全 文 ：凝胶法检测 * 种中药注射液中内毒素含量
高双荣! 刘婷! 郭静! 易艳! 郝然! 李春英! 曹春雨! 赵雍! 回连强! 梁爱华!
中国中医科学院 中药研究所! 北京 $$%$$#
$摘要%!目的&通过特异性及非特异性鲎试剂法对鱼腥草注射液及清开灵注射液的内毒素含量的检测$探讨特异性鲎试
剂法检测中药注射剂中内毒素的可行性) 方法&采用特异性和非特异性的鲎试剂$对不同批次的鱼腥草注射液&清开灵注射
液进行检测) 结果&特异性及非特异性的鲎试剂均可检测鱼腥草注射液$其无干扰的最小稀释倍数完全一致*用特异性鲎试
剂可以检测清开灵注射液$而用非特异性鲎试剂不能检测) 结论&在检测清开灵注射液内毒素含量时$用特异性鲎试剂代替
非特异性鲎试剂进行检测是一种较为理想的优化方法)
$关键词%!内毒素检测*鲎试剂*鱼腥草注射液*清开灵注射液
$稿件编号%!*$$7*)$$&
$基金项目%!国家自然科学基金项目!7$%$7$&)*科技部国家科技
攻关计划项目!*$$#G3:&G$*国家/重大新药创制0科技重大专项
!*$$7_K$7)$4$$ * 中 国 中 医 科 学 院 自 选 课 题 团 队 建 设
!*$$7_K$7$*4$$
$通信作者%!!梁爱华$RMS#!$$(&**($4**)$U4/BNS#SNB1DBN?TB
2ON1Bg-./
!!内毒素是中药注射剂中的主要致热物质$如中
药注射剂成品中含有一定量的内毒素$轻者可引起
发热$重者可危及生命) 因此$中药注射剂内毒素检
测方法的灵敏性和可靠性直接关系到用药者生命安
全) 鲎试剂内毒素检测法具有简便&快速&敏感性
高&能定量检测&标准化等优点+, $然而对于中药注
射剂$由于干扰因素众多$如真菌中普遍存在的葡聚
糖成分等) 葡聚糖可以在无内毒素存在的情况下活
化鲎变形细胞中的 F因子$产生凝集反应$这与内
毒素通过活化鲎变形细胞的<因子和 G因子$使凝
固酶原转化成凝固酶产生的凝集反应相一致$从而
造成假阳性+*, ) 因此葡聚糖对鲎试剂法的内毒素
检测造成一定的干扰) 目前$国内外已经研制了只
与内毒素反应或只与葡聚糖反应的特异性检测试
剂) 但这些试剂的灵敏性&可靠性如何$对中药注射
剂的检测是否适用$目前尚未见研究报道$值得深入
探讨) 本实验采用非特异性鲎试剂和阻断 F因子
活化途径的特异性鲎试剂$检测了鱼腥草及清开灵
两种中药注射剂中的内毒素含量)
!材料
U!试剂
鲎试剂!厦门市鲎试剂实验厂有限公司$批号
$($)*$ $($)7$ $($*($ $($%*$ $($$ $($&*$
$(*%$$($)**) 显色基质!厦门市鲎试剂实验厂
有限公司$批号 $($*$)) 细菌内毒素工作对照品
!厦门市鲎试剂实验厂有限公司$批号 $%*$)$
$($)$) 细菌内毒素检查用水!规格 * /` $厦门市
鲎试剂实验厂有限公司$批号 $($*$*规格 $ /` $
中国生物制品检定所$批号 *$$#$$**规格 $ /` $
厦门市鲎试剂实验厂有限公司$批号 $%**() 反
应中止液 !厦门市鲎试剂实验厂有限公司$批号
$($$$($$() 偶氮化试剂 $偶氮化试剂 *$偶
氮化试剂 )$F因子抑制剂均购自厦门市鲎试剂实
验厂有限公司$ 批号分别 为 $($#$ $($#$
$($%$$($*#)
U!检测样品
鱼腥草注射液!福建三爱药业有限公司$批号
$($$*$$($$$$($$)*正大青春宝药业有限公司$
批号 $($7$7$$($7$7**三九药业有限公司$批号
$%$#$*) 清开灵注射液!北京中医药大学药厂$批
号 ($)$)3$($)3$$($)%*山西太行药业有限公
司$批号 $($(*$*河北神威药业有限公司$批号
$%$(#))
U&!仪器
[BCN.OZB1 HSBO? 型多功能酶标仪!美国 R?MC/.
