全 文 ：补骨脂提取物对体外培养小鼠成骨细胞株
ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞分化的影响
宋　芹１，２，董小萍２，郁小兵１，３
（１．新乡医学院 组织再生省重点实验室，河南 新乡 ４５３００３；
２．成都中医药大学 药学院，四川 成都 ６１００７５；
３日本株式会社高研公司，日本 东京 １１５００５５１）
［摘要］　目的：研究补骨脂提取物对体外培养新生小鼠颅骨 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞分化的影响。方法：以小鼠成骨细胞株
ＭＣ３Ｔ３Ｅ１作为药物筛选的细胞模型，将培养的ＭＣ３Ｔ３Ｅ１小鼠成骨细胞分为４组：空白组，补骨脂提取物（含生药）００２，０２，
２ｇ·Ｌ－１不同剂量组。检测细胞ＡＬＰ，Ⅰ型胶原蛋白的含量，采用ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ测定补骨脂提取物对ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞ＡＬＰ，Ⅰ
型胶原蛋白及骨钙素ｍＲＮＡ表达的影响。结果：补骨脂提取物生药剂量０２ｇ·Ｌ－１，能提高 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞 ＡＬＰ的活性，促
进Ⅰ型胶原蛋白分泌。同时分别在７～１４ｄ对ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞ＡＬＰ，以及在１４～２１ｄⅠ型胶原蛋白、骨钙素ｍＲＮＡ表达有明
显的促进作用。结论：中药补骨脂提取物能有效促进成骨细胞的分化，为研究中药补骨脂的作用机制提供参考。
［关键词］　补骨脂；ＡＬＰ；Ⅰ型胶原蛋白；骨钙素；基因表达
［收稿日期］　２００８０７１０
［通信作者］　郁小兵，首席研究员，日本文部省特聘研究员，医学
理学博士。从事生物科学及临床医学研究。Ｔｅｌ：００８１９０５７６８７６００，
Ｅｍａｉｌ：ｊｆｘｂ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
　　中药补骨脂为豆科植物补骨脂Ｐｓｏｒａｌｅａｃｏｒｙｌｉｆｏ
ｌｉａ的干燥成熟果实，性味辛、苦、大温，入肾经，
有补肾壮阳、温脾止泻之功效［１］。临床广泛用于
治疗肾虚腰膝痛、骨痿、骨痹，具有促进成骨细胞
的增殖与分化、抗骨质疏松的作用［２４］。Ⅰ型胶原
蛋白（ｔｙｐｅⅠ ｃｏｌａｇｅｎ）、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙
素（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）是常用的观察成骨细胞成熟的指标。
体外成骨细胞的成骨过程由细胞增殖、细胞外基质
形成及成熟、骨基质矿化几个过程组成，每个阶段的
成骨细胞均表现出不同的特性，各个阶段与成骨有
关的基因表达的时限和量都有所不同［５］。小鼠颅
骨细胞来源的前成骨细胞ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞系是体外
研究成骨过程的经典模型［６］。目前对补骨脂作用
机制的研究主要是以蛋白质水平为指标，本研究将
以小鼠成骨细胞株ＭＣ３Ｔ３Ｅ１作为药物筛选的细胞
模型，检测不同药物浓度和不同培养阶段 ＭＣ３Ｔ３
Ｅ１细胞ＡＬＰ，Ⅰ型胶原蛋白的含量，并首次采用 ｒｅ
ａｌｔｉｍｅＰＣＲ考察补骨脂提取物对 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞
ＡＬＰ，Ⅰ型胶原蛋白及骨钙素ｍＲＮＡ表达的影响，从
蛋白质和基因水平指标揭示补骨脂抗骨质疏松的作
用机制。
１　材料
１．１　补骨脂提取物
补骨 脂 购 于 日 本
$
本 天 海 堂 （Ｌｏｔ．
０２９７０７００１），由成都中医药大学董小萍教授鉴定为
豆科植物补骨脂Ｐｃｏｒｙｌｉｆｏｌｉａ的干燥成熟果实。补
骨脂提取物为自制，称取粉碎的补骨脂药材１０ｇ，加
蒸馏水２００ｍＬ，加热，煮沸２ｈ，冷却到室温后减压
滤纸过滤，除去不容物，０２２μｍ微孔滤膜滤过除
菌，备用。
１．２　细胞株
ＭＣ３Ｔ３Ｅ１小鼠成骨细胞引自日本北海道大学
齿科研究室。
１．３　试剂
ＩＧＥＰＡＬＣＡ６３０（美 国 Ｓｉｇｍａ 公 司， Ｌｏｔ．
