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Effect of a Chinese herbal prescription on femur calcium deposition in rats  under simulated weightlessness: by using 41Ca tracing-accelerator mass spectrometry analysis

中药干预模拟失重大鼠股骨外源钙沉积研究


目的:研究中药复方对模拟失重大鼠承重骨对外源钙摄取的干预作用。方法:雄性Wistar大鼠随机分为3组,空白组、模型组、中药组。尾吊模拟失重,中药复方(含熟地黄、怀牛膝、黄芪、当归、牡蛎醋酸水解物等)704 g·L-1水煎剂2.5 mL灌胃;适应期1周,模拟失重期3周,于模拟失重第11天一次性灌胃给予一定量41Ca示踪剂。实验结束取股骨,加速器质谱法(Accelerator Mass Spectrometry,AMS)分析骨41Ca/40Ca值,电感耦合等离子体光谱法(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy,ICP-AES)分析骨钙总量,计算股骨41Ca沉积量、股骨41Ca沉积率。结果:空白、模型、中药3组股骨41Ca/40Ca丰度比分别为(5.03±0.55),(3.82±0.29),(5.73±0.40)×10-9,模型组较空白组显著降低(P<0.001),中药组较空白组显著升高(P<0.05);空白、模型、中药3组股骨41Ca沉积量分别为(7.39±0.90),(4.52±0.40),(7.45±0.89)×10-7 mg,沉积率分别为(0.819±0.100),(0.501±0.045),(0.826±0.098)%,模型组股骨41Ca沉积量和沉积率均较空白组显著降低(P<0.001),中药组较空白组变化不显著,较模型组显著增高(P<0.001)。结论:尾吊模拟失重可造成大鼠承重骨外源钙沉积障碍,中药可较好对抗这种情况;失重骨质疏松可能存在外源钙沉积减少以外的多种机制。

To study the effect of a Chinese herbal prescription on external calcium deposition to weight-bearing bone in simulated weightlessness rats. Method:Twenty-one male Wistar rats were divided into 3 groups: control group, tail suspension group, tail suspension with Chinese medicine group which takes a Chinese herbal prescription extract (containing Radix Rehmanniae Preparata, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Radix Astragali, Radix Angelicae Sinensis, Concha Ostreae prepared by acetic acid) by intragastric administration. After 1 week adaption, there start off 3 weeks simulated weightlessness by tail suspension. At the eleventh day of simulated weightlessness, every rat was given one equal dose of 41Ca tracer by intragastric administration. Right femurs were separated as experiment over, and the ratio of 41Ca to 40Ca (41Ca / 40Ca) was measured by accelerator mass spectrometry (AMS), while total femur calcium was measured by inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy (ICP-AES). Femur 41Ca deposition amount (DA) and femur 41Ca deposition ratio (DR) were calculated. Result:The results showed that compared with control group, 41Ca / 40Ca decreased significantly (P<0.001) in tail suspension group, while in tail suspension with Chinese medicine group, it significantly increased (P<0.05). DA and DR were both decreased significantly (P<0.001) in tail suspension group, but no significant change in tail suspension with Chinese medicine group as compared with control group. Compared with tail suspension group, DA and DR increased significantly (P<0.001) in tail suspension with Chinese medicine group. Conclusion:Simulated weightlessness by tail suspension can cause decreased deposition of external calcium to weight-bearing bone, and the Chinese herbal prescription in this trial is effective to prevent the decrease. Moreover, multiple mechanisms may contribute to weightlessness induced osteoporosis, besides calcium deposition disturbance.