公司)
!方法
U!细菌内毒素限值 ! D及最大有效稀释倍数
!9[I的确定
UU!细菌内毒素限值!D的确定!细菌内毒素
.$&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
限值 D采用公式 DfRUB计算) 式中 D为中药注射
液的细菌内毒素限值$以 U]./` e表示$R为人每
公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量$以U].
!ZD.?
e表示$注射剂 Rf U].!ZD.Y e*B
为人每公斤体重每小时的最大给药剂量$以 /D.
!ZD.Y
e表示)
UU!9[I的确定!9[IfDU
%
计算) 式中 D
为细菌内毒素限值*为供试品溶液的浓度$以 U]
./`
e表示*
%
为鲎试剂的标示灵敏度$以 U].
/`
e表示)
U!非特异性鲎试剂法检测
UU!鲎试剂灵敏度复核!依照 *$$ 年版中国
药典( !二部附录 K:U细菌内毒素检查法+), $用
GUR水将细菌内毒素工作用品依法溶解成 *g$$
g$$$g$$g*
%
等 & 个浓度$取 # 管分别加入 $g
/` 不同浓度的细菌内毒素溶液$每个内毒素浓度平
行做 & 管$再取 * 管加入 $g /` GUR水作为阴性对
照) 混匀后 )% h保温 #$ /N1$按凝胶法判断结果并
计算鲎试剂灵敏度测定值
%
$当鲎试剂灵敏度#$g
%%

*g$
%
时$可用于细菌内毒素检查)
UU!非特异性鲎试剂法对鱼腥草注射液&清开灵
注射液的干扰试验!用 GUR水将细菌内毒素工作
用品依法溶解并稀释成 &g$$*g$$g$$$g
4
等 & 个
浓度$取 # 管分别加入不同浓度的细菌内毒素溶
液$每个内毒素浓度平行做 & 管$再取 * 管加入 $g
/` GUR作为阴性对照管!;E<管) 同时设供试样
品的阳性对照管!EE<管) 再加入不同批号$已通
过干扰预实验的清开灵注射液&鱼腥草注射液$使中
药注射剂的终浓度同干扰预实验中的无干扰浓度)
取鲎试剂若干支$加GUR水溶解$轻轻摇动$使充分
溶解$以上试管中各加入鲎试剂溶液 $$

)` 混匀
后 )% h保温 #$ /N1$按药典凝胶法判断结果$只有
当 $g
%
F
&

*g$
%
及 $g F
&

F
!

*g$ F
&
时$认
为供试品在该浓度下无干扰作用!F
&
$F
!
分别为GUR
水或供试品溶液配制的一系列含内毒素不同浓度溶
液的反应终点浓度的几何平均值)
UU&!凝胶法限量检测试验!使用稀释倍数为最
小无干扰浓度并且已经排除干扰的鱼腥草注射液&
清开灵注射液制备溶液 3和 G!表 $用检查用水
制备溶液<和I分别作为阳性对照和阴性对照$以
标示灵敏度为 $g$) U]./` e的鲎试剂对以上 * 种
注射液的不同批次进行检测)
表 !凝胶限量试验溶液的制备
;., 内毒素浓度=配制内毒素的溶液
3 无=供试品溶液
G *
4
=供试品溶液
< *
4
=检查用水
I 无=检查用水
注#3,供试品溶液!鱼腥草注射液&清开灵注射液*G,供试品阳性对
照*<,阳性对照*I,为阴性对照*平行管数为 *)
结果判断#保温!#$ p*/N1后观察结果) 若阴
性对照溶液I的平行管均为阴性$供试品阳性对照
G的平行管均为阳性$阳性对照溶液 <的平行管均
为阳性$试验有效)
