全 文 ：河南产连翘叶抑制
!
5糖苷酶活性成分研究
康文艺!+!! 王金梅!+! 张丽!+
f河南大学 中药研究所! 河南 开封 &%$$&% +f河南大学 药学院!开封 &%$$&#
$摘要%!目的&寻找连翘叶中
!
5葡萄糖苷酶抑制活性的成分( 方法#利用体外
!
5葡萄糖苷酶抑制模型活性追踪$采用各
种色谱法分离$运用多种波谱技术鉴定结构$并对活性较强的单体化合物进行酶抑制动力学研究( 结果#连翘叶的乙酸乙酯
部分具有较高的活性$从中分离出 个活性化合物$对
!
5葡萄糖苷酶抑制活性高于阳性对照阿卡波糖( 酶抑制动力学反应结
果表明$化合物 $ Y 和 与 混合物!+r对
!
5葡萄糖苷酶的抑制类型为非竞争性抑制剂( 结论#化合物 &` 为首次发现对
!
5糖苷酶的抑制活性$& 为首次从连翘属中分离得到(
$关键词%!连翘)
!
5葡萄糖苷酶)抑制活性
$稿件编号%!+$$*$#)$$$)
$基金项目%!河南省教育厅基础研究计划项目!+$$(4)#$$$+) 河
南省教育厅骨干教师计划!+$$(
$通信作者%!!康文艺$ NQV#!$)%( )(($#($$H50BRV#[B2D,Q263
?/@0BRVf./0
!!连翘N<%$B?;& $)$E+-$+!N?W2] \B?V为木犀科
连翘属植物$为中医常用的清热解毒药$历来被视为
疮家要药$传统以果实入药$有清热解毒%消肿散结
功效*+ ( &中国药典!** 年版一部明确规定以
Nf$)$E+-$+的果实为连翘正品的唯一来源$最早的
药用品种湖南连翘转而退居地方习用品的位置(
有关连翘化学成分和药理作用的报道已有很
多*++ ( 由于传统以果实入药$所以连翘的化学成分
研究集中在果实$仅从连翘叶中分离得到连翘酯苷
4
*)+
)药理研究发现连翘叶提取物有抑菌%保肝%抗
氧化%抗衰老%降血脂%减肥%能提高力竭运动及恢复
小鼠心肌抗氧化酶活性%抑制高脂血症小鼠体重增
长和心脏脂质过氧化等作用( 其中$降血脂和减肥
的有效成分是连翘苷$而抗病毒和抗氧化损伤作用
的有效成分是连翘酯苷*++ ( 但未见有对连翘叶抑
制
!
5葡萄糖苷酶化学成分研究(
河南省栾川地区连翘资源丰富$是该药材资源
的主要供应地$而文献仅有张国刚从河南产连翘果
实中分离得到CQ2D62R.B.RU*&+和王金梅等对河南产
连翘叶中芦丁含量的测定*+ (
为进一步开发利用河南省连翘资源$寻找连翘
叶活性成分$作者采用活性追踪的方法$对采集于河
南省栾川县的连翘叶抑制
!
5葡萄糖苷酶成分进行
了研究( 从乙酸乙酯活性部位得到 个活性化合
物$其中化合物 Y!:<
$
e)f)$ 0D-F
d
和 $!:<
$
e
(f(# 0D-F
d
的活性最好$化合物 $Y 和 与 混
合物 !+r均属于
!
5葡萄糖苷酶非竞争性抑制剂(
!试剂与仪器
!
5葡萄糖苷酶!
!
5DVW./SRUBSQ$ H<)f+ff+$)
&5硝基苯5
$
035吡喃葡萄糖苷 ! &5H5@C/A?Q26V5
$
035
DVW./A6CB2/SRUQ$ G;GL$ $+#b# ) 阿 卡 波 糖
!4.BC]/SQ$F/@#(#*和 I98O均购自美国 8RD0B
公司) 连翘叶于 +$$# 年 # 月采集于河南省栾川县$
由河南大学中药研究所生药教研室李昌勤副教授鉴
定为木犀科连翘属连翘 Nf$)$E+-$&$标本存于河南
大学中药研究所!;/f$#$%$$+(
9WV@RS[B2 9b) 酶标仪!美国N?QC0/HVQ.@C/2公
司)F>J5$ 恒温培养箱!上海一恒科技有限公
司)MCW[QC405&$$ 超导核磁共振仪)MCW[QCHS`WRCQ
F<型液相色谱5质谱联用仪)柱色谱材料为烟台汇
友硅胶开发有限公司生产的 +$$ j)$$ 目及硅胶J)
薄层色谱材料为烟台汇友硅胶开发有限公司生产的
LE+& 硅胶板$bRQSQVDQV#$ J !德国 9QC[ 公司$
8QA?BUQ7FJ5+$ !瑞典G?BC0B.RB公司(
!方法
]!提取与分离
干燥连翘叶 !+f [D 粉碎$用丙酮水 %r) 冷浸
) 次$每次 % U$过滤$合并滤液减压回收溶剂$将浓
缩的提取物分散在水中$依次用乙酸乙酯和正丁醇
萃取 ) 次$得乙酸乙酯EH!#*f) D和正丁醇提取物
EM!$ D( 水部分浓缩后得到水提取物 EZ!&
-#-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$
D( 对 EH$EM和 EZ进行体外抑制
!
5葡萄糖苷酶
活性筛选!表 $发现EH部分活性最好( 将 EH部
分经过 +$$ j)$$ 目硅胶柱色谱$三氯甲烷5甲醇
!$$r j(r+梯度洗脱$ NF<检测$浓缩%合并得
+ 个馏分( 对 + 个馏分进行体外第
!
5葡萄糖苷酶
活性筛选$发现馏分 !EM$)!EM)和 *!EM*具
有较好的活性$分别对这 ) 个馏分进行反复国产和
进口硅胶柱色谱%制备薄层色谱和凝胶柱色谱$从
EM 得到 &!)%f% 0D和 Y!&&f 0D)从馏分 EM)
得到 !+)f& 0D$!+f# 0D)从馏分 EM* 得到化
合物 $!f+ 0D(
表 !连翘叶不同提取物的
!
5糖苷酶抑制活性
提取物 :=g :<
$
=0D-F
d
EH (#-$ $-%
EM (%-) #$-)
EZ -(% )*%
EM *(-+ *(-$*
EM) -*# (&-#
EM* #-%) *(%-
4.BC]/SQ #(-&) $(
!!注#质量浓度 f D-Fd(
]!
!
5糖苷酶活性成分的筛选方法
]]!检测方法*#+!参见文献*#+(
]]!标准曲线制作!根据采用的反应体系$用磷
酸缓冲液!AJ#f( 配置 $$$