全 文 :中药干预模拟失重大鼠股骨外源钙沉积研究
胡素敏1,周 鹏2,姜 山3,何 明3,傅 骞1,杨佳佳1,高学敏1
(1.北京中医药大学 基础医学院,北京 100029;
2.天津中医药大学 中药学院,天津 300193;
3.中国原子能科学研究院,北京 102413)
[摘要] 目的:研究中药复方对模拟失重大鼠承重骨对外源钙摄取的干预作用。方法:雄性 Wistar大鼠随机分为3组,
空白组、模型组、中药组。尾吊模拟失重,中药复方(含熟地黄、怀牛膝、黄芪、当归、牡蛎醋酸水解物等)704g·L-1水煎剂25
mL灌胃;适应期1周,模拟失重期3周,于模拟失重第11天一次性灌胃给予一定量41Ca示踪剂。实验结束取股骨,加速器质
谱法(AcceleratorMassSpectrometry,AMS)分析骨41Ca/40Ca值,电感耦合等离子体光谱法(InductivelyCoupledPlasmaAtomic
EmissionSpectroscopy,ICPAES)分析骨钙总量,计算股骨41Ca沉积量、股骨41Ca沉积率。结果:空白、模型、中药 3组股骨
41Ca/40Ca丰度比分别为(503±055),(382±029),(573±040)×10-9,模型组较空白组显著降低(P<0001),中药组较
空白组显著升高(P<005);空白、模型、中药3组股骨41Ca沉积量分别为(739±090),(452±040),(745±089)×10-7
mg,沉积率分别为(0819±0100),(0501±0045),(0826±0098)%,模型组股骨41Ca沉积量和沉积率均较空白组显著降
低(P<0001),中药组较空白组变化不显著,较模型组显著增高(P<0001)。结论:尾吊模拟失重可造成大鼠承重骨外源钙
沉积障碍,中药可较好对抗这种情况;失重骨质疏松可能存在外源钙沉积减少以外的多种机制。
[关键词] 41Ca;中药;模拟失重;钙沉积
[收稿日期] 20081009
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30500663);2006年教育部优
秀人才支持计划(NCET060124);2006年北京市科技新星(A)类计
划(2006A49);国家基础科学人才培养基金(20070110)
[通信作者] 胡素敏,Tel:(010)64287006,Email:cinndyhu@ya
hoo.com.cn
  失重造成的承重骨骨质进行性流失和钙代谢紊
乱是太空飞行中影响航天员安全的重要危险因
素[1],目前其原因尚不清楚,亦无效果理想的对抗
措施。本课题组通过深入挖掘中医药理论[2],以培
补肾脾、养骨荣髓、益气和血为大法,确立了针对失
重模型大鼠骨质丢失的中药复方,进行药效学研究,
并探索了最佳给药剂量[34]。本实验引入41Ca示踪
加速器质谱分析技术,以长寿命核素41Ca标记外源
钙,考察了中药复方对尾吊模型大鼠股骨外源钙沉
积的干预作用,以探讨模拟失重致承重骨骨质丢失
的部分机制和受试中药的干预环节。
1 材料
1.1 动物 Wistar大鼠,雄性,21只,体重(200±
10)g,北京维通利华实验动物公司提供,动物合格
证号SCXK(京)2000003。饲料为大、小鼠生长维
持颗粒饲料,北京科澳协力饲料有限公司,饲料许可
证号 京饲(配)字第 238号、京动许字(2000)
第015号。
1.2 药物 由熟地黄、怀牛膝、黄芪、当归、牡蛎等
药物组成,全部药材购自亳州药材市场,经北京中医
药大学基础医学院方药系张建军副研究员和李伟实
验师鉴定。其中牡蛎以醋酸水解,全方按中药提取
工艺制成,供试药液含生药704g·L-1(合临床成
人用量8倍),含牡蛎钙质量浓度8g·L-1。与受试
中药钙含量相当的牡蛎醋酸水解物的水溶液,含牡
蛎钙8g·L-1。
1.3 试剂 示踪载体 CaCO3,原子丰度比
41Ca/
40Ca=(419±029)∶105,中国原子能科学研究院
核物理研究所提供;HNO3,AR;H2O2,AR;(NH4)2
C2O4,AR;氨水,AR;HNO3,BVⅢ;氢氟酸,MOS;
Dowex50w×4400强酸性阳离子交换树脂。
1.4 仪器 HF300型 1/1000电子天平(日本),
GR202型1/10万电子天平(日本);TGL16A型高
速冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表厂);ULTIMA型
电感耦合等离子光谱仪(法国JY公司);北京 HI13
串列加速器系统(中国原子能科学研究院)。
2 方法
2.1 模型制备 采用尾吊法[5]模拟失重时后肢去
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负荷及体液头向转移效应。大鼠尾部无水乙醇脱
