全 文 ：上海农业学报 9 9 1 5, 1 1 ( 1 ) : 9~ 1 4
A c t a A g r i e u l t u ar e S h a n g h a i
旱芹人工种子内胚状体的优化 `
倪德祥 邓志龙 岑益群 蒋如敏
(复旦大学生命科学学院 ,上海
杨光孝 于 静
2 0 0 4 3 3 )
摘 要 分别以旱芹 ( AP 依m g ar ve ol en : ) 的天然种子 、 子叶 、 真叶等为外植体 , 在 M S +
2
,
4
一
D l m g L/ + K T o
.
s m g L/ 的培养基上诱导产生胚状体包埋成的人工种子 ,可获得最高的转株
率和最低的畸形率 。 四种愈伤组织的 S D S 一 P A G E 电泳结果表明 , 子叶愈伤组织的蛋白成分比其它
三种愈伤组织缺少 8 6k D 、 63k D 、 17k D 、 15k D 、 13k D 的蛋白 , 这可能决定了子叶胚状体的高质量 。 另
外 , 用 M S + A B A l m g / L 处理子叶愈伤组织 ,可使胚状体的蛋 白含量从 1 . 3m g / g (鲜重 )提高到
2
.
g m g / g
,从而大大提高了人工种子冷藏后的转株率 。 所以 , 胚状体的优化是必要的 , 也是可行的 。
关键词 旱芹人工种子 ;胚状体 ;优化
植物人工种子 l[, ’ 〕是项新兴的生物技术 ,但有待于进一步的研究和完善图 。 在人工种子研
制的进程中 ,发现培养物川与合子胚在生理生化特性方面有很多不相似比 5 〕。 所以 ,研制人工种
子 ,除了从人工胚乳和人工种皮方面着手外 , 最重要的还要通过对培养物的优化来提高人工种
子的性能 , 使其耐贮藏 , 增强抗逆性 , 减少畸形苗 、 发育不 良或早熟等现象 。 本文着重就旱芹
(AP iu m
g ar ve ol en : )胚状体的优化问题进行探讨 。
1
. 材 料 与 方 法
1
.
1 通过不同外植体诱导愈伤组织的发生 分别将旱芹天然种子 、 子叶和真叶作常规消毒
处理后 ,接种于 M S十 2 , 4一 D l m g / L + K T 0 . sm g / L的培养基上 ,诱导愈伤组织的发生 。
1
.
2 胚状体的发生和培养以及愈伤组织的继代 将上述诱导发生的愈伤组织 (称为 。 代愈
伤组织 )转入 M S 培养基诱导胚状体的发生 ;再将胚状体转入 1 2/ M S 培养 , 观察胚状体的生
长情况 。
将 。 代愈伤组织转入 M S + 2 , 4一D l m g / L + K T 0 . sm g / L 上继代 (称为 1 代愈伤组织 ,余
类推 ) ,周期为 1个月 。
1
.
3 人工种子的制作和萌发 将胚状体包埋成人工种子 6] 在 1 2/ M S 中培养 ,观察生长情
况 。
1
.
4 A B A 对胚状体发生的影响 以 2 代子叶诱导 的愈伤组织 为材料 , 分别接种于 : ( 1)
M S ; ( 2 ) M S + A B A o
.
s m g / L ; ( 3 ) M S + A B A 1
.
o m g / L ; ( 4 ) M S + A B A 2
.
o m g / L ; ( 5 ) M S +
A B A 4
.
o m g L/
; ( 6) M s + A B A 10 m g L/
。 观察比较胚状体的发生情况 。
1
.
5 凝胶电泳分析不同外植体诱导的愈伤组织的蛋白成分
1
.
5
.
