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Effect of Weichang Anwan on NO and 5-HT in blood serum,SP and MC in colon in IBS-D rats

胃肠安丸对IBS-D大鼠血清NO,5-HT及结肠组织SP,MC的影响



全 文 :胃肠安丸对 IBSD大鼠血清 NO,5HT及结肠
组织 SP,MC的影响
胡瑞,唐方
(天津医科大学 总医院 中医科,天津 300052)
[摘要] 目的:探讨胃肠安丸对腹泻型肠易激综合征(diarheapredominantiritablebowelsyndrome,IBSD)大鼠止泻作用
的药理机制。方法:运用高乳糖饲料喂饲与束缚应激相结合的方法复制IBSD大鼠模型。雌性Wistar大鼠24只,随机分为空
白组、模型组及胃肠安丸(60mg·kg-1·d-1)组,通过比较各组大鼠体重增长率、观察腹泻潜伏期及腹泻指数,确定最佳用药
周期。进一步将45只雌性Wistar大鼠分为空白组、模型组、胃肠安丸高、中、低剂量(80,60,40mg·kg-1·d-1)组,光镜下观
察各组结肠组织肥大细胞(MC)数目,硝酸酶还原法测定血清一氧化氮(NO)含量、运用荧光光度计检测血清5羟色胺(5
HT)水平及放射免疫法测量结肠组织P物质(SP)含量。结果:用药后4d胃肠安组与模型组体重增长率差值最大,且腹泻指
数差别有统计学意义(P<005),因此确定最佳用药周期为4d。与空白组比较,模型组血清 NO及5HT含量下降(P<
001),SP含量升高(P<005),MC数目增多(P<001);与模型组比较,高、中剂量胃肠安丸可上调血清 NO及5HT含量
(P<001),下调SP表达(P<005),并使肥大细胞数目减少(P<001)。结论:胃肠安丸的止泻作用机制与升高血清 NO及
5HT含量有关,亦与抑制结肠组织SP表达及降低MC数目相关。
[关键词] 胃肠安丸;肠易激综合征;一氧化氮;5羟色胺;P物质
[收稿日期] 20090420
[基金项目] 天津市科技创新专项基金(06FZZDSH00405)
[通信作者] 唐方,教授,博士生导师,Tel:(022)60363599,E
mail:zhongyi3599@sinacom
[作者简介] 胡瑞,硕士,副主任医师,从事消化系统及心血管系统
疾病的医疗、教学、科研工作
    肠易激综合征 (iritablebowelsyndrome,
IBS)[1]是临床常见的1种胃肠道功能紊乱性疾患,
该病缺乏形态学和生物化学异常改变可解释的临床
症状,由于IBS发病率高、病理机制复杂、病情缠绵
难愈、无有效根治措施,严重影响患者的生活质量和
工作。中医药擅长调整机体功能失常,对于治疗
IBS具有独到的优势。
胃肠安丸多用于治疗感染性腹泻,笔者在临床
实践中观察到其对腹泻型肠易激综合征(IBSD)亦
具有止泻作用。而 IBSD的发病机制,与胃肠动力
紊乱及内脏感觉异常密切相关[2],本研究以结肠肥
大细胞计数、血清 NO,5HT及结肠组织 SP含量等
为观测指标,探讨胃肠安丸对IBSD的作用机制。
1 材料
11 动物
清洁级Wistar大鼠69只,体重(150±10)g,雌
性,购自军事医学科学院,实验动物批号 SCXK
(军)2002001。
12 药物
胃肠安丸(天津中新药业集团股份有限公司乐
仁堂制药厂生产,批号20070324),由木香、麝香、檀
香、沉香、朱砂、川朴、枳壳、大黄、巴豆霜、川芎、大枣
等11味中草药组成,制成微丸制剂。
13 试剂
血清NO试剂盒(南京建成生物工程研究所,批
号20071203);5羟色胺硫酸肌酐(SigmaAldrich公
司,批号017K1768);邻苯二甲醛(SigmaAldrich公
司,批号WA22483);L半胱氨酸(天津市光复精细
化工研究所,批号070723);正庚烷(天津市赢达稀
贵化学试剂厂,批号20070902);P物质放免试剂盒
(北 京 普 尔 伟 业 生 物 技 术 有 限 公 司,批 号