脂,吹干,以医用胶布从尾根部沿两侧面纵向粘贴、
横向加固,在鼠尾远端将胶布勾挂于悬吊笼横梁上,
调整高度使鼠前肢承重,后肢悬空,鼠体与水平面成
30度角;大鼠可360度活动,自由觅食水。
2.2 分组与给药 正常大鼠30只,按体重随机分
为3组,每组10只;悬吊笼单笼饲养。动物定量饮
食,每日每只约20g全价饲料,按生长情况调整给
食量,基本保证各动物摄食量相等。实验期4周。
第1周为适应期,第2~4周为模拟失重期。
空白组:不悬吊,大鼠始终自由活动。每日以含
牡蛎钙8g·L-1的水溶液25mL灌胃,合每日添加
牡蛎钙20mg。模型组:不悬吊适应1周,尾吊3周
模拟失重。每日以含牡蛎钙8g·L-1的水溶液25
mL灌胃,合每日添加牡蛎钙20mg。
中药组:不悬吊适应1周,尾吊3周模拟失重。
每日以生药704g·L-1供试药液25mL灌胃给药
(相当于076g生药),其中含牡蛎钙20mg。
尾吊过程中,由于部分动物耐受不一,偶见尾部
皮损,或体重组内差异过大。因此,于尾吊中期根据
动物整体情况,剔除尾部皮损或体重过大过小的动
物;结合同位素用量计算,每组动物保留7只,即实
际上共有21只动物进入下一阶段示踪实验。
2.3 示踪剂的给入 在模拟失重第11天,各组动
物一次性灌胃给予含等量41Ca的药液或牡蛎钙水溶
液25mL(均含41Ca9025×10-5mg,普通钙 20
mg)。牡蛎钙∶示踪载体钙≈18∶2,于示踪日期一次
性给予每鼠18mg牡蛎钙 +2154mg示踪载体钙。
上述均匀混合物视为20mg牡蛎钙,以适量稀醋酸
溶解;其中中药组示踪剂按牡蛎在复方中的比例混
入药液,空白组、模型组示踪剂按中药组钙浓度配成
水溶液,均含钙8g·L-1。
2.4 样品的采集和处理 给药结束,大鼠处死,剥
取右股骨,剔净骨周围肌肉及软组织,用生理盐水擦
洗干净,入烘箱110℃烘干,称取恒重后,于马弗炉
中600℃灰化48h。精确称取灰分约25mg,以适
量稀盐酸溶解,蒸馏水定容到25mL,以电感耦合等
离子光谱仪检测总钙含量。
精确称取灰分约50mg,用体积比4∶1的HNO3
(AR)和H2O2(AR)混合液适量加热消解至溶液澄
清。消解液用蒸馏水稀释至15mL,滴加氨水调节
pH>5,加入等体积饱和(NH4)2C2O4溶液,充分混
匀,静置,4000r·min-1离心5min,去上清。以5
mL25%的(NH4)2C2O4溶液洗涤沉淀1次,5mL
蒸馏水洗涤沉淀2次,即CaC2O4粗提物。该粗提物
用2mLHNO3(BVⅢ级)溶解,高纯水稀释至 15
mL,过Dowex50w×4400强酸性阳离子交换树脂
柱(内径6mm,树脂层高8cm,事先用4mol·L-1
HNO310mL,008mol·L
-1HNO36mL,高纯水10
mL平衡),流速控制在约 1mL·min-1。先用 08
mol·L-1HNO315mL洗脱杂质离子,再用4mol·
L-1HNO3洗脱 Ca
2+,收集45mL流出液于15mL
离心管中,加等体积高纯水,再加6mLHF,隔夜放
置。4000r·min-1离心10min,去上清,以1mL高
纯水洗涤CaF2沉淀2次,烘干备用。将约6mgCaF2
样品与200目银粉混合(质量比约1∶1)用压靶器压
入小孔铝靶锥,再将靶锥装入靶盘,80℃烘烤数
小时后,AMS法测量41Ca/40Ca。因 AMS检测设备
运转耗资巨大,且靶位与机时十分有限,在预留商
业空白、流程空白、标准样品位后,经计算,一次
仅能完成15个待测样品的检测。故此次检测样品
数为每组 5个,随机抽取。其他部位骨41Ca/40Ca
待后续检测。
2.5 观察指标及计算方法
股骨41Ca沉积量=股骨钙总量×股骨41Ca/40Ca值
股骨41Ca沉积率=股骨41Ca沉积量/41Ca摄入量
41Ca摄入量已知,股骨钙总量以 ICPAES法检
测,41Ca/40Ca值以AMS法检测。
2.6 统计分析 各组数据以 珋x±s表示,用SAS82
统计软件对股骨41Ca/40Ca值、股骨41Ca沉积量、股
骨41Ca沉积率作组间单因素方差分析及两均数间多
重比较,P<005为差异有显著性意义。
3 结果
经3周尾吊模拟失重和失重期中点41Ca示踪,
与空白组比较,模型组动物股骨同位素丰度比
41Ca/40Ca出现极显著下降(P<0001),而中药组该
值则有显著上升(P<005)。与空白组比较,模型
组动物股骨41Ca沉积量和沉积率均出现极显著下降
(P<0001),中药组上述指标则较空白组变化不显
著。结果见表1。
4 讨论
到目前为止,对模拟失重下骨钙丢失的研究以
笼统的钙丢失观察为主,大多未区分内源钙和外源
钙的行为[67]。Globus等以45Ca示踪法观察了尾吊
