全 文 ：盐酸小檗碱的含量甚至达到或超过一些小檗属植物
根的含量［９］。因此作者在利用云南黄连根茎的同
时，也要积极开发利用其非传统药用部位，通过提取
其生物碱减少资源的浪费，实现可持续发展。
［参考文献］
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［责任编辑 张宁宁］
［收稿日期］ ２００７０１０９
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（２０５０６０２７）
［通讯作者］ 袁晓凡，Ｔｅｌ：（０１０）６２５７４３７２，Ｅｍａｉｌ：ｙｕａｎｘｆ９９＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
ＨＰＬＣ分析天山雪莲组培苗与实生苗３种有效成分含量
欧 元１，２，袁晓凡１，陈文浩１，２，赵 兵１，王晓东１，王玉春１
（１．中国科学院 过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 １０００８０；
２．中国科学院 研究生院，北京 １０００４９）
菊科植物天山雪莲，又称新疆雪莲Ｓａｕｓｕｒｅａｉｎ
ｖｏｌｕｃｒａｔａＫａｒ．ｅｔＫｉｒ，属多年生的高山草本植物，５～
８年一次开花结实，是我国珍稀名贵中药材，具有极
高的临床应用和食疗保健价值。近年来，天山雪莲
在抗炎镇痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌细胞增生方面
的作用备受关注［１］。由于严重的滥采乱挖，野生资
源已经濒临灭绝，远远无法满足市场需求，而且野生
天山雪莲种子自然萌发率极低，难于收集，现已被国
家作为濒危植物受到保护。因此，组织培养与人工
种植成为保护野生天山雪莲资源和解决供需矛盾的
有效途径。目前，国内已开展了不少有关天山雪莲
组织培养的研究［２５］，人工种植天山雪莲也已取得初
步成果［６］。而组培再生植株与人工种植植株的品
质如何，能否真正替代野生天山雪莲，尚缺乏系统的
研究工作。本实验采用 ＨＰＬＣ，测定了天山雪莲组
培苗、实生苗中３种有效成分的含量，并与野生药材
进行比较，进行早期监测，为组织培养和人工种植途
径实现天山雪莲资源的可持续利用提供依据。
１ 仪器与材料
高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ２６９５），配自动进样
器，四元泵，柱温箱，二极管阵列检测器（Ｗａｔｅｒｓ
２９９６），Ｅｍｐｏｗｅｒ色谱工作站；ＴＤＬ－５－Ａ型低速台
式离心机（上海安亭科学仪器厂）；超纯水器（美国
Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司）。
甲醇、乙腈（色谱纯，Ｊ＆ＫＣｈｅｍｉｃａｌ）；无水甲醇、
醋酸（分析纯，北京化工厂）；三乙胺（分析纯，北京
化学试剂公司）；超纯水；芦丁、绿原酸对照品（中国
药品生物制品检定所，批号 ００８０２００１０５，１１０７５
２００３１２）；紫丁香苷（安徽 ＤＥＬＴＡ公司，纯度 ＞
９８％）；天山雪莲对照药材（中国药品生物制品检定
所，批号１２１２０５０１０１）；天山雪莲组培苗、实生苗由
本实验室培育，后经移栽，在新疆天池雪莲种植基地
种植２年以上。
２ 方法与结果
２．１ 色谱条件 ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８柱（４６ｍｍ×２５０
ｍｍ，５μｍ）；安谱 Ｃ１８保护柱。流动相甲醇水（含
０８％醋酸，０２％三乙胺，ｐＨ３５～４０）初始条件
（０∶１００）０～５ｍｉｎ线性梯度变至（１０∶９０），５～１５