８０Ｋ１０４８），Ｔｒｉｓ（日本和光纯药株式会社，Ｌｏｔ．
ＣＥＬ１３７４），Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（美国 Ｓｉｇｍａ公司，
Ｌｏｔ．０７６Ｋ２３３１），ＡＬＰ试剂盒（日本和光纯药株式会
社，Ｌｏｔ．ＴＦＲ４９７７），胶原蛋白试剂盒（ＳｉｒｃｏｌＴＭＳｏｌｕ
ｂｌｅＣｏｌａｇｅｎＡｓｓａｙ，英国 Ｂｉｏｃｏｌｏｒ公司），ＴｏｔａｌＲＮＡ
提取试剂盒 ＦａｓｔｌａｎｅｃｅｌｓｃＤＮＡｋｉｔ（德国 Ｑｉａｇｅｎ公
司），逆转录试剂盒 Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔ（德国
Ｑｉａｇｅｎ公司），ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ试剂盒 ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ
ＥｘＴａｑＴＭＲＲ０４１Ａ（日本 ＴａＫａＲａ株式会社），ｃＤＮＡ
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精制试剂盒ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（德国Ｑｉａ
ｇｅｎ公司），ＮｕｃｌｅａｓｅｆｒｅｅＷａｔｅｒ（美国 Ａｍｂｉｏｎ公司，
Ｌｏｔ．０７０１００６），Ａｇａｒｏｓｅ２１（日本和光纯药株式会
社，Ｌｏｔ．１３０６５Ｆ），５０×ＴＡＥ（日本和光纯药株式会
社，Ｌｏｔ．００７９６１Ｄ）。
１．４　仪器设备
ＵＶ１６０１型紫外分光光度计（日本岛津公司），
ＰＣＲ扩增仪 ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２７００（美国 Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司），ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ
１５（瑞士Ｒｏｃｈｅ公司）。
２　方法
２．１　细胞培养
ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞于 αＭＥＭ完全培养基（１０％胎
牛血清，１００Ｕ·ｍＬ－１青霉素和１００ｍｇ·Ｌ－１链霉
素）在５％ＣＯ２，湿度９５％，恒温３７℃的二氧化碳培
养箱中培养。每３ｄ换液１次，５～６ｄ细胞基本融
合后传代。吸去原培养基，用 ＰＢＳ溶液清洗２次，
加入０２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ·４Ｎａ溶液
０５ｍＬ，３７℃ 消化１ｍｉｎ后，于相差显微镜下见细
胞胞体收缩，变圆，加 αＭＥＭ完全培养基１０ｍＬ终
止消化。轻轻反复吹打细胞，使其浮游，移至５０ｍＬ
离心管，速度 ２００ｒ·ｍｉｎ－１，２ｍｉｎ离心，吸去上清
液，加入适量含血清培养基，轻轻吹打，使管底细胞
浮游，均匀分散。取９６孔板，按３×１０３个／孔播种细
胞。待细胞附着后，每３ｄ换液１次，换液时分别加
入适量供试液样品，使各样品组最终浓度（生药）分
别为００２，０２，２ｇ·Ｌ－１，以加入蒸馏水为空白组，
分别培养７，１４，２１ｄ。
２．２　Ⅰ型胶原蛋白含量的测定
按２．１方法培养细胞１４ｄ，弃去培养液，各孔用
４℃预冷的ＰＢＳ洗涤２次，再加入１００μＬＰＢＳ于冰
浴超声破碎细胞，采用胶原蛋白试剂盒，测定Ⅰ型胶
原蛋白含量。
２．３　ＡＬＰ活性的测定
采用ＤＮＡ含量对 ＡＬＰ测定结果进行校正，按
２．１方法培养细胞１４ｄ，弃去培养液，各孔用４℃预
冷的ＰＢＳ洗涤２次，再加入１００μＬＰＢＳ于冰浴中超
声裂解细胞，分别取 ５０μＬ测定 ＤＮＡ含量和 ＡＬＰ
活性。取其中一份 ５０μＬＰＢＳ细胞悬液，加入 ５０
μＬ细胞核膜裂解液［７］（０１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸盐缓冲液
ｐＨ７４，０２５ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣｌ），于冰浴超声破裂细
胞，采用 Ｈ３３２５８与 ＤＮＡ结合生成荧光物质，于激
发光源波长３５６ｎｍ，检测波长４６０ｎｍ处，测定ＤＮＡ
含量。取另一份５０μＬＰＢＳ细胞悬液，加入５０μＬ
