全 文 :乳香中西松烷型二萜类化合物
王峰1,2,李占林1,刘涛1,华会明
(1.沈阳药科大学 中药学院,辽宁 沈阳 110016;
2.广东药学院 中药学院,广东 广州 510006)
[摘要] 目的:研究乳香三氯甲烷提取物中的化学成分及其抗肿瘤活性。方法:利用色谱方法进行分离纯化,通过波谱
分析和单晶X射线衍射分析鉴定化合物结构;人白血病HL60细胞生长抑制实验采用细胞计数法。结果:从乳香中分离得到
4个西松烷型二萜,分别为incensoleoxide(1),acetylincensoleoxide(2),incensole(3),acetylincensole(4)。结论:化合物2和4
为首次从该属植物中分离得到;化合物4具有抑制HL60细胞生长作用,IG50值为(163±34)μmol·L
-1。
[关键词] 乳香;西松烷型二萜;抗肿瘤活性
[收稿日期] 20081025
[通信作者] 华会明,Tel:(024)23986465,Email:huimhua@163.
com
乳香(olibanum)为橄榄科植物卡氏乳香树 Bo
sweliacarteriBirdw的树脂,主产于红海沿岸的索马
里和埃塞俄比亚。前人对乳香的化学成分研究表
明,其中主要含有乳香酸类等三萜类成分[1]。现代
药理研究表明,乳香中的乳香酸类化合物具有抗炎
和对肿瘤细胞的抗增殖、分化诱导和凋亡诱导作
用[12]。为寻找乳香中具有抗肿瘤作用的活性成分,
对乳香的化学成分进行了研究。从乳香的三氯甲烷
提取物中分离得到4个西松烷型二萜,其中化合物
2和4为首次从该属植物中分离得到。虽然化合物
1和3以前曾从乳香中分离得到,但没有详细的核
磁数据报道[34]。本研究利用单晶X射线衍射分析
确证了化合物1的结构,并利用2DNMR对其核磁共
振信号进行了全归属,同时对其他3个二萜进行了13
CNMR数据全归属。通过人类白血病细胞HL60进
行体外抗肿瘤活性测试,发现化合物4具有细胞生长
抑制作用,IG50值为(163±34)μmol·L
-1。
1 材料
乳香购于辽宁省药材公司,经沈阳药科大学中
药学院药用植物教研室孙启时教授鉴定为卡氏乳香
树B.carteri的树脂。
BrukerARX(300和 AV(600型核磁共振仪
(TMS内标),Agilent1100SL型电喷雾质谱仪,
NICOLETR3M/E型 X射线衍射仪,柱色谱硅胶
(200~300目)和薄层色谱用硅胶 GF254(10~40
μm)为青岛海洋化工厂产品,SephadexLH20为GE
healthcare产品。所用试剂均为分析纯。
CO2培养箱为德国Heraeus公司产品,人类急性
髓细胞性白血病细胞株 HL60购自美国 ATCC公
司,胎牛血清购自Gibco公司。
2 提取和分离
乳香树脂1000g,经粉碎后,以三氯甲烷回流
提取3次,合并提取液并浓缩干燥,得浸膏678g,进
行硅胶(200~300目)柱色谱分离,以石油醚醋酸
乙酯梯度洗脱,得到5个部分:Part1~5。Part1进
行硅胶柱色谱,以石油醚醋酸乙酯(100∶0~95∶5)
梯度洗脱,得到160个流分(Fr.1160)。Fr.11~40
进行硅胶柱色谱,以石油醚丙酮(100∶1)洗脱,得到
化合物4(2000mg)。Fr.62~80进行硅胶柱色谱,
以石油醚丙酮(100∶0~100∶5)梯度洗脱,得到58
个流分(subFr.1~58),subFr.45经过 Sephadex
LH20色谱,以石油醚三氯甲烷甲醇(3∶1∶1)洗
脱,得到化合物2(12mg);subFr.18~20经反复硅
胶柱色谱分离,得到化合物3(14mg);subFr.37~
43经过硅胶柱色谱,以石油醚丙酮(200∶1~100∶
