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Preparation technique of Cremastra appendiculata synthetic seed

杜鹃兰人工种子技术研究



全 文 :杜鹃兰人工种子技术研究
张明生1,2,彭斯文1,杨小蕊1,徐利1
(1.贵州大学 生命科学学院,贵州 贵阳 550025;
2.贵州大学 生命科学实验教学中心,贵州 贵阳 550025)
[摘要] 目的:建立杜鹃兰人工种子制作方法。方法:以杜鹃兰为实验材料,通过液体悬浮培养建立原球茎悬浮系,并以
原球茎为人工种子的繁殖体,研究了人工种皮基质、人工胚乳组分、贮藏条件、萌发基质等对人工种子萌发率和成苗率的影
响。结果:以4%海藻酸钠+2% CaCl2+2%壳聚糖为人工种皮基质,1/2MS液体培养基 +02mg·L
-1NAA+01mg·L-1
GA3+05mg·L
-1BA+04mg·L-1青霉素+100mg·L-1内生真菌提取物+03%多菌灵粉剂+02%苯甲酸钠+10%蔗
糖作为人工胚乳成分制作的人工种子,其萌发率和成苗率最高。这样的人工种子在4℃条件下贮藏20d后的萌发率及成苗
率分别为68%,65%左右,随着贮藏温度的升高和贮藏时间的延长,人工种子的萌发率和成苗率均大幅度下降。结论:通过研
究确立了杜鹃兰人工种子制作基本技术。
[关键词] 杜鹃兰;人工种子;原球茎;萌发率;成苗率
[收稿日期] 20081107
[基金项目] 贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目(黔省专
合字[2005]350号);贵州省优秀青年科技人才培养计划项目(黔科
合人字[2007]06号);贵州大学引进人才科研项目(X060044)
[通信作者] 张明生,博士,教授,主要从事药用植物生物技术研
究和教学。Tel:(0851)3856374,Email:mszhang@gzu.edu.cn
  自植物体细胞胚人工种子(plantsyntheticseed)
的概念[1]提出后,现已发展到运用多种系统包埋种
胚、顶芽、小鳞茎、原球茎等制作人工种子进行快速
繁殖。杜鹃兰 Cremastraappendiculata(D.Don)
Makino为兰科杜鹃兰属的野生珍稀药用及观赏植
物,主要分布于东亚地区,尤以中国的贵州、四川为
多[2]。其药材称毛慈菇,对肿瘤(包括癌症)有很好
的治疗效果[3],近年来市场需求量不断增加。由于
杜鹃兰生境苛刻,自然生长繁殖极其缓慢,加之过度
采挖,已成为濒危植物[4]。利用组织培养技术能在
一定程度上解决快繁问题,但其试管苗生产周期长,
成本高,移栽成活率低,且不便贮藏和运输,从而限制
了杜鹃兰药材的规模化生产。本实验在对杜鹃兰原
球茎质量控制研究的基础上,着重探讨了杜鹃兰人工
种子制作技术,以及人工种子萌发、生长、贮藏等条
件,以期为杜鹃兰人工种子实用化提供科学依据。
1 材料
杜鹃兰 C.appendiculata采自其地道产区贵州
省黔东南州施秉县,由贵州大学熊源新教授鉴定。
2 方法
2.1 原球茎的诱导增殖及原球茎悬浮系的建立
以幼嫩、健壮的野生杜鹃兰假鳞茎为外植体,经
充分消毒后用无菌刀片将其切成带1~2个不定芽
眼的小块,接种于高压灭菌后的原球茎诱导培养基
上,原球茎诱导培养基组成为 MS+BA20
mg·L-1+2,4D05mg·L-1 +蔗糖 300g·
L-1+琼脂80g·L-1+PVP05g·L-1+内生真
菌提取物100mg·L-1(内生真菌提取物的制备见
文献[5]),pH58。培养室温度为(25±1)℃,光
照12h·d-1,光照强度为55μmol·m-2·s-1。待
原球茎长出后,将其接种于增殖培养基上,增殖培养
基的组成及培养条件均与原球茎诱导相同。待形成
足够的原球茎增殖群体后,按5g/瓶鲜重的接种量
接种于盛有50mL液体培养基的250mL三角瓶中,
培养基组成为1/2MS(大量元素减半)+BA20mg
·L-1+2,4D05mg·L-1+蔗糖300g·L-1+
内生真菌提取物 100mg·L-1,pH58,(25±1)
℃,漫射光下,摇床转速为60r·min-1的条件下培
养,每10d更换培养基1次,培养30d后,用尼龙网
从原球茎悬浮系中筛选适宜大小的原球茎,用作杜
鹃兰人工种子的繁殖体。
2.2 人工种子的制作、萌发与贮藏