细胞裂解缓冲液（２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７４，２
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２，０４％ＩＧＥＰＡＬＣＡ６３０）于冰浴中
超声裂解细胞，离心后取上层液２０μＬ，采用ＡＬＰ试
剂盒，于４０５ｎｍ波长处测定细胞中 ＡＬＰ活性。经
ＤＮＡ含量校正后的ＡＬＰ活性值为最终值。
２．４　各相关基因表达量的测定
２．４．１　ＴｏｔａｌＲＮＡ的提取　采用 ＴｏｔａｌＲＮＡ提取试
剂盒ＦａｓｔｌａｎｅｃｅｌｓｃＤＮＡｋｉｔ，按照说明提取各样品
ＴｏｔａｌＲＮＡ，保存于－８０℃冰箱备用，１周内使用。
２．４．２　ｃＤＮＡ的合成　分别取各样品 ＴｏｔａｌＲＮＡ４
μＬ，采用逆转录试剂盒 Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔ，进
行逆转录，４２℃孵育３０ｍｉｎ，再加热到９５℃，维持３
ｍｉｎ。所得溶液即为ｃＤＮＡ，置冰浴待用。
２．４．３　各相关基因引物序列、扩增长度　根据目的
基因在Ｇｅｎｅｂａｎｋ中的己知序列设计引物。ＡＬＰ，Ⅰ
型胶原蛋白、骨钙素，以及看家基因 βａｃｔｉｎ的引物
见表１。
表１　ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ引物［８］
基因 引物序列
扩增
长度／ｂｐ
Ⅰ型胶原蛋白 ＦＷ：５′ＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＣ３′ 　
　 ＲＶ：５′ＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＴＣＧＣＡＣＣ３′ ２２２
骨钙素 ＦＷ：５′ＣＣＴＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＴＣＣ３′ 　
　 ＲＶ：５′ＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧ３′ ２１９
ＡＬＰ ＦＷ：５′ＡＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＴＧＡ
３′
　
　 ＲＶ：５′ＣＣＴＴＧＴＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＧＴＴＡ３′ １５９
βａｃｔｉｎ ＦＷ：５′ＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧ３′ 　
　 ＲＶ：５′ＧＡＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣ３′ １４７
２．４．４　制备标准曲线梯度稀释 ＤＮＡ模板　采用
ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ 试 剂 盒 ＳＹＢＲ ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ
ＲＲ０４１Ａ，针对ＡＬＰ，Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素，以及看
家基因βａｃｔｉｎ，分别配制２０μＬ的 ＰＣＲ反应体系：
ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１０μＬ，ＮｕｃｌｅａｓｅｆｒｅｅＷａｔｅｒ７２
μＬ，ＴｅｍｐｌａｔｅｃＤＮＡ２μＬ，使上下游引物最终浓度为
０２μｍｏｌ·Ｌ－１。进行 ＰＣＲ扩增，扩增条件见表２。
采用 ｃＤＮＡ精制试剂盒 ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ对扩增产物进行纯化后，以扩增产物浓度为１，
将ＰＣＲ产物以 １００倍为梯度进行稀释：１×１０－６，
１×１０－８，１×１０－１０。扩增产物用２５％琼脂糖凝胶
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　　 表２　ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ条件
基因 ＰＣＲ条件
Ⅰ型胶原蛋白 ９５℃１０ｓ变性，４０个循环，９５℃１０ｓ，６０℃ １０ｓ，７２℃１２ｓ