2)梯度洗脱,得到化合物1(9mg)。
3 化合物抗肿瘤活性试验
采用文献[5]中所述的台盼蓝法,考察了化合物1
~4在体外对人类急性髓细胞性白血病细胞株HL60
的细胞生长抑制活性。称取台盼蓝,加少量蒸馏水研
磨,加双蒸水稀释到4%的储存浓度,用滤纸过滤,4
℃保存。使用时,将该储存液用PBS稀释至04%工作
浓度。取HL60细胞(1×105个/mL)接种于12孔板,
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每孔2mL。加入不同浓度药物孵育后制备单个细胞
悬液,取50μL细胞悬液加入50μL的04%台盼蓝溶
液,混匀,在3min内,于显微镜下观察,死细胞被染成
蓝色,而活细胞拒染。用血球计数板分别计数活细胞
和死细胞。结果显示化合物4具有一定的细胞生长
抑制作用,IG50值为(163±34)μmol·L
-1。
4 结构鉴定
化合物1 无色针晶(丙酮),10%硫酸乙醇液显
紫红色。ESIMS给出[M+H]+m/z3232。1HNMR
(CDCl3,300MHz)谱给出了 5个甲基信号 δ090
(3H,d,J=69Hz),094(3H,d,J=69Hz),109
(3H,s),118(3H,s)和167(3H,s),其中2个甲基
双峰(090,094和δ215(1H,m)表明存在异丙基结
构单元;在 δ300(1H,dd,J=54,27Hz)和338
(3H,d,J=105Hz)处给出2个连氧碳上的质子信
号,在δ516(1H,t,J=60Hz)给出双键上的质子信
号。13CNMR(CDCl3,75MHz)谱给出了20个碳信号,
经DEPT实验归属为5个甲基、7个亚甲基、4个次甲
基和4个季碳,其中包括三取代的双键上2个碳信号
δ1356,1235,3个连氧季碳信号δ883,845,590,
2个连氧次甲基碳信号δ778,600。以上数据表明
该化合物为二萜类化合物;根据生源关系,推测该化
合物为西松烷型(cembrane)二萜[3]。HSQC,HMBC
证实了上述推测,并对1HNMR,13CNMR信号进行了
归属。HMBC谱(表 1)中,δ090(Me16)和 094
(Me17)均与δ328(C15)和883(C1)相关,δ215
(H15)与δ883(C1),168(Me16),185(Me17)
相关,说明该异丙基与 1个连氧季碳相连;δ109
(Me18)与δ367(C3),778(C5),845(C4)相关,
δ330(H5)与δ845(C4),367(C3),329(C7),
304(C6),200(Me18)相关,表明存在 CH2C
(CH3)CH(OH)CH2CH2片段;δ167(Me19)与 δ
1356(C8),1235(C9),329(C7)相关,表明该甲
基连接在1个三取代的双键上;烯氢质子δ516(H
9)与 δ382(C11),329(C7),239(C10),188
(Me19)相关,即存在CH2C(CH3)=CHCH2片段;δ
217(H10)与 δ1235(C9),382(C11),590(C
12)存在远程相关,δ118(Me20)与δ382(C11),
590(C12),600(C13)相关;δ300(H13)与δ360
(C14),883(C1)相关,表明存在 =CHCH2CH2C
(CH3)(O)CH(O)CH2片段。由C12(δ590)和C
13(δ600)的偏高场的化学位移,说明这2个碳之间
形成三元环氧结构。以上分析显示,该化合物为具有
1个14元环的大环化合物,符合西松烷型二萜的结构
特征。根据分子的不饱和度为4,推断在 C1和 C4
之间存在一氧桥(图1)。
表1 化合物1~4的NMR数据(CDCl3)
No.