2.2.1 人工种子制作 以杜鹃兰原球茎为繁殖体,
40%海藻酸钠 +20%壳聚糖 +20% CaCl2等为
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人工种皮基质,02mg·L-1NAA+01mg·L-1
GA3+05mg·L
-1BA+04mg·L-1青霉素+03%
多菌灵粉剂+02%苯甲酸钠+10%的蔗糖+100
mg·L-1内生真菌提取物为人工胚乳成分,制作杜
鹃兰人工种子。
2.2.2 人工种子萌发 将不同方法制作的人工种
子各取100粒左右,分别播种于 MS琼脂固体培养
基、蛭石、腐殖土、复合基质(腐殖质蛭石沙为2∶1∶
1)中,蛭石、腐殖土及复合基质均先经 KMnO4和甲
醛熏蒸消毒、密封5d后敞开散尽甲醛蒸汽。在25
℃左右、散射光下萌发,25d后统计人工种子的萌
发率,40d后考查成苗率。萌发标准为突破种皮2
mm,萌发率=萌发数/播种数×100%。成苗转化以
同时具有根和叶为标准,成苗率 =苗数/播种数 ×
100%。
2.2.3 人工种子贮藏 人工种子制成后用Parafilm
密封,在不同温度(4,12,25℃)下黑暗保存,分别于
20,40,60d后各取100粒左右播种于MS琼脂固体
培养基上进行萌发,以确定人工种子的适宜贮藏条
件。培养条件为(25±1)℃、光照12h·d-1、光照
强度55μmol·m-2·s-1,统计方法同2.2.2。
3 结果与分析
3.1 不同人工种皮基质对人工种子萌发和成苗的
影响
制作兰科植物人工种子的繁殖体材料主要是组
织培养产生的原球茎[67]。本实验以杜鹃兰假鳞茎
诱导增殖的原球茎作为其人工种子的繁殖体,研究
了不同基质的人工种皮包埋繁殖体制作的人工种子
的萌发和成苗情况,见表1。与单纯以海藻酸钠为
人工种皮基质(用 CaCl2固化)相比,海藻酸钠外加
壳聚糖后,人工种子不再粘连,25d后的萌发率及
40d后的成苗率均有明显提高;而与单纯的固形基
质相比,以壳聚糖包裹固形基质为种皮的人工种子,
其萌发率和成苗率均大大降低,这可能与壳聚糖在
固形基质外需碱性条件成膜(用 NaOH溶液固化),
导致基质pH升高有关。故固形基质外膜材料的选
择和涂覆工艺还有待进一步探索。
表1 不同人工种皮基质对杜鹃兰人工种子萌发率和
成苗率的影响 % 
人工种皮基质 萌发率 成苗率
4%海藻酸钠+2%CaCl2+2%壳聚糖 784a2) 690a
固形基质1)+2%壳聚糖 127c 42c
4%海藻酸钠+2%CaCl2 630b 486b
固形基质 689b 528b
  注:1)固形基质,即黏土蛭石MS培养液为2∶1∶2;2)新复极差
检验;不同字母表示处理平均数之间 α=005水平差异显著
(表2~4同)。
3.2 不同组分的人工胚乳对人工种子萌发和成苗
的影响
通过以海藻酸钠和壳聚糖等为种皮基质、1/2
MS培养液为溶剂并分别添加不同成分制成人工胚
乳的杜鹃兰人工种子的萌发实验表明,人工胚乳内
不同成分及其组合的效果各异,见表2。在人工胚
乳中添加杜鹃兰内生真菌提取物,能显著地提高人
工种子的成苗率,这是由于杜鹃兰的生长有赖其内
生真菌,而内生真菌提取物提供了杜鹃兰正常生长
所需的某些重要成分[8];添加蔗糖对人工种子萌发
和成苗均有重要作用;多菌灵和苯甲酸钠可有效防
霉或防腐,多菌灵抑制霉菌的效果比青霉素好;BA
能有效促进人工种子萌发,NAA和 GA3通过促进生
根而有利于幼苗成活,且 NAA单独使用不如与 BA
或GA3配合使用效果好。
表2 不同组分人工胚乳对杜鹃兰人工种子萌发和成苗的影响
人工胚乳成分(溶剂为1/2MS培养液)1)
NAA BA GA3 青霉素 苯甲酸钠 多菌灵 蔗糖 内生真菌提取物
萌发率
/%
成苗率
/%
02 05 01 04 02 03 10 100 889a 865a
02 05 01 04 02 03 10 - 860a 783bc
02 05 01 04 02 03 - 100 732cd 696d
02 05 01 04 02 - 10 100 701d 679d
02 05 01 04 - 03 10 100 725cd 687d
02 05 01 - 02 03 10 100 836ab 814ab
02 05 - 04 02 03 10 100 768bcd 703cd
02 - 01 04 02 03 10 100 733cd 718cd
