全 文 ：半夏内生菌的分离与初步鉴定
刘建玲１，陈宝宝１，刘永红２，郑姜彬１，梁宗锁２
（１．西北大学 生命科学学院，陕西 西安 ７１００６９；
２．西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨陵 ７１２１００）
［摘要］ 目的：探讨半夏内生菌类群的多样性。方法：采用平板分离法分离半夏的内生真菌、细菌、放线菌，同时采用点
植法、插片法和印片法对分离真菌菌株进行分类鉴定。结果：从多年生和一年生的半夏根茎叶样品中共获得内生菌８４株，其
中内生真菌４８株、细菌３１株、放线菌５株，内生真菌经形态观察分类鉴定为４科、１５属。结论：半夏内生菌多样性丰富，同时
不同部位内生菌的数量、种类及分布存在差异。
［关键词］ 半夏；内生菌；分离鉴定
［收稿日期］ ２００８１２２５
［基金项目］ 教育部新世纪优秀人才支持计划项目；西北农林科技
大学学科带头人支持计划项目
［通信作者］ 刘建玲，Ｔｅｌ：１３９９１８７９６６８，Ｅｍａｉｌ：ｌｊｌ２００３ｌｊｌ＠１２６．
ｃｏｍ
半夏为天南星科半夏属植物半夏Ｐｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａ
ｔａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｂｒｅｉｔ的干燥块茎，药用历史悠久，首载
于《神农本草经》，具有降逆止呕、燥湿化痰、消痞散
结等功效，是中国的传统中药［１２］。半夏含有多种有
效成分，其中包括生物碱、谷甾酸、多糖、氨基酸、挥
发油、半夏蛋白及无机元素等［３］。目前有关于半夏
的有效成分、药理、药效的研究报道较多，但至今鲜
见从半夏根茎叶分离内生菌及其内生菌种群多样性
的研究报道。根据内生菌和植物互惠共生的关系，
本研究对人工栽培半夏进行内生菌的分离，探讨半
夏在特定生境不同器官中内生菌的多样性。
１ 材料
１．１ 植物来源 半夏材料包括人工栽培半夏以及
野生半夏，前者采自杨凌西北农林科技大学植物试
验田和商洛天士力集团植物试验田，后者采自安康
镇坪县。
１．２ 培养基［４］ ＰＤＡ培养基（马铃薯葡萄糖培养
基）＋链霉素（用于分离真菌）；肉膏蛋白胨培养基
（用于分离细菌）；高氏一号培养基（用于分离放线
菌）；ＭＳ培养基（用于分离）；查氏培养基，促孢培
养基（用于真菌的初步鉴定）。
２ 方法
２．１ 内生真菌的分离［５８］ 取半夏新鲜根、茎、叶，
将根、茎截成１０ｃｍ的小块，叶剪成１ｃｍ×１ｃｍ的
小块，在７５％乙醇中迅速润洗１ｍｉｎ左右，无菌水漂
洗３次后用０１％升汞消毒，根、叶消毒５ｍｉｎ，块茎
消毒８ｍｉｎ，最后用无菌水冲洗３次，去边缘，放在灭
菌的滤纸片上，待水吸干后接种在加有链霉素的
ＰＤＡ平板培养基上，２８℃ 培养３～４ｄ，待切口边缘
长出菌丝后，取菌落边缘部分转到新的ＰＤＡ培养基
上，纯化培养３次左右后编号并接种到 ＰＤＡ试管斜
面培养５～７ｄ后，放入冰箱４℃保存。实验中设立
对照：吸取少量表面消毒中最后一次冲洗材料的无
菌水，涂布于培养基上，经培养若无微生物长出，表
明表面消毒彻底，分离到的是内生菌。
２．２ 内生细菌和放线菌的分离纯化［９１０］ 称取适
量组织材料按上述方法表面消毒后，无菌条件下加
１０ｍＬ无菌水充分研磨，将组织研磨液梯度稀释成
组织稀释液，分别取适量涂布到肉膏蛋白胨和高氏
一号培养基上，２８℃培养待菌长出后，根据培养基
平板上长出菌落的形态、颜色、大小等挑取不同的单
菌落纯化后保存，同时设立对照试验。
２．３ 内生真菌的初步鉴定［４，１１］ 真菌鉴定按常规
方法进行。挑取纯化的菌株尖端菌丝接种于查氏培
养基和产孢培养基上，培养一段时间后按如下方法
观察菌落、菌丝体和孢子的形态特征并进行鉴定。
细菌和放线菌主要观察其菌落形态不做鉴定。
点植培养法（观察菌落及常规镜检）用接种针
从斜面上取少量孢子，点植于平板上适当的位置，倒
置于恒温箱中，２８℃培养４，７，１０ｄ，观察菌落特征。
取少量菌丝，用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，进行常
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规镜检。
插片法（观察基内、外气生菌丝）将真菌接种到