1 样品制备 愈伤组织各称取 1 . 0 9 ,经冰冻干燥处理后 , 用 0 . 05 m ol · L 一 ` 、 p H S . 8
的 T r i s 一 H C I缓冲液 0 . s m l 抽提 ,然后在 4 ℃下分步离心 , 3 o o o r /m i n 又 l o m i n 和 3 s o o r /m i n x
收稿日期 : 1 9 9 4一 0 6一 0 6 初稿 ; 1 9 9 4一 0 7一 1 1 修改稿 。
, 上海市科委自然基金和高等学校博士点基金资助项 目。
上 海 农 业 学 报 1 1卷
sm i
n,上清液中加入适量蔗糖待用 。
1
.
5
.
2 P A G E 不连续 系统浏蛋 白质 参考莽克强的高 p H 不连续 P A G E 系统 , 浓缩胶浓
度为 5% ,分离胶浓度为 1 3 . 5 % , 4℃下电泳 , 电流恒流 2 0 m A , 电泳完毕后 , 0 . 25 %考马斯亮蓝
R 2 5 0 染色 3 h , 然后 7% H A C + 5% E T O H 脱色 。
1
.
5
.
3 S D S
一
p A G E 不 连 续 系统 汉1蛋 白质 参考 W e b e r a n d O s b o r n [ , j 的方法 , 配制
13
.
5 %的分离胶 ,浓缩胶为 5% ,样品和变性处理液于 10 ℃沸水中水浴 Zm in , 冷却即可上样 ,
以 6 s k D (牛血清蛋白 ) , 4 5k D (卵白蛋白 ) , 3 0k D (碳酸醉酶 ) , 1 7 . s k D (件乳球蛋白 ) , 1 4 . 3 k D (溶
菌酶 )的标准蛋白作为对照 。 20 m A 恒流电泳 , 电泳完毕后染色 , 脱色 ( 同ul . 5 . 2 ,’) 。
1
·
6 B ar df or d 法则定蛋白质含 t
1
.
6
.
1 经不同浓度 A B A 处理后的胚状体各称取 1 . 鲍 ,用 l m l 0 . 05 mo l · L 一 ` p H S . 8 的
T r i s
一
H C I 抽提 。 然后在 4 cC 下分步离心 , 3 o o o r /m i n x l o m i n 和 3 s o o r /m i n x s m i n , 取上清液 。
1
.
6
.
2 参考 Br ad for d 的蛋白含量测定法 ,测定不同途径诱导产生的愈伤组织的蛋 白含
量 。 以牛血清蛋白为标准蛋 白 , 绘制标准曲线 。 以 0 . 01 % (W /V )考马斯亮 蓝 G 一 2 50 、 4 . 7%
(W /V ) 乙醇和 8 . 5( W / V )磷酸溶液染色 。
2
. 结 果
2
.
1 愈伤组织的诱导 以种子作为外植体培养半个月后 , 出现如下两种情况 : 一是种子裂
开 出现愈伤组织 ,称之为 C al lu s 1( 简称 C ; ,见图 1一 I A ) ;二是种子萌发后 ,子叶和胚轴的生长
受到抑制 ,子叶和下胚轴逐渐愈伤组织化 ,称之为 C al lu s Z , (简称 C : , 见图 1一 I B ) , C , 比 C : 晚
产生一周左右 ,且量少 ,细腻 ,颜色乳白 ; C : 则为浅黄色 。
由子叶诱导产生的愈伤组织称为 C al fu s 3( 简称 C 3 ) ;从真叶产生的愈伤组织 , 称为 C al -
fu s 4 (简称 C 、 ) , 1 个月后均有胚状体出现 ( 图 1一 2 ) ,且愈伤组织为黄色 ,较疏松 。
2
.
2 愈伤组织的继代 C , 经 1次继代后 , 愈伤组织仍然比较细腻 ,增殖速度比 C : 等慢 。 经
2 ~ 3 次继代后 , 愈伤组织增殖量大 ,转为黄色 ,较疏松 ,转入 M S 培养基即有分化 。 C : 经 1 次继
代后 , 愈伤组织 由细腻转变为疏松结构 , 且大量增殖 ; C : 、 C ; 经继代后 , 愈伤组织仍具色黄 、疏
松的特性 。 C , 和 C Z 经 7 次继代后 , 仍有少量的胚状体出现 , 而 C 。 和 C 4 经第 7 次继代后 ,就无
胚状体出现 , C 。 经过长期继代 ,愈伤组织的增殖量 明显减少 ,而且质地也显得 比较致密 。
2
.