20080328)。
14 主要仪器
TU1810PC型紫外可见分光光度计(北京普
析);F4500荧光分光光度计(Hitachi,日本);放射
免疫γ计数器(中国科大中佳公司)。
2 方法
21 高乳糖饲料制备
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参照文献方法加工高乳糖饲料[3]。饲料配方:
酪蛋白2205%、乳糖4558%、蔗糖1500%、大豆
油 375%、纤维素 8%、DL蛋氨酸 04%、胆碱
02%、维生素混合物 002%、无机盐混合物 5%。
其中维生素与无机盐各组成成分参见 GB149243
2001。由北京科澳协力饲料有限公司加工。
22 模型制备
参照文献方法略作改变[4]。用(08×10)cm2
的医用橡皮膏,捆绑于实验鼠双后肢膝踝关节之间,
固定于高20cm的铁架上,倾斜60°放置,使大鼠双
后肢完全制动,肢体其他部位可自由活动,1h后解
除束缚。
23 最佳用药周期确定
231 分组及给药 动物随机分为3组,空白组、
模型组、胃肠安丸组,每组8只。模型组和胃肠安丸
组喂饲高乳糖饲料,每日束缚应激1h;空白组喂饲
基础饲料,自由活动。胃肠安丸组予胃肠安丸混悬
液(40mg·kg-1·d-1)灌胃;模型组及空白组灌胃
2mL蒸馏水。连续6d。
232 指标观测 体重增长率计算:以模型制
备当日体重作为初始体重,每日计测体重,体重
增长率 =(每日体重 -初始体重)/初始体重 ×
100%。腹泻观察:腹泻率 =腹泻动物数/该组动
物总数 ×100% 。干便和稀便的区分以滤纸上有
无污迹为标准。腹泻潜伏期观测:指每只实验鼠
自模型制备开始到出现溏稀便所用时间,以小时
计算。腹泻指数计测:腹泻指数[5]=稀便率 ×平
均稀便级。稀便率:每只动物所排的稀便数与总
便数之比。粪便次数:以每粒或每堆(不能分清
粒数者)为 1次。稀便级:表示每只动物稀便的
程度,以稀便污染滤纸所形成污迹的直径定级,
分为4级:<1cm(1级),1~2cm(2级),2~3
cm(3级),>3cm(4级)(稀便直径的测量:圆形
者测其直径;椭圆形或不规则形状测其最长和近
似圆的直径,两数相加除以2)。平均稀便级 =稀
便级数总和/稀便次数。
24 胃肠安丸对血清 NO,5HT,结肠 SP及 MC的
影响
241 分组及给药 动物随机分为 5组,每组 9
只,空白组、模型组、胃肠安丸高、中、低剂量组。模
型组和各投药组喂饲高乳糖饲料,每日束缚应激1
h;空白组喂饲基础饲料,自由活动。用蒸馏水将胃
肠安丸配制成高、中、低剂量混悬液,给药剂量分别
为80,60,40mg·kg-1·d-1,相当于人体用量(4
mg·kg-1·d-1)的 20,15,10倍。4℃保存备用。
投药前将药液在室温中放置1h,并充分混匀后使
用。各投药组予相应剂量中药混悬液灌胃,模型组
及空白组予2mL蒸馏水灌胃。依据最佳用药周期
的结果确定给药天数。实验结束,腹主动脉取血,处
死动物,留取组织。
242 结肠组织肥大细胞计数 将距回盲部2cm
处结肠组织切片,以甲苯胺蓝法染色,应用图像分析
系统,于高倍视野下(×400),每例检体随机计数10
个视野内肥大细胞数,求取平均值作为每例检体肥
大细胞个数,计数结果以个数/视野表示。
243 血清NO测定 采用硝酸还原酶法,具体操
作按试剂盒说明进行。
244 血清5HT检测 用酸性正丁醇提取血清
5HT,正庚烷除去干扰物,强酸环境中与邻苯二甲
醛进行沸水浴,反应体系中加入半胱氨酸,荧光光度
计读取荧光值,计算5HT浓度。
245 结肠组织SP测定 采用非平衡法,具体操
作程序按试剂盒说明书进行。
25 统计学处理
采用 SPSS160统计软件处理,实验数据
以 珋x±s表示,两组间样本均数比较采用双侧 t检
验;多组间样本均数比较采用单因素方差分析,方差
齐性检验采用 Leven法;率的显著性比较采用卡方
检验。P<005具有统计学意义。
3 结果
31 最佳用药周期
311 各组体重增长率比较 与空白组相比,胃肠
安丸组与模型组体重增长率显著下降(P<001),