1
δC δH HMBC(H→C)
2
δC
3
δC
4
δC
1 883 887 885 892
2 298 125m,195m 295 306 301
3 367 184(t,24),149(d,54) 353 363 384
4 845 832 841 829
5 778 338(d,105) C3,4,6,7,18 778 755 774
6 304 201m,145m 295 307 277
7 329 200m 327 323 354
8 1356 1351 1342 1352
9 1235 516(t,60) C7,10,11,19 1238 1250 1253
10 239 217m C9,11,12 237 248 247
11 382 204m,125m 379 347 347
12 590 593 1341 1331
13 600 300(dd,54,27) C1,14 599 1217 1209
14 360 179m,154m 355 323 319
15 328 215m C1,16,17 328 336 332
16 185 090(d,69) C1,15 170 180 180
17 168 094(d,69) C1,15 168 161 159
18 200 109s C3,4,5 215 206 220
19 188 167s C7,8,9 183 181 180
20 169 118s C11,12,13 170 179 179
CH3CO 1713 1712
CH3CO 213 213
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图1 化合物1~4的化学结构式
为了确证化合物1的立体结构,对其进行了X射
线单晶衍射测定。采用直接法解析结构,采用SIR92
程序直接获得非氢原子位置,差值Fourier法获得全
部氢原子位置,结构分析用WinGX程序完成。使用
全矩阵最小二乘法修正结构参数并判别原子种类。
衍射实验用晶体大小01mm×01mm×01mm,属
单斜晶系,空间群为P21。用RigakuRAPID面探测仪
收集衍射强度数据,Cu辐射,石墨单色器,以ω扫描
方式在200(2)K下收集衍射点(表2,3,图2)。综合
以上分析,化合物1鉴定为(1S,4R,5S,12R,13R)1,
4;12,13epoxy8Ecembrane5ol,即 incensoleoxide,
与文献[4,6]报道的数据对照一致。
表2 化合物1的晶体学参数
Formula C20H34O3 b/? 188346(16) Dc/mg·m3 1133
Mr 32247 c/? 79434(7) θrange/° 47~6984
T/K 200(2) β/° 98983(3) Reflectionscolected/unique 6302/2825
λ/nm 0154180 V/?3 94497(15) GOF 2178
Crystalsystem monoclinic Z 2 R1 00593
Spacegroup P21 μ/mm-1 0578 wR2 00928
a/? 63946(6) F(000) 356 Largestdif.peakandhole(e?-3) 0166,-0177
表3 化合物1的键长和键角
OC/CC 键长(键角) OC/CC 键长(键角) OC/CC 键长(键角)
O(1)C(20) 1467(4) C(6)C(7) 1503(4) O(11)C(15) 1455(4)
O(1)C(20) 1467(4) C(6)C(8) 1511(5) C(13)C(14) 1529(4)
O(1)C(1) 1478(4) C(8)C(9) 1543(4) C(14)C(15) 1529(5)
C(1)C(20) 1471(5) C(9)C(10) 1506(4) C(15)C(19) 1536(5)
C(1)C(3) 1505(5) C(10)O(10) 1433(4) C(15)C(16) 1544(5)
C(1)C(2) 1507(5) C(10)C(11) 1547(4) C(16)C(17) 1527(5)
C(3)C(4) 1540(5) C(11)O(11) 1461(3) C(16)C(18) 1538(5)
C(4)C(5) 1500(4) C(11)C(12) 1521(4) C(19)C(20) 1503(4)
C(5)C(6) 1331(4) C(11)C(13) 1530(4)
C(20)O(1)C(1) 599(2) C(10)C(9)C(8) 1131(3) O(11)C(15)C(19) 1079(2)
C(20)C(1)O(1) 596(2) O(10)C(10)C(9) 1082(3) C(14)C(15)C(19) 1120(3)
C(20)C(1)C(3) 1192(3) O(10)C(10)C(11) 1089(3) O(11)C(15)C(16) 1071(3)
O(1)C(1)C(3) 1122(3) C(9)C(10)C(11) 1144(3) C(14)C(15)C(16) 1143(3)
C(20)C(1)C(2) 1200(3) O(11)C(11)C(12) 1070(3) C(19)C(15)C(16) 1110(3)
O(1)C(1)C(2) 1139(3) O(11)C(11)C(13) 1058(3) C(17)C(16)C(18) 1103(3)
C(3)C(1)C(2) 1173(3) C(12)C(11)C(13) 1133(3) C(17)C(16)C(15) 1133(3)
C(1)C(3)C(4) 1140(3) O(11)C(11)C(10) 1069(2) C(18)C(16)C(15) 1114(3)
C(5)C(4)C(3) 1134(3) C(12)C(11)C(10) 1121(3) C(20)C(19)C(15) 1132(3)