平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使真菌菌丝沿着培
养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片
上。观察时轻轻取出盖玻片，置载玻片上直接观察。
印片法（观察孢子及菌丝体形态）将要观察的
菌落先印在盖玻片上，放置在滴有少量乳酸石炭酸
棉蓝染色液的载玻片上直接观察。
３ 结果
３．１ 半夏内生菌种属 采集了多年生和一年生半
夏根、茎、叶来分离内生菌，分离获到内生菌８４株，
其中内生真菌４８株，细菌３１株，放线菌５株，见表
１。内生真菌经微生物学形态观察，初步鉴定分属于
的１５个属，见表２。内生细菌经革兰氏染色有 １６
种为革兰氏阳性，１５种为阴性，几乎各占一半，从而
说明了半夏内生菌的多样性比较丰富。同时，在植
物体内微环境中，不同的微生物能相互作用，并建立
一种平衡，在植物体内形成一种相对稳定的微生物
菌群，其中一些是分离频率高，数量大的优势菌种，
而另一些属于稀有种。例如内生真菌中棒孢霉属、
镰孢霉属和青霉属为优势种群，所占比例分别为
２２９％，１８８％，１４６％，而暗串孢霉、枝顶孢霉等属
只有１株，为稀有种。
表１ 半夏根茎叶内生菌分离 株
类型 块茎 根／株 叶／株 合计／株
真菌 ２４ ７ １７ ４８
细菌 １１ ９ １１ ３１
放线菌 ３ ２ ０ ５
表２ 半夏内生真菌种类
属 主要特征 数目／株
棒孢霉 菌落苍绿色或灰绿色，菌丝发达；分生孢子梗基部有膨大；分生孢子顶生褐色，呈倒棍棒状，为多细胞 １１
青霉 菌落由白色变为绿色，表面干燥；分生孢子梗细长顶端排列成帚状；分生孢子串成链状，无色卵圆形 ９
镰孢霉 菌落纯白色毛绒状，边缘有爬壁；分生孢子梗单生细长；分生孢子镰刀状，多为４个细胞，有厚垣孢子 ７
长隔孢霉 菌落纯白色菌丝浓密，边缘有爬壁；分生孢子梗细长，少分枝；分生孢子梭形，无色，为２或４个细胞 ３
团丝核菌 菌落蓬松淡黄色，菌丝整齐呈放射样；分生孢子梗细长多隔，有斑点样黑色菌核；未发现分生孢子 ３
丝核菌 菌落褐色较大，表面干燥，菌丝稀疏，边缘有爬壁现象；分生孢子梗褐色细长有分枝；未发现分生孢子 ３
头孢霉 菌落白色平铺，分生孢子梗短小有隔且分支；分生孢子顶生，无色，长椭圆形 ２
曲霉 菌落淡黄色，基质棕褐色；分生孢子梗顶端膨大成囊状；分生孢子串生，圆形，无色，有厚壁足细胞 ２
束丝核菌 菌落白色，菌丝浓密棉絮状，生长速度快；分生孢子梗细长且多呈束状排列 ２
小卵孢霉 菌落淡绿色，基质黑色；分生孢子梗细长，无分枝无膨大；分生孢子单细胞，卵圆形，顶生或侧生 １
枝顶孢霉 菌落苍白色，菌丝放射状较疏；分生孢子梗细长疏松；分生孢子无色卵圆形，单细胞，顶生，不聚集 １
暗串孢霉 菌落深绿色，表面干燥；分生孢子梗细长少分枝；分生孢子褐色，圆形或卵圆形，串生于孢子梗顶部 １
集梗多隔孢霉 菌落颜色不均一，菌丝浓密，基质褐色；分生孢子梗细长，少分枝少分隔，集成束丝状；分生孢子褐色多细胞 １
４～８个，形状类似于倒棍棒状，但一头要更长更细
暗梗单胞霉 菌落深绿色毛绒状，基质黑色；分生孢子梗褐色，粗而多分隔；分生孢子顶生，单细胞，卵圆形 １
聚顶球孢霉 菌落苍白色，菌丝稀疏平铺；分生孢子梗多隔多分枝；分生孢子暗色，内部呈砖隔状分隔 １
３．２ 半夏内生菌在植物器官中的分布 半夏根茎
叶不同部位都分离到多株内生菌，说明内生菌普遍
存在于半夏各器官中，但内生菌在植物器官中的分
布差异较大，寄生于块茎中的内生菌种类和数量相
对较多，而半夏根中的内生菌种类和数目相对较少，
见表３。
４ 讨论
在研究过程中，对于采集的植物样本，应选择健
康半夏植株，在最短时间内进行新鲜活体植株分离
样品处理，确保植物内生真菌的生存活力及其条件
无显著变化。在此基础条件下，采用 ７５％乙醇与
０１％升汞对分离材料表面进行有效杀菌处理后，无
菌水冲洗，基本可排除外界环境微生物污染的可能，
同时要掌握好乙醇、升汞的消毒时间，消毒时间太长
会杀死本身存在的内生菌，而时间太短则表面消毒
不彻底，本实验中由于叶片与根系较易损伤，所以消
毒时间较短，而块茎消毒时间相对较长；在植物内生
真菌分离用培养基内，加入适量的青霉素可有效地
抑制细菌的污染，使植物活体组织内部真菌得到有
效分离。
其次，本研究中从不同器官的半夏组织中共分
离到８４株内生菌，其中的４８株内生真菌鉴定为４