若溶液3的 * 个平行管都为阴性$结果计为阴
性*若溶液3的 * 个平行管均为阳性$结果计为阳
性) 若溶液3的 * 个平行管中的一管为阳性$另一
管为阴性$需进行复试) 复试时$溶液 3需做 & 支
平行管$若所有平行管均为阴性$结果计为阴性*否
则结果计为阳性)
U&!特异性鲎试剂法检测
鲎试剂用F因子抑制剂溶解$其余按 U 所述
方法进行鲎试剂灵敏度复核&干扰试验及样本的检
测)
&!结果
&U!细菌内毒素限值 ! D及最大有效稀释倍数
!9[I的计算
根据一些中成药手册及药品说明书$鱼腥草注射
液用 $j葡萄糖注射液!或 $,7j氯化钠注射液$$
/` 稀释$人用最大剂量为每次 $$ /` *清开灵注射
液用 $j葡萄糖注射液!或 $,7j氯化钠注射液*$
/` 稀释$人用最大剂量为每次 &$ /` ) 成人按平均
体重 #$ ZD计算$静脉滴注 $$ /` 按 *, ?$*$ /`
按 g ?或 ?计算!临床上很多病人 *$ /` 液体均
在 ?内输完) 考虑输液所用的葡萄糖或氯化钠注
射液中可能有的内毒素限量!大输液的内毒素限量值
F`8 f$, U]./`
e
$按联合用药计算$得出鱼腥草
注射液和清开灵注射液的细菌内毒素限值!D均为
$最大有效稀释倍数!9[I均为 (),)倍)
&U!非特异性鲎试剂检测
&UU!鲎试剂的灵敏度复核!对 % 个批号的不同
灵敏度鲎试剂进行复核$结果见表 *$所用鲎试剂灵
敏度均在规定范围内)
&UU!非特异性鲎试剂的干扰试验!鱼腥草注射
.#$&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
!!
表 *!鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂批号 标示灵敏度 复核灵敏度 灵敏度规定范围
$($*( $g$#$ $g$#$ $g$)$ k$g*
$($)* $g$#$ $g$&) $g$)$ k$g*
$($%* $g$#$ $g$)$ $g$)$ k$g*
$($)7 $g$)$ $g$)$ $g$ k$g$#$
$($ $g$)$ $g$)$ $g$ k$g$#$
$(*% $g$#$ $g$)$ $g$)$ k$g*$
$7$&* $g$)$ $g$ $g$ k$g$#$
!!注#结论均为合格)
液稀释 & 倍即可消除干扰$远远低于 9[I$用一般
性鲎试剂可以进行检测*清开灵注射液在 &$$ 倍稀
释时$才能消除干扰$远远大于9[I$用非特异性鲎
试剂不能进行检测$见表 ))
&UU&!凝胶法检测鱼腥草注射液及清开灵注射
液内毒素含量!鱼腥草注射液的最小无干扰浓
度均在 9[I之下$用该法可以进行检测$除 个
批号的鱼腥草!$($7$7注射液为阳性外$其余
均为阴性$检测结果为阳性的批号进一步稀释
后$结果亦为阴性$均在药典规定的内毒素限量
值之内) 清开灵注射剂在最小无干扰浓度下可
以进行检测$检测结果也较稳定$但其稀释倍数
已超出 9[I$见表 &)
&U&!特异性鲎试剂检测
&U&U!灵敏度复核试验!对 个批号的不同灵敏
度的鲎试剂分别进行了灵敏度复核试验$复核灵敏
度均在规定范围内$结论均为合格$见表 )
表 )!非特异性鲎试剂检测 * 种注射液稀释后的干扰试验!按稀释倍数排列
品种 药品批号 稀释倍数 鲎试剂批号 F
&
F
!