0/V-F
d
G;G$ 稀
释成 &$$$)$$$+$$$$$$$$$$+$$$

0/V-F
d
(
分别取 % 种不同浓度的 G;G溶液各 #$

F$加入
$f+ 0/V-F
d
;B
+
)
溶液 ($

F$混匀$ 在 &$ 20
下测定 #值$ 测 ) 组取平均值( 以 #值为纵坐标$
对硝基苯酚浓度为横坐标$做出标准曲线(
]]&!
!
5葡萄糖苷酶活力的测定!根据所采用的
反应体系#+

F磷酸钾缓冲液!AJ#f($加入 +$

F$f+ _-0F
!
5DVW./SRUBSQ$(

FI98O$)% h恒温
0R2后加入 +f 00/V-FdG;GL+$

F$)%h恒
温反应 0R2( 再加入 ($

F$f+ 0/V-F
d的
;B
+
)
溶液$于 &$ 20波长下测#值(
酶活力单位定义#)% h%AJ#f( 条件下$每分钟
水解底物所产生

0/V对硝基苯酚的酶量$规定为
个酶活力单位!_ *%+ (
&!结果与讨论
&]!结构鉴定
化合物 &!黄色油状物( H8:598 *2V*)*9d
J+
m
(

J5;9>!)

#%f% !+J$ UU$
We)f)$f# JY$J5+$J5#$%f$ !+J$UU$We)f+$
f JY$J5)$J5$&f$( !+J$U$We#f% JY$J5($
+f$ !J$0$J5*$$f*& !#J$U$We#f% JY$J5$$
J5(
)
<5;9>!)

