全 文 ：不同种源益母草遗传关系的 ＩＳＳＲ分析
陈丽雅１，赵鹂２，白岩１，胡润淮１，斯金平１
（１．浙江林学院 天然药物研究开发中心，浙江 临安 ３１１３００；
２．丽水学院，浙江 丽水 ３２３０００）
［摘要］　目的：阐明不同种源益母草的遗传关系。方法：用 ＩＳＳＲ分子标记研究来自益母草主要分布区１９个种源样本。
结果：从１００个ＩＳＳＲ引物中筛选出２０个条带清晰、多态性高的引物，共扩增出１６４条带，其中１１７条带为多态性位点，多态性
条带比率（ＰＰＢ）为７１３４％，通过聚类分析，可将１９个益母草种源聚为３类。结论：分子标记研究结果与益母草的地理位置、
形态性状存在显著的相关性，较好地揭示了益母草种源间的遗传关系，可为益母草资源划分和良种选育提供科学依据。
［关键词］　种源；益母草；ＩＳＳＲ；遗传关系
［收稿日期］　２００８１０１０
［基金项目］　浙江省科技厅项目（２００７Ｃ３３０７８）
［通信作者］　斯金平，Ｔｅｌ：１３８６８００４０１９，Ｅｍａｉｌ：ｌｓｓｊｐ＠１６３．ｃｏｍ
　　益母草为唇形科植物益母草 Ｌｅｏｎｕｒｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ
Ｈｏｕｔ．的新鲜或干燥地上部分，其味辛、微苦，性微
寒，入心包、肝经，具有活血调瘀、利尿消肿之功效。
为中医妇科临床常用药，主治月经不调、胎漏难产、
行经腹痛等症［１］。国内外对益母草以及同属植物
的研究历史比较长，成果甚多，但是主要集中在生药
性状鉴别、有效成分的提取分离、药理与临床、栽培
等方面［２４］。已有研究表明不同地理种源的益母草
水苏碱含量不同［５］，但其有效成分的差异是否存在
着遗传基础，能否从分子水平上揭示其遗传规律，至
今未有报道。ＩＳＳＲ分子标记是一种以微卫星序
　　
列为引物，进行多位点 ＰＣＲ扩增的技术，广泛应
用于药用植物研究中。本研究采用 ＩＳＳＲ分子标
记，对９个省１９个不同种源的益母草进行遗传关
系分析，为益母草资源划分和良种选育提供科学
依据。
１　材料
供试材料为益母草新鲜嫩叶，２００８年７月采自
浙江林学院平山苗圃，包括浙江、江西、云南、甘肃、
黑龙江、河北、宁夏、吉林、辽宁等９个省１９个种源
（表１），全部样品经浙江林学院植物学教授楼炉焕
鉴定，除１３号样品外均为唇形科植物益母草。
表１　益母草种源地理位置
Ｎｏ． 材料来源 东经 北纬 Ｎｏ． 材料来源 东经 北纬
１ 浙江宁海 １２１４２° ２９５２° １１ 云南昆明 １０２７３° ２５０５°
２ 浙江平湖 １２１０２° ３０７０° １２ 江西南昌 １１５９０° ２８６８°
３ 浙江上虞 １２０８７° ３００３° １３ 甘肃陇西 １０４６２° ３４９８°
４ 浙江诸暨（店口） １２０３５° ２９９４° １４ 宁夏隆德 １０６１２° ３５６３°
５ 浙江诸暨（赵家） １２０４６° ２９７６° １５ 河北张家口 １１４８７° ４０８２°
６ 浙江义乌 １２００７° ２９３２° １６ 辽宁沈阳 １２３３８° ４１４８°
７ 浙江莲都 １１９９２° ２８４５° １７ 吉林长春 １２５３５° ４３８８°
８ 浙江武义（麻济） １１９６１° ２８６２° １８ 黑龙江鸡西 １３０９０° ４５３１°
９ 浙江武义（柳城） １１９８２° ２８９０° １９ 黑龙江齐齐哈尔 １２３９７° ４７３３°
１０ 浙江兰溪 １１９４８° ２９１２° 　 　 　 　
　　ＩＳＳＲ引物参考加拿大 ＵＢＣ大学提供的引物序
列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
２　方法
２．１　总 ＤＮＡ的提取和检测　基因组 ＤＮＡ提取经
过方法学比较，选用 ＣＴＡＢ提取法，其 ＤＮＡ浓度和
纯度经 ＮａｎｏＤｒｏｐ微量分光光度计（ＮＤ１０００）测定
ＢＦＱ，并于１％浓度的琼脂糖电泳检测，ＢＦ凝胶成像
系统（ＧｅｌＤｏｃＴＭ，ＢｉｏＲａｄ）观察并照相。
２．２　ＰＣＲ引物筛选　引物筛选包括初筛和复筛。利
用所提取的基因组ＤＮＡ作为ＰＣＲ反应模板，分别用
１个和３个模板对１００个引物进行初筛和复筛。
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第３４卷第１１期
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２．３　ＰＣＲ扩增及产物鉴定　ＰＣＲ反应体系由以下
基本条件构成：模板 ＤＮＡ，引物，ｄＮＴＰ，Ｍｇ２＋，耐热
Ｔａｑ酶，缓冲。由于 ＰＣＲ扩增受到上述众多因素的
影响，因此优化各反应参数对于获得稳定清晰的电
泳结果十分必要。通过对以上反应体系中的各个因
素、引物退火温度及循环参数的优化，最终确定
ＰＣＲ反应体系。扩增程序为９５℃预变性５ｍｉｎ；９４
℃变性３０ｓ，５６℃退火４５ｓ，７２℃延伸６０ｓ，共３８个
循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。在ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ９７００扩增
仪上进行扩增。
２．４　数据统计与分析　同一引物，同一位点，根据
扩增产物的有（１）无（０）得到二元资料，形成０，１矩
阵。用ＮＴｓｙｓ２１０ｅ软件进行分析，计算遗传相似系
数，运用ＵＰＭＧＡ法构建树状聚类图。
３　结果与分析
３．１　基因组ＤＮＡ结果检测与分析　获取高质量的
基因组 ＤＮＡ是试验成功的关键步骤之一。采用
ＣＴＡＢ法从益母草嫩叶中提取模板 ＤＮＡ，所提取
ＤＮＡ的 Ａ２６０／Ａ２８０在１８０～１９６，其浓度、纯度均符
合实验要求。
３．２　ＩＳＳＲ引物筛选分析　随机用１个样品对１００
个引物进行筛选，结果有较多引物都有扩增，每个引
物可扩增出１～１５条带不等；再次对条带清晰、主带
明显的初筛引物进行筛选，最终选用的２０个引物，