骨钙素 ９５℃１０ｓ变性，４０个循环，９５℃１０ｓ，６０℃ １０ｓ，７２℃１２ｓ
ＡＬＰ ９５℃１０ｓ变性，４５个循环，９５℃５ｓ，６４℃３０ｓ
βａｃｔｉｎ ９５℃１０ｓ变性，５０个循环，９５℃５ｓ，６２℃３０ｓ
电泳、熔点曲线检测扩增产物的特异性。
２．４．５　ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ反应　３个梯度稀释的 ＤＮＡ
模板及ｃＤＮＡ样品分别配置２０μＬ的反应体系，进
行扩增，方法同２．４．４，采用溶解曲线法和凝胶电泳
法鉴定产物特异性和片段大小。熔点曲线均为单一
峰，无加宽变形，说明无引物二聚体，确保产物的特
异性。同时凝胶电泳结果为单一斑点。
２．４．６　数据处理　根据 ＤＮＡ标准曲线，各样品
ＡＬＰ，Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素，以及看家基因 β
ａｃｔｉｎ的浓度结果直接由 ＰＣＲ仪生成。因各样品受
ＲＮＡ逆转录效率误差等的影响，每个样品 ｃＤＮＡ
含量不完全相同，为校正此误差，用看家基因 β
ａｃｔｉｎ作内参，样品ＡＬＰ，Ｉ型胶原蛋白、骨钙素基
因浓度与βａｃｔｉｎ基因的浓度的比值，即为 ＡＬＰ，Ｉ
型胶原蛋白、骨钙素基因校正后的相对含量。
２．５　统计方法
实验数据采用 ＳＰＳＳ１１０ＦｏｒＷｉｎｄｏｗｓ统计软
件进行统计学处理，样品间差异比较用ｔ检验，结果
以珋ｘ±ｓ表示，Ｐ＜００５有显著性差异。
３　结果
３．１　ＡＬＰ活性和Ｉ型胶原蛋白分泌测定结果
在提取物剂量为０２ｇ·Ｌ－１培养１４ｄ时，补骨
脂提取物对ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞ＡＬＰ活性和Ｉ型胶原蛋
白分泌具有明显的促进作用（Ｐ＜００５），但随着提
取物浓度的增加，相反有抑制作用（表３）。
表３　不同浓度补骨脂提取物对ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞ＡＬＰ活性和
Ｉ型胶原蛋白分泌的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
组别
剂量
／ｇ·Ｌ－１
ＡＬＰ活性
／Ｕ·μｇ－１
Ｉ型胶原蛋白
／μｇ／孔
补骨脂　 ００２ １４８５５±２１８２ ３２９７±０２７９
　 ０２ ２０５８０±０９８９１） ５２１５±０２８５１）
　 ２ １２２８８±１１２８ ２４４２±０５８１
空白对照 － １６０３２±２２０２ ３０５９±０８１４
　　注：与空白组比较１）Ｐ＜００５（表４同）。
３．２　ＡＬＰ，Ｉ型胶原蛋白、骨钙素ｍＲＮＡ表达结果
不同培养阶段，不同浓度补骨脂提取物对
ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞 ＡＬＰ，Ｉ型胶原蛋白、骨钙素 ｍＲＮＡ
表达的影响（表４）。
表４　ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞ＡＬＰ，Ｉ型胶原蛋白、骨钙素ｍＲＮＡ表达（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
基因 组别
剂量
／ｇ·Ｌ－１
培养时间／ｄ
７ １４ ２１
ＡＬＰ 补骨脂　 ００２ ０６９７±００４７ １３２４±０１０２ ０５０３±００６７
　 　 ０２ １２７５±０３０７１） １６７９±０１２７１） ０５２７±００８２
　 　 ２ ０５３７±００２９ ０８２３±００３２ ０４１６±００３４
　 空白对照 － ０６２９±００９４ １２８１±００９２ ０７８３±０１３２
Ｉ型胶原蛋白 补骨脂　 ００２ ２２３０±００６５ ２９８１±００６１ ４２０１±０１４５
　 　 ０２ ２５０４±０１４７ ３９０７±０３０２１） ５７２２±０２６２１）
　 　 ２ １２８６±０１０７ １６２３±０１３５ ２１７３±０６４７
　 空白对照 － ２５９３±０１７６ ３０１５±０３２９ ４３２４±０６５４
骨钙素 补骨脂　 ００２ ０８２３±００３４ １５３４±０１７５ １８４６±０１５８
　 　 ０２ １０８４±００７９ ２３４７±０３８７１） ２６９１±０３３８１）
　 　 ２ １０２１±００２８ １４３２±００５８ １５９３±００５４
　 空白对照 － １０３２±００６７ １３６３±０３２５ １７５８±０１９８
　　结果显示，补骨脂中剂量组，在７，１４ｄＡＬＰｍＲ