$g$$ k*g$$$F
&
结论
鱼腥草注射液 $($$* * $($)* $g$&) $g$* $g$** k$g$(# 有干扰
$%$#$* * $($$& $g$$ g$$$ $g*$ kg$$$ 无干扰
$%$#$* $($$& $g$$ $g%$ $g*$ kg$$$ 无干扰
$($$* & $($)7 $g$)$ $g$)$ $g$ k$g$#$ 无干扰
清开灵注射液 ($)$)3 )$$ $($*( $g$# $g$ $g$)$ k$g*$ 有干扰
($)$)3 &$$ $($*( $g$# $g$)$ $g$)$ k$g*$ 无干扰
($)$)3 &$ $($%* $g$# o$g$)$ $g$)$ k$g*$ 有干扰
($)$)3 ($ $($%* $g$# o$g$)$ $g$)$ k$g*$ 有干扰
!!注#在预试验中选用的鲎试剂的灵敏度为 $g$# U]./` e$故在此9[I以灵敏度为 $g$# U]./` e计算结果为 ($)
表 &!凝胶法检测 * 种中药注射液细菌内毒素含量
品种 药品批号 稀释倍数 鲎试剂批号 标示灵敏度
鱼腥草注射液 $($$ * $($ $g$)
$($$) * $($ $g$)
$($$* & $($)7 $g$)
$($7$7 * $($&* $g$)
$($7$7 & $(*% $g$#
$($7$7 ( $(*% $g$#
$($7$7* * $($&* $g$)
清开灵注射液 ($)3 &$$ $(*% $g$#
$%$(#) &$$ $(*% $g$#
($)$)3 &$$ $($*( $g$#
$($(*$ &$$ $($&* $g$)
$($)% &$$ $($&* $g$)
!!注#检查结果均为阴性)
表 !鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂批号 标示灵敏度 复核灵敏度 灵敏度规定范围
$($)** $g$)$ $g$#$ $g$ k$g$#$
$($%* $g$#$ $g$)$ $g$)$ k$g*$
$($)7 $g$)$ $g$)$ $g$ k$g$#$
$($ $g$)$ $g$)$ $g$ k$g$#
$7$&* $g$)$ $g$ $g$ k$g$#
&U&U!特异性鲎试剂的干扰试验!清开灵注射液
无干扰的最小稀释倍数由表 ) 中的 &$$ 倍变为 $
倍无干扰$见表 #$因此$清开灵注射液采用特异性
鲎试剂检测法可以通过稀释法进行检测) 而鱼腥草
注射液的无干扰的最小稀释倍数与表 ) 中的检测结
果一致$说明鱼腥草注射液用一般性的鲎试剂检测
法和特异性鲎试剂检测法均能检测)
.%$&.
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!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
表 #!特异性鲎试剂法检测 * 种中药注射液的干扰试验
品种 药品批号 稀释倍数 鲎试剂批号 F
&
F
!
$g$$ k*g$$$ F
&
结论
鱼腥草注射液 $($$* $($)** $g$#$ $g$% $g$)$ k$g*$ 有干扰
$($$* * $($)** $g$#$ $g$% $g$)$ k$g*$ 有干扰
$($$* & $($)** $g$#$ $g$)$ $g$)$ k$g*$ 无干扰
清开灵注射液 ($)$)3 $($%* $g$#$ r$g*$ $g$)$ k$g*$ 有干扰
($)$)3 $ $($%* $g$#$ $g*$ $g$)$ k$g*$ 无干扰
($)$)3 *$ $($%* $g$#$ $g$#$ $g$)$ k$g*$ 无干扰
($)$)3 &$ $($%* $g$#$ $g$#$ $g$)$ k$g*$ 无干扰
($)$)3 ($ $($%* $g$#$ $g*$ $g$)$ k$g*$ 无干扰
&U&U&!凝胶法检测鱼腥草注射液及清开灵注射液
内毒素含量!采用特异性鲎试剂代替普通鲎试剂$
对不同厂家不同批次的鱼腥草注射液&清开灵注射
液进行检测$在最大有效稀释倍数之内均可进行细
菌内毒素含量的检测$检测结果稳定$且有较好的重
复性) 样本检测结果均为阴性$样本内毒素含量均
较低$符合药典限量的规定$见表 %)
表 %!凝胶法检测 * 种中药注射液细菌内毒素
注射液品种 药品批号 稀释倍数 鲎试剂批号
鱼腥草 $($$ * $($
$($$) * $($
$($$* & $($)**
$($7$7 * $($&*
$($7$7* * $($&*
清开灵 ($)3 $ $($
$%$(#) $ $($
($)$)3 $ $($)7
$($(*$ $ $($&*
$($)% $ $($&*
!!注#检查结果均为阴性*标示灵敏度均为 $g$))
_!讨论
应用非特异性的鲎试剂法检测内毒素的原理是
利用鲎变形细胞溶解产物与内毒素混合后$通过活
化鲎变形细胞的<因子和G因子$使凝固酶原转化
成凝固酶产生凝集反应$从而可检测内毒素含
量+), ) 然而$除了内毒素可以与鲎试剂反应外$葡
聚糖成分也可以在无内毒素存在的情况下活化鲎变
形细胞中的F因子$也可以使凝固酶原转化成凝固
酶产生凝集反应$从而呈现假阳性+&4, ) 9N5BWBZN+#,
报道 $ 1D.`e的
!