3 愈伤组织的分化 上述各种类型的愈伤组织转入 M S 培养基后 ,诱导胚状体的发生 ,
结果有明显的差异 。 C , 的 。 代愈伤组织在 M S 上没有器官分化现象 ; 1代则有小部分愈伤组织
分化 ,镜检表明是畸形胚 , 1 个月后出现伸长的肿胀胚轴 ,但未见子叶的伸展 ,从第 2 代起 , 则
有大量的胚状体产生 ,但均 为畸形胚 (图 1一 3 A ) 。 C Z 的 。 代愈伤组织转入 M S ,产生少量胚状
体 ,从第 1 代起 ,就有大量胚状体出现 ,但畸形苗率很高 (图 1一 3B ) 。 c 。 的胚状体发生类似 C Z 的
第 1 代的分化情况 , 但 C 3 的胚状体相对较小 (图 1 一 3C ) 。 C 4 的胚状体发生也类似 C Z 的胚状体
发生 ,但畸形胚较大 ( 图 1一 3 D ) 。 随着继代时间的延长 , C 3 、 C ; 逐渐丧失胚性 ,经 7 次继代后 ,则
均无胚状体发生 。 而 C , 、 C Z 经 7 次继代后在 M S 上仍有大量胚状体发生 。 四类胚状体就外观而
言 , C 3 的胚状体相对正常 , 畸形胚的肿胀比其它几种稍弱 。
2
.
4 四类外植体生长情况的比较 目前研究胚状体畸形情况主要有子叶变异和愈伤组织
化阁等标志 。 由第 2代愈伤组织分化的四种胚状体在 M S 中进一步培养半个月后 出现了明显
1期 倪德祥等 :早芹人工种子内胚状体的优化
的差异 。 经统计分析发现 , C l 、 C : 的胚状体大都停留在子叶期 ,而 C : 、 C ` 的真叶苗相对较多 ,真
叶苗率分别为 34 . 3%和 3’0 . 1 % 。 C 3 、 C ; 的双子叶率也比较高 ,分别为 83 . 3%和 83 . 7% ,而 C I
的胚状体萌发后较难找到双子叶苗 ,单子叶苗率高达 7 . 0% 。 虽然 , C 3 、 C 4 的双子叶苗率较高 ,
但是 ,其中仍有大量的胚轴或子叶出现愈伤组织化 (不正常 ) 。 因此 , C 3 、 C ; 的正常双子叶苗仅
有 4 3 . 8%和 3 4 . 5% 。
经 比较表 明 , 以子叶为外植体诱导胚状体的发生是最佳的途径 , 其正常苗率最高达
4 3
.
8%
。
2
.
5 四类外植体制作人工种子的萌发情况 将第 2 代愈伤组织诱导产生的胚状体包埋成
人工种子 ,培养后 , 观察统计其萌发情况 ,发现 C l 的转株率明显低于其它 3 种 , 仅有 7 . 8士 5 .
