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Vol. 34，Issue 1
January，2009
第 34卷第 1期
2009年 1月
山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞缺血
再灌注损伤的保护作用
李 澎 1，王建农 1，卢树杰 2，付建华 1*，刘建勋 1
（1. 中国中医科学院 西苑医院，北京 100091；2. 神威药业有限公司，河北 石家庄 051430）
[摘要] 目的：研究山楂叶原花青素对缺血再灌注损伤心肌细胞的直接作用，阐明山楂叶原花青素治疗缺血性心脏病的
机理。方法：体外培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，模拟在体心肌缺血再灌注损伤，即复制缺氧-复氧损伤模型；使用山楂叶原
花青素提取物进行干预；酶反应动力学法测定细胞 LDH漏出率，MTT法测定细胞活力，以观察药物疗效；硫代巴比妥酸法
测定细胞匀浆MDA含量，羟胺法测定细胞匀浆 SOD活性，对药物的治疗机制做进一步探讨。结果：24~60 mg•L-1的山楂
叶原花青素浓度依赖性地抑制缺氧复氧导致的心肌细胞 LDH 漏出（与模型组比较均 P<0.01），提高受损心肌细胞活力（与
模型组比较，24~48 mg·L -1各剂量组均 P<0.05，60 mg·L-1组 P<0.01），降低心肌细胞MDA含量（与模型组比较，均 P<0.01），
提高 SOD活性（与模型组比较 24 mg·L-1组 P<0.05，其余均 P<0.01）。结论：山楂叶原花青素对体外培养的乳鼠心肌细胞的
缺血再灌注样损伤具有显著的治疗作用，这一作用可能与它提高细胞抗氧化能力，抑制脂质过氧化损伤有关。山楂叶原花青
素对缺血再灌注损伤心肌细胞的直接保护作用可能是其治疗缺血性心脏病的机制之一。
[关键词] 山楂叶；原花青素；缺血再灌注损伤；心肌细胞
15缺血性心脏病是指一类因冠脉供血不足而导
致心肌出现损伤的疾病，主要包括冠心病、心绞痛、
心肌梗死等，是当代人类的第一大死因[1]。缺血再
灌注损伤是当前阻碍缺血性心脏病治疗、抢救成功
的主要原因之一。因此，针对缺血再灌注损伤，寻
找有效治疗药物，探讨其作用机制具有重要的意
义。近年来，中草药山楂叶的药理作用日益受到重
视，在冠心病、高血压、心力衰竭等疾病的治疗中
得到广泛地应用[2]。原花青素是其主要药理成分之
一。整体动物实验显示，山楂叶原花青素具有强大
的抗心肌缺血再灌注损伤的能力[3]。进一步研究山
楂叶原花青素抗心肌缺血再灌损伤的机制对于寻
找缺血性心脏病的有效药物、改善治疗效果乃至心
血管疾病的防治都具有重要的意义。
本研究体外培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，以缺
氧-复氧的方式模拟整体水平的缺血再灌注损伤， 观
察山楂叶原花青素的作用。结果显示， 24~60 mg·L -1

[收稿日期] 2008-08-20
[基金项目] 国家自然科学基金项目（30472182）；国家“十五”攻
关课题（2001BA701）
[通信作者] *付建华，E-mail：jianhuaff@263.net

的山楂叶原花青素具有显著的抗损伤作用，并且这种
抗损伤作用呈浓度依赖性；此外，山楂叶原花青素还
能够显著抑制脂质过氧化损伤，提高心肌细胞抗氧化
能力。这表明山楂叶原花青素抗心肌缺血再灌注损伤
的作用与其对心肌细胞的直接保护作用有关，而这一
保护作用又与其对抗细胞氧化损伤有关。
1 材料
1.1 动物
清洁级 SD大鼠乳鼠，出生 1~2 d，购自北京维
通利华实验动物技术有限公司，许可证号 SCXK
（京）2007-0001。
1.2 药物
山楂叶原花青素寡聚体（中国中医科学院西苑
医院基础室提取）。
1.3 主要试剂
II 型胶原酶（Gibco 公司，17101-015），胰酶
（Amesco公司，0458），标准胎牛血清（中国科学
院生物工程研究所，TBD0032HYP），DMEM培养
基（高糖，Gibco-BRL31600-034）。
MTT（Sigma公司，M-2128），DMSO（Amesco
公司，0231），LDH活性测定试剂盒（中生公司），
MDA含量测定试剂盒（南京建成公司），SOD活性