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中 国 中 药 杂 志
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ｍｉｎ线性梯度变至（３０∶７０），１５～３５ｍｉｎ线性梯度变
至（５０∶５０），３５～５０ｍｉｎ线性梯度变至（９０∶１０），等
强洗脱１０ｍｉｎ后，回到初始条件平衡１５ｍｉｎ。检测
波长２７０ｎｍ，柱温３０℃，流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１，进样
量２０μＬ，分析时间６０ｍｉｎ。绿原酸、紫丁香苷、芦
丁３种对照品的保留时间分别为 １８２７，１９５１，
３５１３ｍｉｎ（图１）。
２．２ 检测波长的选择 采用二级管阵列检测器对
检测波长进行了考察，分别比较绿原酸、紫丁香苷、
芦丁混合对照品在２２０～４００ｎｍ波长的色谱图，结
果在２７０ｎｍ处各色谱峰均有较好的紫外吸收，色谱
信息最为丰富，并且３种对照品在此波长下都有最
大吸收峰，因此选择２７０ｎｍ作为检测波长。
２．３ 供试品溶液的制备 植物材料经烘箱５０℃干
燥至恒重后，用粉碎机粉碎，过４０目筛后精确称取
样品粉末０１ｇ。在密闭容器中经１０ｍＬ７０％甲醇
超声提取４０ｍｉｎ后，４０００ｒｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，用
０２０μｍ有机相针式滤器过滤后取续滤液进行色谱
分析。
２．４ 流动相的选择 天山雪莲含有多种化学成分，
如黄酮、生物碱、内酯、甾醇、多糖等活性物质，成分
较为复杂，很难找到较理想的等度洗脱条件，故采用
梯度洗脱。黄酮类成分含有多个酚羟基，呈弱酸性，
故使用酸性缓冲系统［７］。预实验发现用甲醇０８％
醋酸，添加０２％三乙胺防拖尾剂做流动相，在线性
梯度下各组分得到较好分离。
２．５ 线性关系考察 分别用甲醇精确配制绿原酸、
紫丁香苷、芦丁６个质量浓度的对照品溶液，用ＨＰＬＣ
进行分析，进样量为５μＬ。以对照品进样含量（μｇ）
为横坐标 Ｘ，色谱峰面积为纵坐标 Ｙ计算回归方程
（表１）。各对照品在所示进样含量范围内线性关系
良好。
表１ 对照品回归方程
对照品 回归方程
线性范围
／μｇ
ｒ
绿原酸 Ｙ＝３６０×１０５Ｘ－１５９×１０４ ０１２～４６４ ０９９９３
紫丁香苷 Ｙ＝１７０×１０６Ｘ＋４５４×１０３ ００５～１２３ ０９９９７
芦丁 Ｙ＝７０６×１０５Ｘ＋３２５×１０４ ０１２～４８０ ０９９９３
２．６ 精密度试验 取质量浓度均为１０μｇ·ｍＬ－１
的绿原酸、紫丁香苷、芦丁混合对照品溶液，重复进
样６次，进样量为２０μＬ，测定峰面积，３种对照品
ＲＳＤ分别为１１％，１０％，１１％，表明仪器精密度
良好。
２．７ 稳定性试验 精确称取天山雪莲对照药材粉
末０１ｇ，制备成供试品溶液，在室温下放置，分别于
０，１，４，８，１２，２４ｈ进样分析，进样量为２０μＬ，分别
测定绿原酸、紫丁香苷、芦丁峰面积，ＲＳＤ分别为
１４％，１２％，１１％，表明样品溶液制备后２４ｈ内
基本稳定。
２．８ 重复性试验 精确称取同一批天山雪莲对照
药材粉末各０１ｇ，同法制备６个供试品溶液分别进
样分析，进样量为２０μＬ，测定峰面积，结果样品中
绿原酸、紫丁香苷、芦丁平均含量分别为 ０７３％，
００２％，０７９％；ＲＳＤ分别为 １３％，１２％，１４％，
表明重复性良好。
２．９ 回收率试验 精密称取已知含量的天山雪莲
对照药材粉末０１ｇ共６份。精确加入浓度已知的
绿原酸、紫丁香苷、芦丁混合对照品溶液，按供试品
溶液制备方法制备样品溶液，进样测定，各测定成分
的平均回收率在９９％～１００％，表明回收率良好，结
果见表２。
２．１０ 样品测定与色谱图比较 取上述方法制备的