其中,胃肠安丸组体重下降幅度低于模型组,但两组
间比较无显著性差异。实验开始第4天,胃肠安丸
组与模型组体重增长率间差值最大(表1)。
312 腹泻率、腹泻潜伏期及腹泻指数比较 喂饲
高乳糖饲料24h后,胃肠安丸组和模型组大鼠陆续
出现溏稀便,至48h两组腹泻率达100%。空白组
大鼠粪便呈颗粒状。
胃肠安丸组腹泻潜伏期(2894±990)h,
模型组(2881±902)h,组间比较差异无统计
学意义。但在实验周期内,胃肠安丸组腹泻指数
自实验开始第2天与模型组呈现差异,至第4天
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  表1 各组大鼠体重增长率、腹泻指数比较(珋x±s,n=8)
造模时间
/d
组别
剂量
/mg·kg-1
体重增长率
/%
腹泻指数
1 空白  - 2.602±2.471 0.000±0.000
模型  - -7.711±2.018 -
胃肠安 60 -6.285±1.361 -
2 空白  - 4.972±4.884 0.000±0.000
模型  - -10.757±2.490 0.988±0.191
胃肠安 60 -8.872±2.426 0.964±0.171
3 空白  - 7.287±5.551 0.000±0.000
模型  - -12.035±2.667 1.135±0.109
胃肠安 60 -10.124±4.702 1.078±0.723
4 空白  - 8.773±6.206 0.000±0.000
模型  - -13.677±3.425 1.266±0.209
胃肠安 60 -9.015±3.450 1.066±0.0591)
5 空白  - 12.590±7.611 0.000±0.000
模型  - -13.218±2.982 1.279±0.228
胃肠安 60 -10.068±2.940 1.100±0.072
6 空白  - 16.063±8.745 0.000±0.000
模型  - -15.302±2.832 1.272±0.208
胃肠安 60 -12.509±4.512 1.120±0.063
  注:与模型组相比较1)P<005。
显著低于模型组,其差异具有统计学意义(P<
005);此后两组间差距缩小,至第6天差异无统计
学意义(表1)。这一结果与体重增长率的变化趋势
相吻合。据此确定胃肠安丸于用药第 4天止泻作
用最佳 。
32 结肠组织肥大细胞计数 光镜下肥大细胞胞
质被染成紫蓝色,散在分布于黏膜固有层及肌层的
小血管周围,细胞呈圆形或梭形,或形状不规则。与
空白组比较,模型组结肠黏膜肥大细胞计数明显增
多(P<001),与之相对,胃肠安丸高、中剂量组结
肠黏膜肥大细胞计数减少,具有统计学差异(P<
001)(图1,表2)。
33 血清 NO含量 与空白组比较,模型组血清
NO浓度显著降低(P<001),与之相对胃肠安丸
高、中剂量组血清 NO浓度升高,具有统计学差异
(P<001)(表2)。
34 血清5HT浓度 模型组血清5HT浓度较空
白组降低,差异有统计学意义(P<001);胃肠安丸
高、中剂量可有效升高血清5HT浓度,与模型组比
较差异有显著性(P<001),胃肠安丸低剂量也有
升高5HT的趋势,但差异无统计学意义(表2)。不
同剂量胃肠安丸组间比较,高、中剂量组在升高血清
5HT含量方面无显著性差异,中、低剂量组间差异
具有统计学意义(P<005)。
35 结肠组织 SP 模型组 SP含量较空白组升高
(P<005);胃肠安丸高、中剂量组 SP含量与模型
组比较显著降低(P<005)(表2)。
相关性分析显示,结肠黏膜肥大细胞数目的增
多和SP含量的升高呈显著正相关(r=0341,P<
005)。
A空白组;B模型组;C胃肠安高剂量组;D胃肠安中剂量组;E胃肠安低剂量组。
图1 各组结肠肥大细胞甲苯胺蓝染色(TB,×400)
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表2 各组肥大细胞计数,NO,5HT及SP含量比较(珋x±s,n=9)