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测定试剂盒（南京建成公司）。
2 方法
2.1 乳鼠心肌细胞原代培养
无菌条件下取出乳鼠心脏，剪取心室组织，充
分剪碎，0.125%胰酶-0.05%II 型胶原酶，37°C，
振荡消化 2~3次，每次 0.5 h。收集消化上清液，1 500
r·min-1离心 10 min，取沉淀，加入心肌细胞培养基
（10%胎牛血清 DMEM，内含 105 U·L-1的青霉素和
链霉素），吹打均匀，壁立 1.5 h。收集未贴壁细胞，
调整细胞至 6×108个/L，接种于 35 mm培养器皿
中，37 ℃，5%CO2，100%湿度，培养 48 h后，用
于实验。
2.2 乳鼠心肌细胞缺血再灌注样损伤模型的复制
和山楂叶原花青素的干预
弃去培养基，无糖台氏液洗 3遍。每孔加入预
先以 95%N2-5% CO2混合气饱和 15 min的无糖台氏
液 2 mL。将培养皿敞盖，放入缺氧盒（体积约 0.5 L）
内，通入 95%N2-5% CO2混合气，流速 1 L·min-1。
通气 15 min后，夹闭进气管和出气管，将缺氧盒置
于细胞培养箱内 2.5 h。此过程为缺氧。打开缺氧盒，
取出培养皿，吸出上清液，每孔加入 2 mL2.5%胎
牛血清DMEM培养基。置于培养箱内继续培养 2 h，
此过程为复氧。
山楂叶原花青素以 DMSO 溶解，按 1∶1 000
加入无糖台氏液或 2.5%胎牛血清 DMEM培养基。
在缺氧和复氧刚开始时，各给药 1次。正常对照组
给予含 0.1%DMSO的台氏液，培养 2.5 h后，更换
含0.1%DMSO的2.5%胎牛血清DMEM培养基继续
培养 2 h。
2.3 LDH漏出率的测定
LDH活性的测定采用酶反应动力监测法，使用
Screen master 3000+半自动生化仪，操作按照试剂盒
说明书进行。分别测定缺氧末和复氧 2 h培养上清
液以及细胞裂解液（复氧 2 h后，吸去培养基，每
皿加入 2 mL生理盐水，冻溶 1次，所得上清液）
的 LDH活性。
LDH漏出率=（缺氧末上清 LDH活力+复氧 2 h
上清 LDH活力）/（缺氧末上清 LDH活力+复氧 2 h
上清 LDH活力+细胞裂解液 LDH活力）
2.4 心肌细胞活力的测定
采用MTT法。复氧 2 h后，吸去培养基，PBS
洗 3次，每皿加入 2 mL以 PBS配制的 1 g·L-1 MTT
溶液，培养箱内孵育 4 h。弃去MTT液，每皿加入
2 mL的 DMSO，15 min后，以 Bio-Rad 550型酶标
仪，490 nm波长，检测 A值。
2.5 细胞内MDA含量和 SOD活性的测定
复氧 2 h后，弃去培养基，迅速刮取细胞，每
皿细胞加入 2 mL PBS，以 Sonics超声细胞粉碎仪
冰浴中处理 30 s，3 500 r·min-1，4 ℃，离心 10 min，
取上清测定MDA含量和 SOD活性。
MDA 测定采用硫代巴比妥酸法，操作按照试
剂盒说明书进行，以岛津 UV-120-02型紫外-可见光
分光光度计 532 nm波长测定 A值。
SOD测定采用羟胺法，操作按照试剂盒说明书
进行，以岛津 UV-120-02型紫外-可见光分光光度计
550 nm波长测定 A值。
2.6 数据处理与统计
各组数据以 ±x s表示。统计检验使用 SPSS13.0
软件进行，两组数据间差异比较采用 t 检验，多组
数据间差异比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞缺血再灌注
样损伤的治疗作用
3.1.1 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞 LDH 漏出
的影响 正常组只有很低的 LDH 漏出，缺血再灌
注样损伤导致 LDH 大量漏出，与正常组比较，
P<0.01。24~60 mg·L-1的山楂叶原花青素显著抑制
了 LDH 漏出率的升高，且这一作用具有浓度依赖
性；各组与模型组比较，均 P<0.01（表 1）。
表 1 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞缺血再灌注样
损伤的治疗作用
组别 剂量
/mg·L-1
LDH
漏出率
MTT
（A）
正常 - 0.03±0.01 0.68±0.07
模型 - 0.50±0.082） 0.51±0.032）
山楂叶原花青素 12 0.45±0.11 0.59±0.05
24 0.33±0.124） 0.64±0.053）
36 0.23±0.084） 0.71±0.083）
48 0.13±0.124） 0.77±0.113）
60 0.14±0.064） 0.85±0.104）
注：与正常组比较 1
）P<0.01，2）P<0.01；与模型组比较 3）P<0.05，
4）P<0.01（表 2同）。