C(6)C(5)C(4) 1289(3) C(13)C(11)C(10) 1111(3) O(1)C(20)C(1) 604(2)
C(5)C(6)C(7) 1225(3) C(15)O(11)C(11) 1110(2) O(1)C(20)C(19) 1168(3)
C(5)C(6)C(8) 1203(3) C(14)C(13)C(11) 1050(3) C(1)C(20)C(19) 1246(3)
C(7)C(6)C(8) 1172(3) C(13)C(14)C(15) 1038(3)
C(6)C(8)C(9) 1140(3) O(11)C(15)C(14) 1040(3)
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图2 化合物1的ORTEP结构
化合物2 无色针晶(丙酮),10%硫酸乙醇液
显紫红色。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ:090(3H,
d,J=69Hz,H16),092(3H,d,J=69Hz,H
17),113(3H,s,H18),122(3H,s,H20),162
(3H,s,H19),208(3H,s,CH3CO),495(1H,d,
J=105Hz,H5),527(1H,t,J=60Hz,H9)。
13CNMR(CDCl3,75MHz)谱数据见表1。该化合物
的数据与化合物1十分相似,所不同的是1HNMR
多出1个乙酰基上甲基信号 δ208(3H,s),13C
NMR中多出了 1组乙酰基碳信号 δ1714和 δ
213,而且5位上的质子信号与化合物1相比显著
向低场位移,因此,推断化合物2为化合物1的5位
上的羟基发生乙酰化。与文献[7]对照,其波谱数
据与acetylincensoleoxide基本一致,确定该化合物
为acetylincensoleoxide。
化合物3 淡黄色油状物,10%硫酸乙醇液显
紫红色。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ:090(6H,d,
J=68Hz,H16,17),107(3H,s,H18),150
(3H,s,H20),162(3H,s,H19),330(1H,d,J=
100Hz,H5),510(2H,m,H9,13)。13CNMR
(CDCl3,75MHz)谱数据见表 1。将其波谱数据与
文献[3]对照基本一致,确定该化合物的结构为 in
censole。
化合物4 淡黄色油状物,10%硫酸乙醇液显
紫红色。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ:089(3H,d,
J=68Hz,H16),091(3H,d,J=68Hz,H17),
111(3H,s,H18),155(3H,s,H20),159(3H,s,
H19),206(3H,s,CH3CO),488(1H,d,J=102
Hz,H5),516(2H,m,H9,13)。13CNMR(CDCl3,
75MHz)谱数据见表1。将其光谱数据与文献[7]
对照基本一致,确定该化合物为acetylincensole。
[致谢] 单晶 X射线衍射由 CenterforPharmaceutical
BiotechnologyandDepartmentofMedicinalChemistryandPhar
macognosy,UniversityofIlinois(Chicago,USA)测定,美国西
奈山医学院景永奎教授及王蕊博士代测化合物抗肿瘤活性。
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Cembranediterpenesinolibanum
WANGFeng1,2,LIZhanlin1,LIUTao1,HUAHuiming1
(1.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;
2.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)
[Abstract] Objective:Tostudytheconstituentsinthechloroformextractofolibanumandtheirantitumoractivities.Method:
Thecompoundswereisolatedbychromatographicmethodsandtheirstructureswereidentifiedonthebasisofspectroscopicmethodsand
Xraydifraction.TheantiproliferativeefectofthecompoundsinhumanleukemiaHL60celswastestedbyviablecelcounting.Re
sult:Fourcembranediterpeneswereisolatedandidentifiedasincensoleoxide(1),acetylincensoleoxide(2),incensole(3),and
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acetylincensole(4).Conclusion:Compounds2and4wereisolatedfromthegenusBosweliaforthefirsttime.Compound4showed
growthinhibitoryefectagainsthumanleukemiaHL60cellineswithIG50valueof163±34μm.
[Keywords] Bosweliacarteri;cembranediterpene;antitumoractivity
[责任编辑 王亚君]
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