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Cembrane diterpenes in olibanum

乳香中西松烷型二萜类化合物



全 文 :乳香中西松烷型二萜类化合物
王峰1,2,李占林1,刘涛1,华会明 
(1.沈阳药科大学 中药学院,辽宁 沈阳 110016;
2.广东药学院 中药学院,广东 广州 510006)
[摘要] 目的:研究乳香三氯甲烷提取物中的化学成分及其抗肿瘤活性。方法:利用色谱方法进行分离纯化,通过波谱
分析和单晶X射线衍射分析鉴定化合物结构;人白血病HL60细胞生长抑制实验采用细胞计数法。结果:从乳香中分离得到
4个西松烷型二萜,分别为incensoleoxide(1),acetylincensoleoxide(2),incensole(3),acetylincensole(4)。结论:化合物2和4
为首次从该属植物中分离得到;化合物4具有抑制HL60细胞生长作用,IG50值为(163±34)μmol·L
-1。
[关键词] 乳香;西松烷型二萜;抗肿瘤活性
[收稿日期] 20081025
[通信作者] 华会明,Tel:(024)23986465,Email:huimhua@163.
com
  乳香(olibanum)为橄榄科植物卡氏乳香树 Bo
sweliacarteriBirdw的树脂,主产于红海沿岸的索马
里和埃塞俄比亚。前人对乳香的化学成分研究表
明,其中主要含有乳香酸类等三萜类成分[1]。现代
药理研究表明,乳香中的乳香酸类化合物具有抗炎
和对肿瘤细胞的抗增殖、分化诱导和凋亡诱导作
用[12]。为寻找乳香中具有抗肿瘤作用的活性成分,
对乳香的化学成分进行了研究。从乳香的三氯甲烷
提取物中分离得到4个西松烷型二萜,其中化合物
2和4为首次从该属植物中分离得到。虽然化合物
1和3以前曾从乳香中分离得到,但没有详细的核
磁数据报道[34]。本研究利用单晶X射线衍射分析
确证了化合物1的结构,并利用2DNMR对其核磁共
振信号进行了全归属,同时对其他3个二萜进行了13
CNMR数据全归属。通过人类白血病细胞HL60进
行体外抗肿瘤活性测试,发现化合物4具有细胞生长
抑制作用,IG50值为(163±34)μmol·L
-1。
1 材料
乳香购于辽宁省药材公司,经沈阳药科大学中
药学院药用植物教研室孙启时教授鉴定为卡氏乳香
树B.carteri的树脂。
BrukerARX(300和 AV(600型核磁共振仪
(TMS内标),Agilent1100SL型电喷雾质谱仪,
NICOLETR3M/E型 X射线衍射仪,柱色谱硅胶
(200~300目)和薄层色谱用硅胶 GF254(10~40
μm)为青岛海洋化工厂产品,SephadexLH20为GE
healthcare产品。所用试剂均为分析纯。
CO2培养箱为德国Heraeus公司产品,人类急性
髓细胞性白血病细胞株 HL60购自美国 ATCC公
司,胎牛血清购自Gibco公司。
2 提取和分离
乳香树脂1000g,经粉碎后,以三氯甲烷回流
提取3次,合并提取液并浓缩干燥,得浸膏678g,进
行硅胶(200~300目)柱色谱分离,以石油醚醋酸
乙酯梯度洗脱,得到5个部分:Part1~5。Part1进
行硅胶柱色谱,以石油醚醋酸乙酯(100∶0~95∶5)
梯度洗脱,得到160个流分(Fr.1160)。Fr.11~40
进行硅胶柱色谱,以石油醚丙酮(100∶1)洗脱,得到
化合物4(2000mg)。Fr.62~80进行硅胶柱色谱,
以石油醚丙酮(100∶0~100∶5)梯度洗脱,得到58
个流分(subFr.1~58),subFr.45经过 Sephadex
LH20色谱,以石油醚三氯甲烷甲醇(3∶1∶1)洗
脱,得到化合物2(12mg);subFr.18~20经反复硅
胶柱色谱分离,得到化合物3(14mg);subFr.37~
43经过硅胶柱色谱,以石油醚丙酮(200∶1~100∶
2)梯度洗脱,得到化合物1(9mg)。
3 化合物抗肿瘤活性试验
采用文献[5]中所述的台盼蓝法,考察了化合物1
~4在体外对人类急性髓细胞性白血病细胞株HL60
的细胞生长抑制活性。称取台盼蓝,加少量蒸馏水研
磨,加双蒸水稀释到4%的储存浓度,用滤纸过滤,4
℃保存。使用时,将该储存液用PBS稀释至04%工作
浓度。取HL60细胞(1×105个/mL)接种于12孔板,
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每孔2mL。加入不同浓度药物孵育后制备单个细胞
悬液,取50μL细胞悬液加入50μL的04%台盼蓝溶
液,混匀,在3min内,于显微镜下观察,死细胞被染成
蓝色,而活细胞拒染。用血球计数板分别计数活细胞
和死细胞。结果显示化合物4具有一定的细胞生长
抑制作用,IG50值为(163±34)μmol·L
-1。
4 结构鉴定
化合物1 无色针晶(丙酮),10%硫酸乙醇液显
紫红色。ESIMS给出[M+H]+m/z3232。1HNMR
(CDCl3,300MHz)谱给出了 5个甲基信号 δ090
(3H,d,J=69Hz),094(3H,d,J=69Hz),109
(3H,s),118(3H,s)和167(3H,s),其中2个甲基
双峰(090,094和δ215(1H,m)表明存在异丙基结
构单元;在 δ300(1H,dd,J=54,27Hz)和338
(3H,d,J=105Hz)处给出2个连氧碳上的质子信
号,在δ516(1H,t,J=60Hz)给出双键上的质子信
号。13CNMR(CDCl3,75MHz)谱给出了20个碳信号,
经DEPT实验归属为5个甲基、7个亚甲基、4个次甲
基和4个季碳,其中包括三取代的双键上2个碳信号
δ1356,1235,3个连氧季碳信号δ883,845,590,
2个连氧次甲基碳信号δ778,600。以上数据表明
该化合物为二萜类化合物;根据生源关系,推测该化
合物为西松烷型(cembrane)二萜[3]。HSQC,HMBC
证实了上述推测,并对1HNMR,13CNMR信号进行了
归属。HMBC谱(表 1)中,δ090(Me16)和 094
(Me17)均与δ328(C15)和883(C1)相关,δ215
(H15)与δ883(C1),168(Me16),185(Me17)
相关,说明该异丙基与 1个连氧季碳相连;δ109
(Me18)与δ367(C3),778(C5),845(C4)相关,
δ330(H5)与δ845(C4),367(C3),329(C7),
304(C6),200(Me18)相关,表明存在 CH2C
(CH3)CH(OH)CH2CH2片段;δ167(Me19)与 δ
1356(C8),1235(C9),329(C7)相关,表明该甲
基连接在1个三取代的双键上;烯氢质子δ516(H
9)与 δ382(C11),329(C7),239(C10),188
(Me19)相关,即存在CH2C(CH3)=CHCH2片段;δ
217(H10)与 δ1235(C9),382(C11),590(C
12)存在远程相关,δ118(Me20)与δ382(C11),
590(C12),600(C13)相关;δ300(H13)与δ360
(C14),883(C1)相关,表明存在 =CHCH2CH2C
(CH3)(O)CH(O)CH2片段。由C12(δ590)和C
13(δ600)的偏高场的化学位移,说明这2个碳之间
形成三元环氧结构。以上分析显示,该化合物为具有
1个14元环的大环化合物,符合西松烷型二萜的结构
特征。根据分子的不饱和度为4,推断在 C1和 C4
之间存在一氧桥(图1)。
表1 化合物1~4的NMR数据(CDCl3)
No.