N3葡聚糖就会使常规的内毒素
检查呈阳性) 而葡聚糖成分在真菌中普遍存在$中
药注射剂原料药材在生产&包装&运输&贮藏的过程
中$极易污染真菌) 9N5BWBZN+#,对 *7& 份$*%7 种常
用中药饮片真菌污染情况调查$污染率高达
7%g#j) 某些植物也含有葡聚糖$但其不是致热原)
因而$葡聚糖是鲎试剂法检测内毒素的一个很重要
的干扰因素)
本试验采用特异性及非特异性鲎试剂对鱼腥草
和清开灵 * 种中药注射液进行了检测) 结果显示$
在非特异性鲎试剂检测中干扰较小的鱼腥草注射
液$其无干扰的最小稀释倍数$特异性与非特异性鲎
试剂法检测结果完全一致*而对检测干扰较大的清
开灵注射液$采用稀释法无法消除干扰$用非特异性
鲎试剂无法进行检测$但采用特异性鲎试剂$其无干
扰的最小稀释倍数为 $ 倍$可以用特异性的鲎试剂
法进行检测) 说明在细菌内毒素检测中干扰因素较
多的清开灵注射液用特异性鲎试剂代替非特异性鲎
试剂进行检测是一种较为理想的优化方法)
初步研究结果认为注射液中的多糖成分影响了
清开灵注射液的检测$在对清开灵及鱼腥草注射液
多糖成分检测时发现$以上批号的鱼腥草注射液多
糖检测结果均为阴性$而 ($)3$$($(*$$$($)%)
个不同厂家的清开灵注射液中均含有多糖$质量分
数分别为 %g%$)g#7$#g*( D.`e+%, $故采用只能活
化G$<途径的特异性鲎试剂能有效的消除这种干
扰$使在9[I的范围内通过稀释即能进行检测$且
检测结果稳定)
$参考文献%
+,!廖晓玲$于巧梅$黎海英$等,鲎试验在医药学领域的研究应用
+V,,解放军药学学报$*$$)$7!#)7%,
+*,!夏振民$刘大英,异鲎试剂研究进展+V,,药物分析杂志$
77%$%!###,
+),!中国药典,二部+8,,*$$#(,
+&,!夏振民$刘大英,特异鲎试剂研究进展+V,,药物分析杂志$
77%$%!###,
+,!张永坚$冯聚锦,
!
4葡聚糖与内毒素共同作用对细菌内毒素检
.($&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
查的影响+V,,中国药品标准$ *$$*$#!)#))#,
+#,!9N5BWBZNR$J.?1.8$9N@OT@BZMJ$M@BS, N`/TSTO@MO@!PB-@.CF
B1Q A.S5OB--?BCNQMOPC./ PT1DTO+V,,JB1OM1O?.DBZT _BOO?N$
77*$##!(#$)$,
+%,!王宏洁$李鹏跃$刘婷$等,苯酚4硫酸法测定清开灵注射液中
总多糖的含量+V,,中国实验方剂学杂志$*$$7$!#),
0@AB?ABF?B?RB.@A@JL-RB?E.-/?AF@B@N.A.ABZ@ W.AFI@J
.A[?RB.@ALD S?/-B.AB?RCA.VG?
F3L8?TB1DC.1D$ :`]RN1D$ F]LVN1D$ a:aB1$ Y3L>B1$ :`_Y3La.1D$ Y]:`NB1bNB1D$ :`3;F3N?TB
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+ ?^D Z@EFI, !QM@M-@N.1 .P\B-@MCNBSM1Q.@.6N1* @B-?5ASMTOB/M\.-5@MS5OB@M@M-?1NbTM* aT6N1D-B.N10M-@N.1* N^1DZBNSN1DN10M-4
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$责任编辑!周驰%
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