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表３ 半夏内生菌数量与器官分布
器官 目 科 属
数目
／株
合计
／株
块茎 丛梗孢目 丛梗孢科 青霉属 ６ ２４
头孢霉属 ２
长隔孢霉属 １
曲霉属 １
暗梗孢科 棒孢霉属 ３
瘤座孢科 聚顶球孢霉 １
镰孢霉属 ５
无孢菌目 无孢菌群 团丝核菌属 １
丝核菌属 ３
束丝核菌属 １
叶 丛梗孢目 丛梗孢科 青霉属 ３ １７
长隔孢霉属 １
曲霉属 １
瘤座孢科 镰孢霉属 １
暗梗孢科 棒孢霉属 ８
暗串孢霉属 １
集梗多隔孢霉属 １
暗梗单胞霉属 １
根 丛梗孢目 丛梗孢科 长隔孢霉属 １ ７
小卵孢霉属 １
枝顶孢霉属 １
瘤座孢科 镰孢霉属 １
无孢菌目 无孢菌群 团丝核菌属 ２
束丝核菌属 １
科、１５属，显示出该植物内生真菌在种类和数量上
的多样性。不同部位内生真菌种群差异明显，根茎
叶中的优势种群各不相同，表明内生真菌在植物的
不同部位、不同组织中分布广泛；而三者各自的特有
种群在种类上也较为丰富，显示出内生真菌在植物
中的分布有一定的组织专一性；另外，三者存在共有
种群，真菌镰孢霉属、长隔孢霉属在根茎叶中都有存
在，细菌中也有２种菌是三者所共有的，显示出内生
菌在植物各器官中的分布具有一定的相关性。
再次，由于内生菌在植物体内普遍存在，其种类
和数量常与植物生长年限及其所处的环境有一定的
关系，本研究采样数量和采样地点有限，因此所分
离的内生菌的种类受到了一定的限制，随着采样数
量的增大和采样地点的增多，内生菌的种类可能还
会进一步增加。有关分离到的８４株内生菌的分子
生物学鉴定以及分离的内生菌能否产生生物碱等活
性物质、能否诱导半夏愈伤组织积累更多活性物质
将在后续的研究中继续深入。
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ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓｆｒｏｍＰｉｎｅｌｉａ
ＬＩＵＪｉａｎｌｉｎｇ１，ＣＨＥＮＢａｏｂａｏ１，ＬＩＵＹｏｎｇｈｏｎｇ２，ＺＨＥＮＧＪｉａｎｇｂｉｎ１，ＬＩＡＮＧＺｏｎｇｓｕｏ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ＇ａｎ７１００６９，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｅｎｔｏｐｈｙｔｅｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＰｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｓｏｌｉｄｉｆｉｅｄ
ｐｌａｔｅｓｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ，ａｎｄｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ．Ｒｅｓｕｌｔ：
ＥｉｇｈｔｙｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｏｆｔｈｅｅｎｔｏｐｈｙｔｅｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅＰ．ｔｅｒｎａｔａｃｏｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ３ｈａｂｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ
ｃａｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏ１５ｇｅｎｅｒａ，４ｆａｍｉｌｉｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＩｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｎｔｏｐｈｙｔｅｓｉｎＰ．ｔｅｒｎａｔａｗｅｒｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｒｉｃｈ，
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