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   表1 失重后不同组动物股骨41Ca沉积情况(珋x±s,n=10)
组别 给药量 41Ca/40Ca丰度比/×10-9 41Ca沉积量/×10-7mg 41Ca沉积率/%
空白 牡蛎Ca20mg 503±0556) 739±0906) 082±0106)
模型 牡蛎Ca20mg 382±0293) 452±0403) 050±00453)
中药 076g生药+牡蛎Ca20mg 573±0401,6) 745±0896) 083±00986)
  注:与空白组比较1)P<005,2)P<001,3)P<0001;与模型组比较4)P<005,5)P<001,6)P<0001。
模拟失重大鼠骨对外钙的摄取情况。结果发现,在
最初5d,模型动物胫骨和椎骨钙摄取量分别下降到
对照水平的(605±55)%和(743±37)%,而在
肱骨和下颌骨则无显著降低;尾吊10d后,胫骨和
椎骨钙摄取量恢复到对照水平;尾吊15d后,尽管
骨的总钙量仍呈进行性下降,但模型动物胫骨和椎
骨钙摄取量却分别逆转到对照水平的(1258±
58)%和(1362±96)%[8]。其结果表明,不同部
位骨对尾吊的响应情况不同;同一部位骨在模拟失
重不同阶段的行为亦有所不同。
本实验引入长寿命核素41Ca示踪串列加速器
质谱(AMS)分析技术,标记外源钙,对中药干预模
拟失重大鼠股骨钙沉积情况进行了观测。目前,
41Ca在生命科学中的应用在国际上尚处于起步阶
段。Elmore等首次将41Ca用于生物医学实验研究,
给狗注射41Ca标记的草酸钙(90kBq41Ca·kg-1),
用AMS方法测量动物的血、尿、粪便中41Ca的含量,
结果表明41Ca示踪法能够用于长期的骨钙代谢观
察,且灵敏度比45Ca示踪法要高2个数量级,灵敏度
提高潜力高达8个数量级[9]。
由于受试中药复方中含有固肾涩精的牡蛎,经
制剂后其主要成分为醋酸钙,因而以其为示踪载体,
与41Ca均匀混合,按牡蛎在复方中的比例混入药液;
同时,为排除组间摄钙不一致可能造成的对体内钙
库的不同影响,两对照组亦采用了等量牡蛎醋酸水
解物载示踪剂,并控制饮食量大致相等,故可基本忽
略动物间饮食钙量的差异。由于41Ca的天然本底极
低,自然界41Ca/40Ca仅为10-15,故而可以认为在动
物摄入41Ca示踪剂一定时间内,出现在身体各部分
包括股骨中的41Ca完全来自外源,代表外源钙的行
为。示踪时间点选择在3周模拟失重的第11天,一
则是根据前期模型研究发现,大鼠经过10d尾部悬
吊,即出现由模拟失重引起的骨质丢失;二则示踪剂
给入后距取材还有约10d时间,使41Ca有充裕的时
间沉积入深部骨组织[10],以反映模拟失重中后期股
骨对外源钙的摄取行为。
实验中通过对41Ca示踪大鼠股骨中同位素丰度
比41Ca/40Ca的 AMS分析表明,模型组动物股骨
41Ca/40Ca值、41Ca沉积量、以及相对于口服量的股
骨41Ca沉积率均出现极显著下降;而中药组股骨
41Ca/40Ca较空白组出现显著上升,其他指标较空白
组有升高趋势但变化不显著。结果表明3周模拟失
重可造成股骨对外源钙的摄取能力严重受损,随之
导致骨钙化受抑,这可能是模拟失重致骨量下降的
重要原因和骨钙代谢紊乱的关键环节。同时,结果
显示受试药有很好的增强模拟失重下股骨对外源钙
摄取能力的作用,且纠正程度较大,使各观察指标不
同程度地超过了空白组;以往研究表明,受试中药对
骨股骨密度的改善程度并没有像外钙沉积量改善程
度之大[34]。本结果与 Globus[8]实验结果有所不
同,可能与实验条件不同有关,如鼠龄、悬吊时间、示
踪剂给入时间、示踪剂给入途径及在体时间等综合
分析,受试药能够增强模拟失重下股骨对外源钙的
摄取能力,这可能是五加补骨方改善骨质流失和骨
钙代谢紊乱的重要的局部机制,但显然不是唯一机
制。
[致谢] 中国原子能科学研究院核物理研究所武绍勇
工程师及王伟、拓飞、窦玉玲、李朝历、沈洪涛、王祥高、吴绍
雷、张大伟、石国柱、黄春堂、贺国珠等在AMS检测过程中给
予大力支持。
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EfectofaChineseherbalprescriptiononfemurcalciumdepositioninrats
undersimulatedweightlessness:byusing41Catracingacceleratormass
spectrometryanalysis
HUSumin1,ZHOUPeng2,JIANGShan3,HEMing3,FUQian1,YANGJiajia1,GAOXuemin1
(1.SchoolofPreclinicalMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;