3.1.2 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞活力的影
响 缺血再灌注样损伤导致细胞活力的显著下降，


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与正常组比较，P<0.01。24~60 mg·L -1山楂叶原花
青素显著抑制了细胞活力的下降，且这一作用具有
浓度依赖性；与模型组比较，24~48 mg·L -1各组均
P<0.05，60 mg·L -1组 P<0.01（表 1）。
3.2 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞的抗氧化作用
3.2.1 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞 MDA 含量
的影响 缺血再灌注样损伤导致心肌细胞内 MDA
含量显著升高，与正常组比较，P<0.01。 24~60
mg·L-1的山楂叶原花青素显著抑制了MDA的升高，
与模型组比较，各组均 P<0.01（表 2）。
表 2 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞损伤的
抗氧化作用
组别 剂量
/mg·L-1
MDA
/nmol·L-1
SOD
/U·L-1
正常 - 0.22±0.15 27.13±9.35
模型 - 0.74±0.142） 16.07±2.351）
山楂叶原花青素 12 0.51±0.12 19.52±4.04
24 0.39±0.164） 21.28±3.683）
36 0.38±0.294） 24.46±3.554）
48 0.31±0.154） 25.10±5.514）
60 0.29±0.154） 25.22±3.894）

3.2.2 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞 SOD 活性
的影响 缺血再灌注样损伤导致心肌细胞内 SOD
活性显著降低，与正常组比较，P<0.05。24~60 mg·L-1
的山楂叶原花青素显著抑制了 SOD 的下降，与模
型组比较，24 mg·L-1组 P <0.05，36~60 mg·L-1各组
均 P<0.01（表 2）。
4 讨论
20世纪 60年代，Sommer等在犬的心肌缺血损
伤中发现，当缺血时间达到一定长度时，即使血流
得到恢复，心肌的功能也无法得到恢复，甚至进一
步恶化。 这一现象被命名为“心肌缺血再灌注损
伤”[4]。经过近 50年的研究，人们对于心肌缺血再
灌注损伤的机制有了很深入的了解。氧自由基损伤
被认为是最重要的机制之一。研究显示，在恢复血
流供应后的很时间内，心肌组织内氧自由基爆发式
产生。这些氧自由基包括超氧阴离子、羟自由基以
及初生态氧等。氧自由基主要损伤细胞内含不饱和
键的的生物大分子，包括细胞和细胞器膜、含巯基
蛋白质以及 DNA 等；从而导致一系列严重的的后
果，包括细胞（器）膜流动性显著降低、通透性显
著升高，蛋白功能异常，线粒体肿胀乃至崩解以及
DNA断裂等，最终细胞出现坏死或凋亡[5-6]。
山楂叶味酸，性平，入肝经，有活血化瘀、理
气通脉之效[7]。山楂叶提取物在心、脑缺血，炎症
以及过氧化损伤方面具有显著的疗效[3]。传统上认
为山楂叶的主要活性成分是黄酮。近年来，发现山
楂叶还富含原花青素。原花青素是一类由儿茶素、
表儿茶素的聚合体构成的混合物。除山楂果、叶外，
它还存在于、葡萄、莲蓬、可可等植物中。原花青
素具有强大的抗心脑血管疾病的能力，其作用日益
受到重视[8]。研究显示，山楂叶原花青素能够显著
地对抗心肌的缺血再灌注损伤。在犬的心肌缺血再
灌注损伤模型中，山楂原花青素可以显著改善血流
动力学指标，抑制心电图 S-T 段升高， 降低心肌
坏死面积； 抑制缺血区炎症介质升高和白细胞浸
润[3,9]。上述研究是在整体水平上进行的，山楂叶原
花青素对心肌细胞的直接作用如何，是否具有直接
的保护作用，目前尚未见报道。
本实验使用体外培养细胞，排除在体因素，观察
了山楂叶原花青素对缺血再灌注样损伤的直接作用。
使用 LDH漏出率和MTT检测作为药效评价的指标。
二者分别反映细胞膜的通透性和细胞线粒体的功能。
在缺血样损伤组中，LDH漏出率显著升高，MTT检
测 A值显著下降，这表明细胞膜通透性显著升高，线
粒体功能明显下降，细胞出现严重的损伤。而山楂叶
原花青素显著改善了这两项指标。这表明，山楂叶原
花青素对缺血再灌注样损伤的心肌细胞具有直接的
保护作用，这可能是其治疗心肌缺血再灌注损伤的机
制之一。根据本实验，山楂叶原花青素治疗心肌细胞
缺血再灌注样损伤有效剂量为 24~60 mg·L-1，其中以
48，60 mg·L-1效果最佳。这一结果与原花青素在细胞
水平的药理剂量是一致的[10]。
MDA是细胞膜氧化损伤的主要产物。SOD具有
强大的氧自由基淬灭功能，是机体对抗过氧化损伤的
主要物质之一。研究显示，心肌组织在缺血再灌注损
伤时，MDA的含量显著升高，SOD的活性显著降低。
外源性导入 SOD的蛋白或mRNA可以显著减轻心肌
缺血再灌注损伤；而敲除 SOD 基因则明显加重损伤
[11,12]。本实验显示，缺血再灌注样损伤导致心肌细胞
MDA含量显著升高，SOD活性显著降低。而 24~60
mg·L-1 的山楂叶原花青素显著降低 MDA 含量的增
加，提高 SOD 的活性。这表明，山楂叶原花青素具


