序列 mRNA，另一组细胞则正常或高表
达靶序列 mRNA。经逆转录作用合成 cDNA 链，将
含有靶序列的 cDNA 作为 tester，将另一组较少靶
序列的过量的 cDNA 作为 driver，通过两者杂交 d
river 和 tester 中的共同序列被剔除，而差异性表达
的靶序列则得到富集。一般来说，经过 SSH 可将低
丰度差异表达的 cDNA 分子富集 1 000 多倍。1996
年报道的抑制差减杂交法是以抑制 PCR 为基础的
一种改进的 cDNA 差减杂交法，其优点是操作相对
简便、富集效率高、假阳性率低，SSH 已成为克隆
差异表达基因的有力工具[8]。
本课题组前期用细胞凋亡和周期相关的基因
芯片筛选了As2O3诱导诱导NB4细胞凋亡相关的基
因，获得了与 NB4 细胞凋亡相关的一系列基因[9]。
由于芯片技术本身的限制性只能筛选表达量相对
较高的差异基因，且基因芯片上的基因数量有限。
为更加全面的筛选表达较低的基因，在基因芯片筛
选的同时进行了 SSH 技术筛选，本研究成功地构建
了高质量的 As2O3 诱导 NB4 细胞凋亡相关基因
cDNA 差异表达文库，为克隆 NB4 细胞凋亡特异性
基因全长序列奠定了基础，丰富了细胞凋亡机制的
理论研究，同时也可能为肿瘤进行联合用药筛选新
的药物靶点提供基础。
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Construction of subtractive cDNA Library of apoptosis-related genes in
NB4 cells treated by arsenic trioxide

DI Chunhong1，2，GU Shaohua4，TAN Xiaohua2，XIAN Lingling2，WU Qihan3，YANG Lei2*
（1.Medical Laboratory of The First Affiliated Hospital of Medical College，Shihezi University，Shihezi 832008，China；
2. Ministry of Education Key laboratory of Xinjiang Endemic and Ethical Disease，Shihezi University，Shihezi 832002，China；
3. School of Life Science，Easter China University，Shanghai 200062，China；
4. State Key Laboratory of Genetic Engineering，Institute of Genetics，Fudan University，Shanghai 200433，China）

[Abstract] Objective： Construct the gene library of apoptosis related genes in acute promyelocytic leukemia （APL） cell
line NB4 cells treated by arsenic trioxide to clarify the apoptotic mechanism of NB4 cells. Method：APL cell line NB4 cells treated
with or without arsenic trioxide for 24 hours. Total RNA was extracted and suppress subtractive hybridization （SSH） was
conducted according to the manual. With the cDNA of the apoptosis cells as the tester and that of control cells as the driver，forward
and reverse hybridization was performed. Differentially expressed genes were linked with pGEM-Teasy cloning vector and
transformed into E.coli DH5α. The positive clones were screened by blue and white spot. PCR were used to amplify these genes.
Result：The subtractive cDNA libraries related with apoptosis of NB4 cells were successfully constructed. Conclusion：The
constructed subtractive libraries are suitable for further study on the functional genes associated with apoptosis of NB4 cells induced
by arsenic trioxide.
[Key words] leukemia；NB4 cell line；arsenic trioxide；suppress subtractive hybridization；apoptosis
[责任编辑 刘 ]