2.SchoolofChinesemateriamedica,TianjinUniversityofChineseMedicine,Tianjin300193,China;
3.ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China)
[Abstract] TostudytheefectofaChineseherbalprescriptiononexternalcalciumdepositiontoweightbearingboneinsimula
tedweightlessnessrats.Method:TwentyonemaleWistarratsweredividedinto3groups:controlgroup,tailsuspensiongroup,tail
suspensionwithChinesemedicinegroupwhichtakesaChineseherbalprescriptionextract(containingRadixRehmanniaePreparata,
RadixAcanthopanacisBidentatae,RadixAstragali,RadixAngelicaeSinensis,ConchaOstreaepreparedbyaceticacid)byintragastric
administration.After1weekadaption,therestartof3weekssimulatedweightlessnessbytailsuspension.Attheeleventhdayofsimu
latedweightlessness,everyratwasgivenoneequaldoseof41Catracerbyintragastricadministration.Rightfemurswereseparatedas
experimentover,andtheratioof41Cato40Ca(41Ca/40Ca)wasmeasuredbyacceleratormassspectrometry(AMS),whiletotalfemur
calciumwasmeasuredbyinductivelycoupledplasmaatomicemissionspectroscopy(ICPAES).Femur41Cadepositionamount(DA)
andfemur41Cadepositionratio(DR)werecalculated.Result:Theresultsshowedthatcomparedwithcontrolgroup,41Ca/40Cade
creasedsignificantly(P<0.001)intailsuspensiongroup,whileintailsuspensionwithChinesemedicinegroup,itsignificantlyin
creased(P<0.05).DAandDRwerebothdecreasedsignificantly(P<0.001)intailsuspensiongroup,butnosignificantchangein
tailsuspensionwithChinesemedicinegroupascomparedwithcontrolgroup.Comparedwithtailsuspensiongroup,DAandDRin
creasedsignificantly(P<0.001)intailsuspensionwithChinesemedicinegroup.Conclusion:Simulatedweightlessnessbytailsus
pensioncancausedecreaseddepositionofexternalcalciumtoweightbearingbone,andtheChineseherbalprescriptioninthistrialis
efectivetopreventthedecrease.Moreover,multiplemechanismsmaycontributetoweightlessnessinducedosteoporosis,besidescalci
umdepositiondisturbance.
[Keywords] 41Ca;Chineseherbalprescription;simulatedweightlessness;calciumdeposition
[责任编辑 古云侠]
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