o %
,而 C 。 则高达 89 . 3士 7 . 5% 。 上述四种人工种子的正常苗率均很低 。 C , 、 C Z 的人工种子没有
正常苗 (图 1一 4 , 5 , 6 ) ,而没有包埋的 C : 胚状体的正常苗率却达 23 . 5% 。 C 3 和 C 4 的人工种子
(图 1一 7) 的正常苗率也减少到 28 . 7士 9 . 7%和 23 . 4 士 1 0 . 2% 。这也进一步说明了人工种皮在一
定程度上抑制了胚状体的萌发 。 在萌发的人工种子中 ,有一部分仅有根的形成 ( 图 1一 5 , 7 ) , 子
叶部位已褐变死亡 。 C l 有 26 . 7士 n . 9 %的净长根率 ,而 C 3 、 C ` 也分别有 13 . 5士 7 . 6%和 n . 0
士 6 . 1% 的净长根率 。 这可能与胚状体的畸形与否以及活力大小直接相关 。 在这四类人工种子
的萌发中 , C : 的人工种子具有最高的正常苗率 。 这表明以子叶为外植体诱导胚状体 ,并以该胚
状体为培养物制作人工种子 ,是最佳的途径 。
将 C 3 人工种子萌发成的苗移植于土壤 , 植株的性状均属正常 (图 1一 8 ) 。
衰 1 因类人工种子的萌发惰况
T a bl e I G吧 n川 . a t l o n o f 4 目 n ds o f a rt l lt e l ia s e d s
比较项
K ln d
总数 (裸 )
S e e d s t e s t e d
转株率 (% )
P F R
正常苗 (% )
N o r arn l
p la n t
净长根率 (% )
R F R
苗最高 (e m )
P l a n t h e ig h t
根最长 ( e m )
R o t l
e n g t h
7
.
8士 5 . 0
6 0
.
0士 1 9 . 8
8 9
.
3士 7 . 5
8 5
.
6士 7 . 8
0
2 8
.
7士 9 . 7
2 3
.
4士 10 . 2
2 6
.
7士 1 1 . 9
1 7
.
8士 10 . 9
1 3
.
5士 7 . 6
1 1
.
0士 6 . 1
2
。
4
。
0O
甘ù月`
ù.且
ó l,目3dUC
P F R = P l a n t l e t
一
of r m in g r a t e R F R = R o o t
一
of
r m in g r a t e
2
.
6 A B A 处理对胚状体发生的影响 将第 2 代 C 3 愈伤组织在方法 ( “ 1 . 4 ” )中介绍的 6
种 , 不同浓度的 A B A 处理 ,对胚状体的分化有较大的影响 。 A B A l m g / L , Zm g / L 处理 ,能使胚
状体出现 ( 目测 ) 的时间由 1d0 提前到 d8 ;但当其浓度提高到 一定程度时 ,则对胚状体的形成
产生抑制作用 。 例如浓度为 l o m g / L 时 , 胚状体形成的量极小 ,而且形成的时间被推迟 d4 。 可
见 ,经 A B A 处理的愈伤组织 , 随着 A B A 浓度的升高 , 其增殖量明显减少 , 大小也有递减的趋
势 ,且呈黄褐色 。
2
.
7 人工种子的贮藏 由于人工种子没有休眠期 ,一旦环境许可 , 就会萌发生长 , 所以人工
种子的贮藏是一个巫待解决的问题 。
经不同浓度 A B A 处理 、包埋成的人工种子 , 于 4℃冰箱分别保存 。 , 5 , 1 5 , 3 d0 。 各种处理
数为 60 粒 。 经冷藏后的人工种子置于培养室中培养 , 1个月后统计结果 ( 图 2) 。 从图 2 可见 ,
经低温贮藏 ,转株率有明显降低的现象 ,经 A B A 处理的人工种子直接萌发的转株率同对照的
差异不甚显著 , 而经 30 d 的低温贮藏后 , A B A l m g / L 处理的人工种子有 56 . 1 %的转株率 ,而


1 4上 姆 双 业 字 张 n卷
基于激素作用 的发育和 器官的专一性 , 实验中愈伤组织的诱导 采用 2 , 4 一D l m g / L 和
K T o
.