- 05 01 04 02 03 10 100 815abc 756bcd
  注:1)人工种皮基质为4%海藻酸钠+2%CaCl2+2%壳聚糖;激素、抗生素及内生真菌提取物的单位为mg·L-1;苯甲酸钠、多菌灵粉剂及
蔗糖的加入量为占人工胚乳总量的百分率。
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  据李修庆[9]报道,用胚状体制作人工种子时,
要考虑母本植株的种子是否含有胚乳,如芹菜、胡萝
卜等是含胚乳种子,人工胚乳中必须加入蔗糖或其
他碳源等营养物质才能使其人工种子萌发。而对无
胚乳的苜蓿,其人工种子不加营养物也可萌发,加入
营养物质后有促进萌发的作用[10]。
3.3 不同贮藏温度和贮藏时间对人工种子萌发及
成苗的影响
将杜鹃兰人工种子在4,12,25℃下分别贮藏
20,40,60d后进行萌发实验,结果表明,随着贮藏温
度的升高和贮藏时间的延长,人工种子的萌发率和
成苗率均大幅度下降,见表3。张明生[8]的研究证
明,兰科几种不同药用植物人工种子对贮藏温度的
反应明显不同,杜鹃兰人工种子在4℃下贮藏的萌
发率和出苗率明显高于金线莲和石斛人工种子,而
在12℃下贮藏时金线莲人工种子的萌发率和出苗
率高于其他2种,25℃下贮藏时石斛的则高于另2
种。这可能是由于不同植物本身维持生命活动的酶
系差异所致,如张希太等[11]报道的脱毒甘薯人工种
子,在4℃条件下无论贮藏30,60,90d,其萌发率均
为0,认为这是因为甘薯植物体内维持生命活动的
酶系属高温酶系,其保持活性的最低温度限点是9
℃,在4℃条件下贮藏的脱毒甘薯人工种子,因其繁
殖体中的酶系全部失活而死亡,故不能萌发。
表3 不同贮温和贮期对杜鹃兰人工种子萌发和
成苗的影响
温度/℃ 时间/d 萌发率/% 成苗率/%
4 20 682a 653a
  40 515b 442b
  60 387c 271c
12 20 509b 454b
  40 356c 257c
  60 192d 113d
25 20 364c 292c
  40 195d 95d
  60 43e 00e
  人工种子制作与栽培不一定同步,贮藏就成为
人工种子的另一重要研究课题。脱水(干化)、低
温、添加生长抑制物质等是常用的延长贮藏时间的
方法。Vigneron[12]认为,体细胞胚干化处理有助于
提高胚活力和人工种子的抗逆性,干化再结合4℃
低温处理可望解决人工种子短期贮藏问题。
3.4 不同萌发基质对人工种子萌发及成苗的影响
将以4%海藻酸钠 +2% CaCl2+2%壳聚糖为
人工种皮基质,1/2MS液体培养基 +02mg·L-1
NAA+01mg·L-1GA3+05mg·L
-1BA+04
mg·L-1青霉素+03%多菌灵粉剂 +02%苯甲酸
钠+10%蔗糖+100%内生真菌提取物作为人工
胚乳成分制作的杜鹃兰人工种子,在不同萌发基质
中进行萌发实验,结果表明,在 MS琼脂培养基上,
杜鹃兰人工种子的萌发率和成苗率均最高,在蛭石
中的萌发率和成苗率次之,复合基质(腐殖质蛭石
沙为2∶1∶1)中的居于第3,腐殖土中的最低见表4。
分析其原因,MS琼脂培养基的高营养和无菌环境可
能是人工种子萌发率和成苗率高的主要因素;蛭石
在生产过程中经过高温膨化,所带杂菌大部分被杀
死,所以人工种子在其中的萌发率和成苗率较高;而
腐殖土和复合基质所带杂菌量较大,人工种子在其
中萌发时部分被杂菌污染而引起腐烂。与腐殖土相
比,复合基质因其透气性好而有利于人工种子的萌
发和成苗。
表4 不同萌发基质中杜鹃兰人工种子萌发和成苗的差异
萌发基质 萌发率/% 成苗率/%
蛭石 791b 702b
腐殖土 618c 455d
复合基质 707bc 574c
MS琼脂培养基 885a 841a
  人工种子的成苗率主要受其萌发率影响,但人
工环境中萌发移栽于土壤中的人工种子,其成苗率
几乎均低于萌发率,这可能因为人工环境中萌发的
人工种子抗逆性差,加上大田土壤中病菌多,造成对
幼苗的危害,从而降低了成苗率。但据薛建平等[13]
报道,半夏自然环境中的人工种子成苗率和萌发率
相差无几。
4 讨论
人工种子使得无菌生长的胚状体、原球茎等繁
殖体材料可以直接播入土壤,从而降低了试管苗培
育和移栽驯化过程中的高额费用。因此,人工种子
从一诞生就向人类展示了诱人的前景,但对其研究
目前仍处于探索阶段,大规模应用尚有诸多问题
(包括理论的、技术的和商业的)亟待解决。人工种