# #%f# !<5
%$)+f& !<5$)+f) !<5&$)$f( !<5)$)$f(
!<5$+(f( !<5+$+(f( !<5#$%f% !<5( $
+%f% !<5*$*f !<5$$*f !<5(
化合物 $$Y 的H8:598和;9>数据与文献对
照一致$分别鉴定为 ! d5松脂素*(+ $ ! m5松脂
素**+ $熊果酸*$+ )化合物 $ 与标准品对照一致$鉴定
为槲皮素(
&]!提取部位
!
5葡萄糖糖苷酶活性成分的筛选
连翘叶提取物不同部位的
!
5葡萄糖糖苷酶抑
制活性见表 $可以看到$乙酸乙酯部分的抑制活性
较好$其抑制率明显高于其他部位以及阳性对照$所
以可采用活性追踪方式对乙酸乙酯部分继续分离(
&]&!化合物
!
5葡萄糖糖苷酶活性筛选
个化合物的浓度抑制曲线见图 ( 化合物
和 为 对差向异构体$分离纯化难度大$二者的混
合比例通过薄层扫描发现为 +r$在筛选中发现$该
比例的混合物!:<
$
e f% 0D-F
d
活性远远低
于 !:<
$
e&*#f%& 0D-F
d
和 !:<
$
e($$f% 0D
-F
d
单独作用时$表明差向异构导致了二者体外
抑制
!
5糖苷酶活性的拮抗作用):R/等 *(& 年采用
分光光度法于 &$+ 20处$首次报道化合物 $
!:<
$
e(f$ i$
d#
0/V-F
d
具有体外抑制
!
5糖苷
酶活性$并发现该化合物抑制类型为混合型偏向于
非竞争性抑制*+ )ZB@B2B]Q等 **% 年在活性追踪
过程中$利用I98O体系的微孔板法$发现化合物 $
!:<
$
e+f* i$
d&
0/V-F
d
是植物 P).<**;& )(0
*<;A+$中主要活性成分*++ $该活性结果与本文结论
一致!:<
$
e+f*) i$
d&
0/V-F
d
(
图 !化合物浓度对抑制活性的影响
-%-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$
!!卢大胜等 *)+利用 _\5+#$ 型紫外分光光度
计在 &$$ 20处测得 B.BC]/SQ体外抑制
!
5葡萄糖
糖苷酶活性的 :<
$
值为 +#$ 0D-Fd( 该研究
选择的保温时间!$ 0R2 %测试溶剂总体积%检
测仪器和波长!&$$ 20等与本文不同$但 B.BC5
]/SQ的 :<
$
值波动不大$表明本文利用的筛选模
型稳定%准确和可信(
图 显示$ 个化合物
!
5葡萄糖糖苷酶抑制活
性均与浓度呈正量效关系$且化合物 Y 和 $ 的抑制
率明显高于其他 ) 个化合物(
&]Y!化合物抑制类型的确定*$&+
依据化合物的抑制活性以及活性追踪分离情
况$对化合物 $ 和 的混合物以及 Y 做抑制动力
学研究(
受试化合物分别取合适的 + 个不同浓度$G;GL
取 & 个不同浓度$分别测定反应速度 4( 按 FR25
Q,QBcQ5MWC[作图法$以 =*8+为横坐标 =4为纵坐
标$分别绘制受试化合物的抑制作用动力学曲线
!图 + j&$得到
!
5葡萄糖苷酶的R
0
值为 )f$( 00/V
-F
d
( 从图中可以看出$化合物 $化合物 和
的混合物%化合物 Y 对
!
5葡萄糖苷酶抑制作用均属
非竞争性抑制$4
0B7
!为无抑制剂时$酶的最大反应
速度随着抑制剂浓度的增大而变小$米氏常数 R
0
保持不变( 根据非竞争性抑制动力学方程#
=4p
0B7
e=4
0B7
! m*:+=R
R
$可以求出受试化合物
的R
R
值 !为抑制剂存在下的反应常数分别为#
)$f+$%f$+$*f$& 0D-F
d
(
图 +!化合物 FR2Q,QBcQ5MWC[双倒数曲线
Y!结论
本文首次利用体外
$
5糖苷酶抑制活性筛选模
型对连翘叶进行体外
$
5糖苷酶抑制活性追踪$发现
乙酸乙酯部分有较高的抑制活性$利用活性追踪方
法$从该部分得到 个活性化合物$化合物 &` 为
!!
图 )!化合物 和 混合物FR2Q,QBcQ5MWC[双倒数曲线(
图 &!化合物 YFR2Q,QBcQ5MWC[双倒数曲线
首次报道具有
!
5糖苷酶抑制活性$并且 Y 和 $ 抑制
!
5糖苷酶活性最高 !:<
$
分别为 )f)$$(f(# 0D-
F
d
( 化合物 和 混合物!+r具有拮抗作用)
化合物 $ 和 混合物%Y 对
!
5葡萄糖苷酶抑制作
用属于非竞争性抑制类型$说明它既可以和酶$也可
以和酶5底物复合物结合$从而降低酶活性$达到降
低血糖作用$具有一定的应用价值(
$参考文献%
* +!李英霞$ 孟庆梅f连翘的本草考证*X+f中药材$ +$$+$ +
!# # &)f
* + +!王金梅$ 许启泰$ 康文艺f连翘化学成分及药理研究进展
