全 文 ：竹黄无性型菌株产竹红菌甲素的聚类分析
杜文１，孙春龙２，韩燕峰１，梁建东１，梁宗琦１
（１贵州大学 生命科学学院 真菌资源研究所，贵州 贵阳 ５５００２５；
２贵州大学 贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 ５５００２５）
［摘要］ 目的：通过分析４０株竹黄无性型菌株的菌落生长速度、菌落质地、基质菌丝颜色和分离方法，研究竹黄无性型
菌株中这些指标以及它们与竹红菌甲素产量间的相互关系。方法：采用分光光度和显微观察等试验方法以及聚类分析和方
差分析等生物统计方法。结果：通过聚类分析显示，竹黄无性型菌株的不同培养特征与菌株竹红菌甲素含量的相关性有明显
差异。结论：在所试条件下，菌落基质菌丝颜色与菌株竹红菌甲素含量高低有最明显的相关性。
［关键词］ 竹黄；竹黄无性型；竹红菌甲素；聚类分析；菌落特征
［收稿日期］ ２００９１０１６
［基金项目］ 贵州大学引进人才科研项目 ［贵大人基合字（２００７）
０３５号］；贵州省自然科学基金项目 ［黔科合Ｊ字（２００８）２２６６号］；贵
州大学生命科学学院研究生创新基金项目（ＳＫＹ２００７０１）
［通信作者］ 韩燕峰，Ｔｅｌ：（０８５１）８２９７８５６，Ｅｍａｉｌ：ｓｗａｌｏｗ１１２８
＠１２６ｃｏｍ
竹黄菌 ＳｈｉｒａｉａｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａＰＨｅｎｎ又名竹
花、竹三七、竹赤团子等，是一种生长在竹枝上的真
菌，其子实体称竹黄。民间多用竹黄浸酒，用于治疗
风湿性关节炎、坐骨神经痛、跌打损伤及虚寒胃痛、
小儿惊风等，水煎服对急性肝炎恢复期及慢性肝炎
有一定疗效［１］。竹黄菌的主要成分之一竹红菌甲
素是一种
醌类光敏色素物质，其具有抗炎、镇痛、
抗菌、光敏杀伤肿瘤细胞、减轻毒副作用以及抑制肉
芽组织增生等作用。此外，在食品添加剂和新型生
物农药上，竹红菌甲素具有广阔的应用前景［２３］。探
索快速直观筛选竹红菌甲素高产菌株的方法，对生
产和科学研究有理论和经济双重意义。
目前国内，对利用液／固体培养基组分和培养条
件来提高竹红菌素产量的研究报道很多。蔡宇杰等
人研究了固体发酵培养生成竹红菌素适宜的温度、
ｐＨ、最佳的培养基物料厚度及发酵过程的最适的水
份含量等条件，在以玉米粉为基本成分的培养基上，
竹红菌素产量达到４０ｍｇ·ｋｇ－１［４］。石贵阳等和胡
飞等研究了竹黄菌液体培养生成竹红菌素的培养条
件和适宜的培养基［５６］，他们的结果表明其适宜的温
度为２６～２８℃，ｐＨ５５～６０，最适碳源为葡萄糖
（３０ｇ·Ｌ－１），最适氮源为蛋白胨（５ｇ·Ｌ－１）。最
近，Ｙａｎｇ＆Ｈｅ又报道了竹黄菌形成孢外多糖的液
体营养条件［７］。但是，如何通过菌种选育来提高竹
红菌甲素的产量则未见报道。本文将报道通过
ＳＰＳＳ聚类分析方法，探索竹黄无性型菌株的菌落生
长速度、质地、基质菌丝颜色、分离方法等因素与竹
红菌甲素含量高低的相互关系，从中筛选出最密切
相关的影响因子，以期从宏观特征上为有效初筛高
产竹红菌甲素菌株提供科学依据。
１ 材料
１１ 试验用菌株
用于本实验的全部菌株，皆分离于采自浙江省
桐庐县地区的竹黄 Ｓｂａｍｂｕｓｉｃｏｌａ标本。分别编号
为 ＧＺＵＩＦＲ０８１９，ＧＺＵＩＦＲ０８９Ｊ，ＧＺＵＩＦＲＢＺ等。有
性型鉴定和无性型菌株的分离、鉴定按作者的方法
进行［８］。标本和菌株皆保存于贵州大学真菌资源
研究所。
１２ 主要试剂
无水乙醇，葡萄糖，竹红菌甲素（纯度９８％），蛋
白胨，以上试剂均为国产分析纯。
１３ 培养基
ＰＤＡ培养基和查氏培养基均按常规进行配
制［９］。
１４ 乳酸石炭酸棉蓝染色液
苯胺蓝（水溶）００２５ｇ，乳酸１０ｇ，石炭酸（结