分组
剂量
/mg·kg-1
肥大细胞
/个/HP
NO
/μmol·L-1
5HT
/μmol·L-1
SP
/ng·g-1
空白  - 150±024 2867±631 576±062 398±109
模型  - 204±0192) 1648±3582) 456±0492) 825±2701)
胃肠安 80 159±0264) 3644±6904) 581±0934) 298±0693)
60 144±0254) 2608±7864) 601±0494) 384±1063)
40 184±041 2076±633 516±057 471±212
  注:与空白组比较1)P<005,2)P<001;与模型组比较3)P<005,4)P<001。
4 讨论
胃肠安丸是治疗胃肠道疾患的微丸制剂,为寒
热并用、攻补兼施之剂,具有芳香化浊、理气止痛、健
胃导滞等功效,符合中医“通因通用”治疗原则,可
用于消化不良、肠炎、腹泻、菌痢、胃脘胀痛、便秘等。
中医学认为泄泻的发生,可因感受寒湿、暑湿、
湿热等外邪引发,或因饮食不节、食积停滞诱发,或
因忧思恼怒、情志失调所致,亦可因久病体虚,年老
体衰导致。基于此,本研究采用高乳糖喂饲模拟饮
食失常、以束缚应激复制精神刺激制作肝脾不调型
复合性腹泻模型,用以探讨胃肠安丸的止泻机制。
为科学、客观的评价药物作用机制,本研究首先
对最佳用药周期进行摸索。结果表明,实验周期内,
胃肠安丸组体重增长率始终高于模型组,腹泻指数
低于模型组。至实验第4天,两组间体重增长率和
腹泻指数的差别达到顶点,第5天组间差距逐渐缩
小。可以确认,胃肠安丸止泻作用于第4天时最为
显著。由此提示,随着实验周期的延长,正气日虚,
邪气渐盛,脾的运化功能进一步减退,导致水谷不能
化为精微,水液不能正常输布,体重持续下降。当体
重增长率大幅下降时,表明动物体质骤降,亦即
“证”发生改变,中医证型进入另一病理阶段,如果
仍然沿用原方,便导致用药不对证,会影响药物疗效
的观察。依据同病异治的原则,当病情进入另一阶
段时,已不是胃肠安丸的适应症,将影响药物作用的
发挥。据此确定,用药周期为4d。将能够准确评价
胃肠安丸止泻作用机制。
在确定最佳用药周期的基础上,进一步研究胃
肠安丸对血清 NO,5HT及结肠组织 SP,MC的影
响。5HT为机体内重要的血管活性物质和神经递
质,生理作用包括激活肠道分泌功能、激活传入神经
元及直接对平滑肌的作用,从而参与胃肠道动力、分
泌和内脏感觉的调控。NO为非胆碱能非肾上腺素
能抑制性神经递质,介导胃肠平滑肌的松弛效应,在
胃肠道蠕动反射中产生下行性抑制作用[6]。MC在
胃肠道有广泛分布,MC脱颗粒可导致内脏感觉阈
值下降;SP等多肽类物质作为神经传递和调节介
质,在调节内脏感觉中也发挥重要作用。感觉神经
末梢兴奋释放的SP等肽类递质,一方面直接作用于
靶细胞,另一方面与肥大细胞表面特异性受体相结
合,激活MC,使后者脱颗粒,释放组胺、前列腺素、
缓激肽、白三烯等炎症介质,引起神经炎症和疼痛,
同时这些物质又会反作用于 SP释放并影响感觉神
经功能[7]。亦有研究证实[8],SP通过直接作用于初
级传入纤维,或间接经由 MC,启动活化和致敏机制
的级联效应,使附近的伤害性感受器产生继发过敏,
从而介导内脏致敏改变。
本研究显示,模型组血清5HT,NO水平下降,
SP含量增加、肥大细胞数目增多;高、中剂量胃肠安
丸可上调血清5HT,NO水平;下调SP表达、减少肥
大细胞数目。据此推测,胃肠安丸止泻的机制可能
与其调节5HT,NO水平,进而参与调整胃肠动力有
关;亦可能通过抑制SP表达、减少肥大细胞数目,从
而降低内脏高敏感性相关。对胃肠安丸止泻机制的
探讨值得进一步深入研究。
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EfectofWeichangAnwanonNOand5HTinbloodserum,SP
andMCincoloninIBSDrats
HURui,TANGFang