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有对抗心肌细胞缺血再灌注过程中的过氧化损伤，提
高心肌细胞抗氧化的能力。这可能是它对抗心肌细胞
缺血再灌注样损伤的重要机制。
综上所述，本实验显示山楂叶原花青素对遭受
缺血再灌注样损伤的乳鼠心肌细胞具有的直接的
保护作用，这一保护作用可能与其抑制细胞过氧化
损伤，增强细胞抗氧化能力有关。山楂叶原花青素
对缺血再灌注损伤中心肌细胞的直接保护作用可
能是其治疗缺血性心脏病的机制之一。
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Protective effect of hawthorn leaf procyanidins on cardiomyocytes of neonatal
rats subjected to simulated ischemia-reperfusion injury

LI Peng1，WANG Jiannong1，LU Shujie2，FU Jianhua1*，LIU Jianxun1
（1. Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China;
2. Shenwei Pharmaceutical Corporation Ltd.，Shijiazhuang 051430，China）

[Abstract] Objective: To study the direct effect of hawthorn leaf procyanidins on cardiomyocytes subjected to
ischemia-reperfusion injury and elucidate their therapeutic mechanism on ischemic heart diseases. Method：Cultured cardiomyocytes of
neonatal rats were subjected to anoxia-reoxia injury which simulated the ischemia-reperfusion injury in vivo，and hawthorn leaf procyanidins
were applied. The therapeutic effect was valued by LDH leakage and MTT test. For a further mechanism study，contents of MDA and
activities of SOD in cardiomyocytes were measured. Result：Hawthorn leaf procyanidins in 24-60 mg• L-1 significantly and
dose-dependently inhibited LDH leakage （compared with the model group，all P<0.01 ） and cell viability decrease （compared with model
group，24-48 mg·L-1 groups all P <0.05; 60 mg·L-1 group，P<0.01） in cardiomyocytes induced by anoxia-reoxia injury. Furthermore，
hawthorn leaf procyanidins in 24-60 mg·L-1 significantly inhibited the increase of MDA content （compared with the model group，all
P<0.01） and the decreased of SOD activity （compared with the model group，24 mg·L-1 group，P<0.05; other groups all P<0.01） in
cardiomyocytes undergoing anoxia-reoxia injury. Conclusion：Hawthorn leaf procyanidins have a significant therapeutic effect on the
simulated ischemia-reperfusion injury of cultured neonatal rat cardiomyocytes，which may relate to their anti-oxidation effects. And the
direct protective effect of hawthorn leaf procyanidins on cardiomyocytes subjected to ischemia-reperfusion injury may be one of the key
mechanisms of its therapeutic effect on ischemic heart diseases.
[Key words] hawthorn leaf procyanidins；ischemia-reperfusion injury；cardiomyocyte
[责任编辑 刘 ]