sm g / L 的组合处理不同类型的外植体 ,诱导的愈伤组织具有明显的差异 , C , 、 C Z 虽然由
同类外植体获得 ,但 C : 经过子叶的阶段形成愈伤组织 , 因此两者在外观和胚性上都有明显的
差异 。 C , 细腻且量少 , 愈伤组织经继代后才体现胚性 , C : 则量多且具胚性 。 C , 、 C ` 与 C , 、 C : 相
比 , C 3 、 C 4 的愈伤组织量大 ,胚性强 ,胚状体发生率高 。 虽然 C : 、 C : 均是子叶脱分化而来 ,但激
素外源处理时所处的发育阶段不同 , 因而两者具有明显的区别 。 C 3 、 C ; 是由不同的器官发育而
来 ,虽然外观上没有明显差异 ,但胚状体的大小以及胚状体的质量有明显差异 。 上述现象均说
明了激素的作用存在着器官和发育的专一性 。
当四类愈伤组织经两次继代后 , 它们的外观均极其相似 , 且都具有较强的胚性 ,但胚状体
的质量差异 明显 ,其中以 C 3 诱导分化的胚状体质量最高 。 经 S D S 一 P A G E 电泳和 Br ad for d 法
测定 ,四类愈伤组织的蛋 白成分和蛋白含量有明显的区别 。 其中 C 3 的蛋白不仅含量低 ,而且缺
少几种蛋白 ,这可能是专一性的激素受体或反式作用因子的缺少 ,致使愈伤组织在 M S 培养基
上分化时的内源激素作用不同于其它三种愈伤组织 ,而诱导产生较高质量的胚状体 。
因农时季节性所限 ,需要人工种子能贮藏一定时间 。 然而 ,人工种子 目前仍存在以下不足 ,
即含水量大 ;常温下易萌发 , 也易失水干缩 ;经冷藏处理后 ,萌发率明显降低 8[] ;与天然种子相
比 , 人工种子内培养物的碳水化合物 、 蛋 白质的含量要少得多 ; 目前的研制手段尚不能使人工
种子产生休眠现象 。 在植物激素中 ,脱落酸 ( A B A )与种子的休眠密切相关 ,许多受 A B A 调节
的基因在胚胎发生的后期进行正常表达 l0[ 〕 。 用 A B A 处理首箱胚状体 ,胚状体的淀粉含量可增
加十几倍 , 使成熟的胚状体具有大量的干物质 1[ 〕 。 实验中以不同浓度的 A B A 处理旱芹愈伤组
织 ,发现一定浓度的处理能促进胚状体的发育 , 以 A B A l m g / L 的处理为最佳 , 而高浓度的
A B A 处理则会抑制胚状体的发育 。 A B A 对人工种子内培养物的作用 , 可能类似于其对天然种
子萌发的抑制和对有机物积累的促进作用 lz[ 〕 ,从而使人工种子增加抗逆能力 。
参 考 文 献
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N i D e x i a n g D e n g Z h i l o n g C e n Y i q u n J i a n g R u m i n Y a n g G u a n g x i a o
( S e h o o l of L t’fe S c i e n c e , F u d a n U n iv e sr i yt , S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 , hC i n a .
Y u J i n g
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A b s t r a e t C a l l i w e r e i n d u c e d f r o m d if f e r e n t e x P l a n t s s u e h a s n a t u r a l s e e d
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d o n o f AP
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T h i s k i n d o f a r t i f i e i a l s e e d s o b
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t a i n e d t h e h i g h e s t e o n v e r s i o n r a t e a n d t h e l o w e s t d e fo r m a t io n r a t e a m o n g t h o s e k i n d s o f a r t i
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T h e S D S
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P A G E e l e e t r o P h o r e s i s r e s u l t i n d i e a t e d t h a t t h e
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,
t h e e o n e e n t r a t io n o f p r o t e i n w a s i n e r e a s e d f r o m 1
.
3m g / g
( f r e s h w e i g h t ) t o 2
.
g m g / 9
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T h e a r t i f i e i a l s e e d s e o n s t r u e t e d f r o m A B A
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g a i n e d 5 6
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t h e s u i t a b i l i t y a n d n e e e s s i t y o f o p t im i z a t io n o f e m b r y o id
s
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K e y w o r d s AP
i u m g ar v e of e n s ; A r t i f ie i a l s e e d ; Em b r y o id ; O p t im i z a t i o n