*X+f天然产物研究与开发$ +$$%$ *!8# )f
* ) +!I/2D98$ KW I $^ KW 8 8fN,/2Q,.BTQ6/VDV6./SRUQSTC/0
N<%$B?;& $)$E+-$+*X+fX4SRB2 ;B@GC/U >QS$ ***$ # )+%f
* & +!a?B2DLL$ 8/2D8 X$ >Q2 X$ Q@BVf42Q,./0A/W2U TC/0N<%0
$B?;& $)$E+-$+!N?W2]f \B?V,R@? B2@RcRCBVQTQ.@/2 >8\*X+f
XJQC] G?BC0B./@?QC$ +$$+$ + !)# )f
* +!王金梅$ 高健$ 郅妙利$ 等fJGF<法测定连翘中叶%茎%果
实等不同部位芦丁的含量 *X+f河南大学学报#医学版$
+$$%$ +# !&# +)f
* # +!康文艺$ 张丽$ 宋艳丽f茜草抑制
!
5葡萄糖苷酶活性成分研
究*X+f中国中药杂志$ +$$*$ )&!* #$&f
* % +!康文艺$ 张丽$ 宋艳丽f滇丁香中抑制
!
5葡萄糖苷酶活性成
分研究*X+f中国中药杂志$ +$$*$ )&!&#&$#f
* ( +!王中秋$ 王军宪$ 冯锁民$ 等f连翘化学成分研究*X+f西北
-(-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$
药学杂志$ **#$ !# &f
* * +!于德泉$ 杨峻山f分析化学手册=核磁共振波谱分析*9+f+
版f北京#化学工业出版社$ **%#(##f
*$+!9B?B@/8 M$bW2UW 4Gf
)
<;9>SAQ.@CB/TAQ2@B.6VR.@CR@QCAQ5
2/RUS*X+fG?6@/.?Q0RS@C6$ **&$ )% !# # %f
*+!:R/9$ K/S?R/[B4$ :0B6/S?RK$Q@BVfHTQ.@/TTVBc/2/RUS/2
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5
DVW./SRUBSQB2U
!
5DVW./SRUBSQTC/06QBS@*X+f4DCR.MR/V*(&$ &(!## *f
*++!ZB@B2B]QX$ bB,B]B@BX$ bWCR?BCBJ$ Q@BVf:/SVB@R/2 B2U RUQ25
@RTR.B@R/2 /T
$
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WV0/RUQS*X+fMR/S.RMR/@Q.? MR/.?Q0$ **%$ #!# %%f
*)+!卢大胜$ 吕敬慈$ 雍克岚$ 等f用固定化酶筛选模型从天然
产物中筛选
$
5葡萄糖苷酶抑制剂*X+f中国新药杂志$ +$$$
&!+# &f
*&+!王镜岩$ 朱圣庚$ 徐长法f生物化学*9+f北京# 高等教育
出版社$ +$$+# )%f
!
*V.FQ?H-E,H>-@B-K-A?DHID?+.>,O>H?I@2$6#01% (/*,*-@0>@,@JD?O-@Q>
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A/W2US,QCQRUQ2@RTRQU ]698 B2U ;9>SAQ.@C/S./A6fN?QR2?R]R@/C6[R2Q@R.S/T@?QRS/VB@QU ./0A/W2US,QCQR2cQS@RDB@QUf7>HF.A#N?Q
Q@?6VB.Q@B@QQ7@CB.@S?/,QU @?QS@C/2DQS@R2?R]R@/C6B.@RcR@6$B2U TRcQB.@RcQ./0A/W2US,QCQRS/VB@QU TC/0@?RSQ7@CB.@fN?Q:<
$
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5DVW./SRUBSQ,QCQCQA/C@QU T/C@?QTRCS@@R0QfA/W2U & ,BSRS/VB@QU TC/0@?QDQ2WST/C@?QTRCS@@R0Qf
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$
5DVW./SRUBSQ) R2?R]R@/CS
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$责任编辑!王亚君%
-*-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
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9B6$ +$$