反应稳定、扩增性强和重复性好，见表２。
３．３　ＩＳＳＲ多态性分析　筛选出的２０个引物共检
测到１６４条带，平均每条引物扩增出８２条带，ＩＳＳＲ
扩增片段大约集中在２００～２８００ｂｐ。其中１１７条
带表现为多态性，占总的７１３４％，每个引物检测到
的多态性条带约有５８５条。扩增出条带最多的引
物为８０９，共１２条；条带最少的是引物８０７；多态性
最高的是引物８９９，多态率高达１００％，见表２。引
物８４０扩增的结果见图１。
３．４　遗传距离聚类分析　利用聚类分析软件 ＮＴ
ｓｙｓ２１０ｅ对ＩＳＳＲＰＣＲ扩增所得的多态性位点进行
分析，得到益母草１９个样品的遗传相似矩阵，可划
分成３大类，见图２。
第１类有１１个种源，包括１～１０和１２号种源，
前１０个种源都为浙江种源，而１２号是与浙江相邻
的江西种源，其抽薹前叶片较宽大，基部叶片宽楔
形，大部分叶片掌状３裂，浅裂或中裂，极少部分深
裂，裂片呈卵圆形，裂片上常有深缺刻，叶缘为粗大
　　 表２　引物序列及其扩增结果
引物 序列５′３′
总条
带数
多态性
带数
多态性
百分比／％
８０７ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴ ５ ３ ６０００
８０９ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧ １２ ８ ６６６７
８１０ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴ １１ ８ ７２７２
８１７ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡ ８ ６ ７５００
８１８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧ １０ ９ ９０００
８２５ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴ ８ ５ ６２５０
８２７ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＧ ８ ７ ８７５０
８３４ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＴ ８ ６ ７５００
８４０ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＴ １０ ７ ７０００
８４１ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＣ ８ ５ ６２５０
８４２ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＧ ７ ５ ７１４３
８４７ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＣ １１ ６ ５４５５
８４８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＧ ９ ７ ７７７８
８６１ ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ ９ ６ ６６６７
８６２ ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ８ ５ ６２５０
８７６ ＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡ ６ ４ ６６６７
８７８ ＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴ ６ ４ ６６６７
８８１ ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴ ７ ６ ８５７１
８９９ ＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡ ６ ６ １００００
９００ ＡＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＴＴＡＡＣＡＣＡ ７ ４ ５７１４
图１　引物８４０扩增结果（序号１～１９同表１）
图２　遗传聚类图
锯齿；其中８，９号种源地理位置相近，形态基本一
致，相似系数最大（为 ０９６３４），两者亲缘关系最
近。第２类７个种源，分别为１１，１４～１９号，１１号云
南种源叶片宽大，叶轮廓接近圆状，掌状３浅裂，裂
片呈卵圆形；其余为北方种源，叶片狭窄细长，叶分
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裂几乎达到基部或至２／３，以深裂为主，部分中裂，
裂片为狭楔形，裂片上再小分裂，最中间小裂片为宽
楔形。第３类只有１个种源（甘肃陇西），叶轮廓为
卵圆形至近圆形，不裂或３浅裂，分裂不到叶片１／
３，叶裂片宽大，其上有缺刻或粗锯齿状牙齿，不呈小
裂片状，植株各部贴有软柔毛，可能是柔毛益母草，
与其他 １８个种源遗传相似系数均在 ０５１２２～
０５７３２，表现出较远的亲缘关系。
４　结论与讨论
研究结果表明，益母草种源间存在明显的遗传
差异，通过聚类分析供试１９个种源可分为３大类，
其遗传变异与地理分布存在显著的相关性，地理位
置接近的种源遗传性状较为接近；与形态特征也存
在显著的相关性。
益母草属全世界约２３种，我国产１２种，绝大部
分分布于北温带。在我国则以华北、西北、东北为分
布中心。一些学者认为，产于北方的益母草有较好
的质量，生物碱含量较高，产于南方者普遍较低，产
地是决定药材质量的主要因素［５］，而 ＩＳＳＲ分子标
记研究结果表明，北方益母草质量较好，不仅源于产
地环境，而且有其遗传基础，这一结果为益母草新品