子还远不能像天然种子那样方便、实用和稳定,要真
正进入商业市场并与自然种子竞争,还有许多难关,
如制备的成本应逐渐降低,手工操作应逐渐减少,培
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养时间要逐渐缩短,包埋等材料需不断更新、改造,
即培养及制作过程的自动化及机械化程度均应不断
加强。这些难以迅速解决的技术领域涉及到细胞工
程学、植物胚胎学、植物生理学、生物化学、高分子化
学和机械加工等学科,要求的技术条件较高,尚难达
到普及和推广阶段。
目前,虽然多数植物人工种子的成本还远远高
于自然种子,但有一点很明确,那就是人工种子与试
管苗相比,所用培养基量少、体积小、繁殖及发芽成
苗快、运输与保存方便。因此,人工种子生产对于天
然种子产量高、自然繁殖容易的物种虽意义不大,但
该技术用于珍稀、紧缺、难繁药用植物种子种苗研究
开发及其药材生产基地建设,却具有重要的理论意
义和重大的实用价值。相信随着农业生物技术,尤
其是组织培养和细胞培养技术的发展,人工种子这
项现代生物技术必将对作物遗传育种、良种繁育和
栽培等方向的研究起到巨大的推进作用。
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PreparationtechniqueofCremastraappendiculatasyntheticseed
ZHANGMingsheng1,2,PENGSiwen1,YANGXiaorui1,XULi1
(1.SchoolofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;
2.LaboratoryCenterofLifeScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)
[Abstract] TheprotocormsuspensionsystemofCremastraappendiculatawasfoundedbyliquidsuspensionculture.Thefactors
toefectgerminationrateandseedlingconversionrateofC.appendiculatasyntheticseeds,suchassyntheticcoatingmaterials,synthet
icendospermcomponents,storingconditionsandgerminationmaterials,etc.werestudied.Theresultshowedthatthegerminationrate
andseedlingconversionrateofsyntheticseedswerethehighestontheMSsolidmediumwhileusing4% sodiumalginate+2%
CaCl2+2% chitosanassyntheticcoatingmaterials,with1/2MSliquidmedium+02mg·L
-1NAA+01mg·L-1GA3+05mg·
L-1BA+04mg·L-1penicilin+100mg·L-1endophyteextract+03% carbendazimpowder+02% sodiumbenzoate+10%
sucroseassyntheticendosperm.Andthegerminationrateandseedlingconversionrateofsyntheticseedscouldatainto68% and65%
after20daysstoringat4℃.Thegerminationrateandseedlingconversionrateofsyntheticseedsdecreasedtoagreatextentwithin
creasingthestoringtemperatureandprolongingstoringtime.
[Keywords] Cremastraappendiculata;syntheticseed;protocorm;germinationrate;seedlingconversionrate
[责任编辑 吕冬梅]
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