ＮＡ的表达与空白组相比较有显著性差异（Ｐ＜
００５），在１４，２１ｄＩ型胶原蛋白、骨钙素 ｍＲＮＡ的
表达与空白组相比较有显著性差异（Ｐ＜００５）。
４　讨论
本研究选用经典的前成骨细胞模型 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１
细胞为研究对象，观察在ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞的诱导成
骨过程中，补骨脂提取物对相关蛋白和基因表达的
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影响。成骨细胞的体外矿化过程可分为细胞增殖、
骨基质形成、成熟及骨基质矿化３个阶段，各阶段
的成骨细胞相关基因表达有特定的次序性。ＡＬＰ是
成骨细胞分化的早期指标之一，可促进无机磷的释
放和羟基磷灰石的形成。Ｉ型胶原蛋白是细胞外基
质的主要成分，是羟基磷灰石沉积反应的依托和骨
架。骨钙素与羟基磷灰石结合并沉积于胶原纤维
上，是成骨细胞分化的中期指标［９１０］。补骨脂提取
物能明显促进ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞ＡＬＰ活性和Ｉ型胶原
蛋白分泌。同时，从不同培养阶段 ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞
相关基因的表达量可以看出，补骨脂提取物在细胞
分化早期能明显促进 ＡＬＰｍＲＮＡ的表达，２１ｄ后
其作用减弱。在ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞分化中期，补骨脂
提取物能促进 Ｉ型胶原蛋白和骨钙素 ｍＲＮＡ的表
达，刺激骨形成从而发挥抗骨质疏松的作用。本研
究表明补骨脂提取物在成骨细胞不同的分化阶段对
相关基因的表达具有明显的促进作用，为骨质疏松
药物的开发以及补骨脂抗骨质疏松作用机制的研究
提供参考。
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ｔｉａｔｉｏｎａｎｄｂｏｎｅｎｏｄｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏ
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ＥｆｅｃｔｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅＦｒｕｃｔｕｓｐｓｏｒａｌｅａｅｏｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆ
ｍｏｕｓｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃＭＣ３Ｔ３Ｅ１ｃｅｌｉｎｖｉｔｒｏ
ＳＯＮＧＱｉｎ１，２，ＤＯＮＧＸｉａｏｐｉｎｇ２，ＹＵＸｉａｏｂｉｎｇ１，３
（１．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｌＲｅｎｅｗａｌ，ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅｏｆＸｉｎｘｉａｎｇ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＣｈｅｎｇｄｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００７５，Ｃｈｉｎａ；
３ＧａｏｙａｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｏｋｙｏ１１５００５５１，Ｊａｐａｎ）
　　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＦｒｕｃｔｕｓｐｓｏｒａｌｅａｅｏｎｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｏｓｔｅｏｂｌａｓｔＭＣ３Ｔ３Ｅ１ｃｅｌ
ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｎｅｏｎａｔａｌｍｏｕｓｅ＇ｓｃａｌｖａｒｉｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｆｐｓｏｒａｌｅａｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈｄｉｓｔｉｌｅｄｗａｔｅｒ．Ａｍｏｕｓｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｃｅｌ
ｌｉｎｅＭＣ３Ｔ３Ｅ１ｗａｓｕｓｅｄａｓａｃｅｌｍｏｄｅｌｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｐｏｔｅｎｃｙ．ＣｕｌｔｕｒｅｄＭＣ３Ｔ３Ｅ１ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ４ｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ
ａｎｄＦｐｓｏｒａｌｅａｅｅｘｔｒａｃｔ００２，０２，２（ｃｒｕｄｅｄｒｕｇ）ｇ·Ｌ－１，ｃｈａｎｇｅｔｈｅｍｅｄｉｕｍａｎｄｅｘｔｒａｃｔｅｖｅｒｙ３ｄａｙｓ．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＡＬＰａｎｄ
ｔｙｐｅⅠ ｃｏｌａｇｅｎｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＬＰ，ｔｙｐｅⅠ ｃｏｌａｇｅｎａｎｄｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｍＲＮＡｉｎＭＣ３Ｔ３Ｅ１ｃｅｌｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙ
ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡＬＰｗａｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｅｘｔｒａｃｔｏｆＦｐｓｏｒａｌｅａａｔｄｏｓｅｓ０２ｇ·Ｌ－１，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｙｐｅⅠ
ｃｏｌａｇｅｎｗａｓｅｎｃｏｕｒａｇｅｄａｔｄｏｓｅｓ０２ｇ·Ｌ－１．ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｏｆＦｐｓｏｒａｌｅａｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＬＰ，ｔｙｐｅⅠ ｃｏｌａｇｅｎａｎｄｏｓｔｅｏ
ｃａｌｃｉｎｍＲＮＡｉｎＭＣ３Ｔ３Ｅ１ｃｅｌ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＬＰｍＲＮＡｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄｂｙｅｘｔｒａｃｔｏｆＦｐｓｏｒａｌｅａａｔｄｏｓｅｓ０２ｇ·Ｌ－１ｆｏｒ７１４
ｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｙｐｅⅠ ｃｏｌａｇｅｎａｎｄｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｍＲＮＡｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄａｔｄｏｓｅｓ０２ｇ·Ｌ－１ｆｏｒ１４２１ｄａｙｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｆ
ｐｓｏｒａｌｅａｃａｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｉｔｗｉｌｏｆｅｒａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅａｃｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅｓｅａｒｃｈ．
［Ｋｅｙｗｒｏｄｓ］　Ｆｒｕｃｔｕｓｐｓｏｒａｌｅａｅ；ＡＬＰ；ｔｙｐｅⅠｃｏｌａｇｅｎ；ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
［责任编辑　古云侠］
·７６２１·
第３４卷第１０期
２００９年５月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１０
　 Ｍａｙ，２００９