天山雪莲组培苗与实生苗样品提取液，利用高效液
相色谱仪进行分析，进样量为２０μＬ，记录色谱图，
各样品中绿原酸、紫丁香苷、芦丁含量测定结果见表
３。移栽前组培苗绿原酸、紫丁香苷含量低于实生
苗，芦丁含量高于实生苗。移栽种植两年后的天山
雪莲组培苗与实生苗绿原酸含量分别为 ０８４％，
０７０％；芦丁含量分别为０５４％，１８０％，均高于药
典≥０１５％ 的要求［８］。紫丁香苷含量分别为
０５９％，０６４％远远高于对照药材。经过对各色谱
图的比较（图２，图３），发现移栽大田后各有效成分
的含量均显著升高，代谢产物种类增多。植物次生
代谢产物的合成，其最重要的原因就是提高植物体
对多变的自然环境的适应性［９］，试管苗生长条件比
较单一，其合成的次生代谢产物种类也就相对减少。
因此组培苗与实生苗有效成分移栽前少于移栽后是
很正常的。从图２可以看出，移栽种植两年后天山
雪莲组培苗、实生苗与对照药材谱图大致相同，成分
组成基本相似。
３ 讨论
ＨＰＬＣ能够比较精确地检测出样品的成分种类
和含量差异。从结果分析来看，天山雪莲组培苗、实
生苗与对照药材色谱图大致相同，成分种类基本相
似，绿原酸、芦丁含量均高于药典≥０１５％的要求。
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表２ 天山雪莲中绿原酸、紫丁香苷、芦丁的加样回收率
成分 称样量／ｇ 样品中含量／μｇ 加入量／μｇ 测得量／μｇ 回收率／％ 平均值／％ ＲＳＤ／％
绿原酸 ０１０２３ ７４６８ ７５０３ １４９７９ １００１ １０００ ０１２
０１１２７ ８２２７ １５７２６ １０００
０１０９４ ７９８６ １５４８７ １０００
０１０１５ ７４１０ １４９２２ １００１
０１０８６ ７９２８ １５４３８ １００１
００９９２ ７２４２ １４７３２ ９９８
紫丁香苷 ０１０２３ ２０４６ ２０１６ ４０３８ ９８８ ９９４ １４
０１１２７ ２２５４ ４２３２ ９８１
０１０９４ ２１８８ ４１８９ ９９３
０１０１５ ２０３０ ４０５４ １００４
０１０８６ ２１７２ ４２２３ １０１７
００９９２ １９８４ ３９６３ ９８２
芦丁 ０１０２３ ８０８２ ８０７２ １６１５４ １０００ １０００ ００４
０１１２７ ８９０３ １６９７１ １０００
０１０９４ ８６４３ １６７１９ １００１
０１０１５ ８０１９ １６０９１ １０００
０１０８６ ８５７９ １６６４８ １０００
００９９２ ７８３７ １５９０４ １０００
表３ 不同样品绿原酸、紫丁香苷、芦丁质量分数（ｎ＝５） ％
成分
移栽前
组培苗
移栽前
实生苗
移栽后
组培苗
移栽后
实生苗
对照药材
绿原酸 ０４７ ０５５ ０８４ ０７０ ０７３
紫丁香苷 ０５３ ０６２ ０５９ ０６４ ００２
芦丁 ００８ ００６ ０５４ １８０ ０７９
图１ 对照品色谱图
图２ 移栽前组培苗（Ａ）与实生苗（Ｂ）色谱图比较
１．绿原酸；２．紫丁香苷；３．芦丁（表３同）
之所以对组培苗和实生苗进行分析，是为了得到更多
组培快繁与人工种植天山雪莲的数据资料，对他们起
到早期监测作用，并为分析其成熟植株的后续工作打
下基础，来解决野生资源保护与开发之间的矛盾。今
图３ 移栽后组培苗（Ａ）、实生苗（Ｂ）与天山雪莲对
照药材（Ｃ）色谱图比较
后在天山雪莲细胞培养阶段可采用代谢调控与诱变
筛选技术，定向诱导提高有效成分的含量，培育新品
种，实现天山雪莲品质的稳定性和可持续利用。
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［责任编辑 张宁宁］
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