晶）１０ｇ，甘油２０ｇ，蒸馏水 １０ｍＬ。
２ 方法
２１ 菌落培养特征观察
２１１ 培养方法 将已经鉴定的菌株试管斜面活
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化２～３次，分别点种于查氏培养基固体平板，２６℃
培养７ｄ。
２１２ 菌落生长速度的测量 用游标卡尺测量接
种４，７，１０ｄ后的菌落直径，比较菌株生长速度。
２１３ 培养特征观察 第７天描述并记录培养特
征和制片进行形态特征观察。菌落形状及高度、生
长速度、菌落表面特征、菌落边缘特征、菌落质地、颜
色、培养基的颜色、气味等。
２２ 分离方法
２２１ 孢子分离 参照梁宗琦［１０］和杜文等［８］的子
囊孢子分离法。
２２２ 组织分离 参照杜文等［８］的方法进行。
２３ 竹红菌甲素的提取
竹黄菌菌丝体采用深层发酵培养。２５０ｍＬ的
培养容器（三角瓶）中加入５０ｍＬ培养液。培养条
件：ＰＤＡ培养基，温度 ２６℃，摇瓶转速为 １２０ｒ·
ｍｉｎ－１。接入直径 ８ｍｍ的菌饼，连续摇瓶７ｄ，待发
酵液中充满灰白色的密集黏滑的菌丝球时终止发
酵。将发酵菌液过滤并用蒸馏水洗涤３次后，将得
到的菌丝体低温烘干后，用无水乙醇对其进行萃取。
２４ 竹红菌甲素的测定
在参照有关竹红菌甲素测定的文献后［４６］，精确
称取竹红菌素甲对照品１０ｍｇ，置于１０ｍＬ量瓶，用
乙醇溶解、摇匀，并定容至刻度，稀释成一系列浓度
的对照品溶液。用紫外分光光度仪在４６５ｎｍ处测
吸 光 值。进 行 回 归 计 算，得 回 归 方 程 为
Ｙ＝０１６６９Ｘ－００００４（Ｒ２＝０９９８４），其中 Ｘ为吸
光值，Ｙ为竹红菌素含量（ｇ·Ｌ－１）。将一定的菌丝
与一定比例的乙醇混合浸提２４ｈ，过滤后得到澄清
提取液，采用分光光度法在４６５ｎｍ波长处测定吸光
度，根据回归方程计算竹红菌甲素的含量。
２５ 数据处理与聚类分析
在培养特征初步观察的基础上，选用４０个菌株
间差别较明显的下列５个特征：Ａ菌落生长速度
（ｍｍ／周）；Ｂ菌落表面质地；Ｃ基质菌丝的颜色；
Ｄ分离方法；Ｅ竹红菌甲素质量浓度（ｍｇ·Ｌ－１），
作进一步分析。用 ＳＰＳＳ１１０软件首先对４０个菌
株选定的特征原始数据标准化，建立相似性矩阵；
选用相关系数或欧氏距离平方，以最短距离邻接法
进行聚类分析和作聚类图。
３ 结果
３１ 无性型菌株的菌落培养特征
竹黄无性型菌株在查式平板上，２６℃ 培养 ４
ｄ，菌落直径超过２５ｃｍ，１０ｄ后菌落直径达６～７
ｃｍ。菌落表面呈絮状或疏松绒毛状，有同心轮带，
白色后呈淡褐色，基质菌丝密致呈深棕色；１４ｄ后，
未见产孢结构。不同竹黄无性型菌株的菌落表面质
地可分为疏松和致密两大类；基质菌丝颜色可分为
黑色、暗红色、赭石色和软木黄色４大类。上述培养
性状在各菌株间差别显著。
３２ ２种分离方法所获菌株的特征
３２１ 组织分离 组织块分离培养５ｄ后，菌落絮
状或绒毛状，在 ＰＤＡ培养基上６ｄ后，菌落背面淡
色至深褐色；１４ｄ后，气生菌丝变稀，颜色由白色转
为浅灰色。
３２２ 孢子分离 ３ｄ后，培养皿上形成肉眼可见
的白色小菌落，７ｄ后菌落扩大，絮状或绒毛状；不
同菌株背面颜色深浅有别。
２种分离方法的成功率、深色基质菌丝百分比
和菌落大小皆有一定差异（表１）。组织分离法的成
功率较高（９０％），但所获菌株基质菌丝深色的则较
低，仅有８％。孢子分离法虽成功率不如前者，仅有
２０％，但获得深色基质菌丝的机率却远大于组织分
离，达到了３３％。镜检观察发现，不少竹黄孢子不
能萌发，要提高孢子分离的成功率，可在显微镜下挑
选已萌发的孢子进行分离。
表１ 竹黄菌２种分离方法比较
分离方法
成功率
／％
深色基质菌丝
／％
菌落生长速度
／ｍｍ·ｄ－１
组织 ９０ ８０ ３３６０