种选育和人工栽培提供了理论基础。
［参考文献］
［１］　中国药典．一部［Ｓ］．２００５：２０３．
［２］　巩长芹，周礼玲，王永平，等．益母草中益母草碱的 ＨＰＬＣ检测
［Ｊ］．广东药学院学报，２００７，２３（３）：２４７．
［３］　张娴，彭国平．益母草属化学成分研究进展［Ｊ］．天然产物研究
与开发，２００３，１５（２）：１６２．
［４］　徐建中，盛束军，姚金富，等．微肥对益母草生长和总生物碱积
累的调控效应［Ｊ］．中国中药杂志，２０００，２５（１）：２０．
［５］　晃志，王厄舟，周秀佳．益母草药材中生物碱含量与产地生态
环境的关系［Ｊ］．第一军医大学学报，２０００，２０（６）：５０４．
ＧｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓｏｆＬｅｏｎｕｒｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ
ｂｙＩＳＳＲｍａｒｋｅｒ
ＣＨＥＮＬｉｙａ１，ＺＨＡＯＬｉ２，ＢＡＩＹａｎ１，ＨＵＲｕｎｈｕａｉ１，ＳＩＪｉｎｐｉｎｇ１
（１．ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＮａｔｕｒａｌＭｅｄｉｃｉｎｅｓｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＣｏｌｅｇｅ，Ｌｉｎ′ａｎ３１１３００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＬｉｓｈｕｉＣｏｌｅｇｅ，Ｌｉｓｈｕｉ３２３００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓｏｆＬｅｏｎｕｒｕｓｊａｐｏｎｉ
ｃｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｉｎ１９ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ，ｗｈｉｃｈｃａｍｅｆｒｏｍｎａｔｉｏｎｗｉｄｅｏｒｉｇｉｎｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｕｓｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｗｉｔｈＩＳＳＲｍａｒｋｅｒ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｗｅｎｔｙＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ１００ＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｕｓｅｄｆｏｒＩＳＳＲａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ．Ａｔｏｔａｌｏｆ１６４ｂａｎｄｓｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ，ｏｆｗｈｉｃｈ１１７ｂａｎｄｓｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄ，ＰＰＢ＝
７１．３４％）．ＴｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈＮＴｓｙｓ２．１０ｅｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄｔｈｅｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈＵＰＧＭＡ．
Ｎｉｎｅｔｅｅｎｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ３ｔｙｐｅｓｕｓｉｎｇｔｈｅｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｒｅ
ｓｕｌｔｓｆｒｏｍｔｈｅｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｃｏｒｅｌａｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｗｉｔｈｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｏｃａｔｉｏｎｏｆ１９ｓａｍ
ｐｌｅｓ．ＴｈｅｄａｔａｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔＩＳＳＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｓｕｓｅｆｕｌｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐａｍｏｎｇＬｅｏｎｕｒｕｓｐｒｏｖｅ
ｎａｎｃｅｓ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｂａｓｉｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｎｅｗｃｕｌｔｉｖａｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ；Ｌｅｏｎｕｒｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ；ＩＳＳＲ；ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
［责任编辑　吕冬梅］
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