(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheinfluenceofWeichangAnwanonthetreatmentofIBSDinmodelratsMethod:An
imalmodelofcompounddiarheawasinducedbyalactoseenricheddietintheWistarrat,combiningwithrestraintstressAtfirst,the
bestcycleoftakingmedicinewastestedInordertodecidethebestcycleoftakingmedicine,24femaleWistarratswererandomlydi
videdintonormalcontrolgroup,modelgroupand60mg·kg-1·d-1weichangangroupTherateofweightincrease,therateofdiar
rhea,theincubationperiodofdiarheaandthediarheaindexwereobservedAndthen45femaleWistarratsrandomlydividedinto
fivegroups:normalcontrolgroup,modelgroupandWeichangAnwangroupsofhigh,mediumandlowdoses(80,60,40mg·kg-1·
d-1)ThemastcelsinmucousmembranewereobservedbylightmicroscopeThelevelofNOinbloodserumwascheckedbythe
methodofnitratereductase5HTinbloodserumwasdetectedbyfluorimetryThelevelofSPincolonwasmeasuredbyradioimmuno
assayResult:AftertakingWeichangAnwanfor4days,therateofweightincreaseinWeichangangroupwashigherthanthemodel
group′sAndtherateofdiarheawaslowersignificantlySothebestcycleoftakingmedicinewas4daysThelevelsofNOand5HT
inbloodserumdecreasedremarkablyinthemodelgroupthanthoseofthenormalcontrolgroupAtthesametime,theamountofthe
mastcelsandthelevelofSPincolonsignificantlyincreasedComparedwiththemodelgroup,thelevelsofNOand5HTinbloodser
umincreasedremarkablyinthegroupsofhighdosesandmediumdosesMeanwhile,theamountofthemastcelsandthelevelofSP
incolondecreasedsignificantlyConclusion:WeichangAnwanhastheefectofantidiarheaItcanadjustthelevelsofNOand5HT
inbloodserumandcaninhibittheexpressionofSPincolonwhichcanactivethemastcelWeichangancanalsodecreasetheamount
ofthemastcelsdirectly
[Keywords] WeichangAnwan;iritablebowelsyndrome;NO;5HT;SP
[责任编辑 古云侠]
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