孢子 ２０ ３３０ ２６７８
３３ 聚类分析
菌落培养特征与产竹红甲素的相关性分析的结
果显示，在所选几个培养性状中，基质菌丝的颜色与
竹红菌甲素的含量关系最密切。其次是生长速度和
分离方法，菌落质地和竹红菌甲素含量的相关性不
明显（图１）。
从样品相关性聚类树图中（图２）清楚展现出，
基质菌丝按黑色、软木黄色、赭石色和殷红色，将４０
株竹黄无性型菌株，以相似距离 ６作为聚类分割
点，将参试菌株明显地分成了４个群。其中，基质菌
丝为黑色的一群，竹红菌甲素产量最高，它们都在
３９０～４５０ｍｇ·Ｌ－１。其次是殷红色的一群，竹
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图１ 竹黄无性型菌落特征及分离方法与竹红菌
甲素含量相关性聚类树图
图２ ４０个竹黄无性型菌株产竹红甲素的聚类分析图
红菌甲素产量在２５７～３５７ｍｇ·Ｌ－１；赭石色的类
群为１７０～２５７ｍｇ·Ｌ－１。颜色最浅的软木黄色
群的产量就都在１０ｍｇ·Ｌ－１以下。这些结果充分
显示了，菌株间基质菌丝的颜色与竹红菌甲素产量
的高低有着密切的相互关系，而除色素外在菌株间
的其他所示表型特征与竹红菌甲素产量无明显的相
关性。
４ 讨论
已有报道真菌次生代谢产物的形成常与其生物
学特性有一定的相关性。如裂褶菌 Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｔｕｒｎｍ
ｓｐ形成的各种小肽，只存于子实体中，而不是营养
菌丝；产黄头孢霉 Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（Ｔｈｉｒｕｍ＆Ｓｕｋａ
ｐｕｒｅ）ＷＧａｍｓ形成的头孢霉素则与节孢子形成有
关［１１］。Ｈａｓｓａｌ在研究Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｒｕｇｕｌｏｓｕｓ复杂的分
化合物形成与菌落培养特征的联系时也观察到，菌
落表面的绒毛状的特征与特定的分化合物形成有
关。实验还进一步指出这种表型特征是受基因调控
的［１２］。通过聚类分析，揭示在竹黄菌中，其表型特
征———基质菌丝的颜色差异与竹红菌甲素含量的高
低有明显的相关性。尽管不同的竹黄无性型菌株液
体发酵产竹红菌甲素有明显差异［５６］，聚类分析表明
在相同培养条件下，基质菌丝颜色差异与竹红菌甲
素形成的生理变化具有内在的联系，而不是非遗传
条件的外界因素影响。张灏等在国内为分离获得竹
黄菌菌种，曾将色素的生成作为选择依据［１３］。本研
究工作更进一步表明，基质菌丝颜色不仅可作为菌
种分离的依据，更重要的是可作为初筛高产竹红菌
甲素生产菌株的指标。
在对竹黄无性型分离方法结果分析中发现，组
织分离一般的成功率比较高，且菌丝生长快，操作也
方便。孢子分离的成功率比较低，但是获得基质菌
丝深色的机率较高，这为进一步筛选获得高产竹红
菌甲素菌株提供了可能。已知不少有丝分裂产孢真
菌皆是异核体［１４１６］，它们的分生孢子可分离成不同
基因型的同核体，但也可能是含有不同基因型的异
核的单孢子［１５，１７］。竹黄无性型菌株是否是异核体
虽未见确证的报道，但本实验观察到孢子分离法获
得的不同菌株具有较大产竹红菌甲素的变异性，并
在进一步做摇瓶培养时能产生白色和黑色的菌丝
球，这意味着这些孢子可能具有不同的基因型，所以
单孢子分离法比组织分离法有更多的机率筛选到高
产竹红菌甲素的菌株。
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［责任编辑 吕冬梅］
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