δC δH HMBC(H→C)

δC

δC

δC
1 883     887 885 892
2 298 125m,195m   295 306 301
3 367 184(t,24),149(d,54)   353 363 384
4 845     832 841 829
5 778 338(d,105) C3,4,6,7,18 778 755 774
6 304 201m,145m   295 307 277
7 329 200m   327 323 354
8 1356     1351 1342 1352
9 1235 516(t,60) C7,10,11,19 1238 1250 1253
10 239 217m C9,11,12 237 248 247
11 382 204m,125m   379 347 347
12 590     593 1341 1331
13 600 300(dd,54,27) C1,14 599 1217 1209
14 360 179m,154m   355 323 319
15 328 215m C1,16,17 328 336 332
16 185 090(d,69) C1,15 170 180 180
17 168 094(d,69) C1,15 168 161 159
18 200 109s C3,4,5 215 206 220
19 188 167s C7,8,9 183 181 180
20 169 118s C11,12,13 170 179 179
CH3CO       1713   1712
CH3CO       213   213
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图1 化合物1~4的化学结构式
  为了确证化合物1的立体结构,对其进行了X射
线单晶衍射测定。采用直接法解析结构,采用SIR92
程序直接获得非氢原子位置,差值Fourier法获得全
部氢原子位置,结构分析用WinGX程序完成。使用
全矩阵最小二乘法修正结构参数并判别原子种类。
衍射实验用晶体大小01mm×01mm×01mm,属
单斜晶系,空间群为P21。用RigakuRAPID面探测仪
收集衍射强度数据,Cu辐射,石墨单色器,以ω扫描
方式在200(2)K下收集衍射点(表2,3,图2)。综合
以上分析,化合物1鉴定为(1S,4R,5S,12R,13R)1,
4;12,13epoxy8Ecembrane5ol,即 incensoleoxide,
与文献[4,6]报道的数据对照一致。
表2 化合物1的晶体学参数
Formula C20H34O3 b/? 188346(16) Dc/mg·m3 1133
Mr 32247 c/? 79434(7) θrange/° 47~6984
T/K 200(2) β/° 98983(3) Reflectionscolected/unique 6302/2825
λ/nm 0154180 V/?3 94497(15) GOF 2178
Crystalsystem monoclinic Z 2 R1 00593
Spacegroup P21 μ/mm-1 0578 wR2 00928
a/? 63946(6) F(000) 356 Largestdif.peakandhole(e?-3) 0166,-0177
表3 化合物1的键长和键角
OC/CC 键长(键角) OC/CC 键长(键角) OC/CC 键长(键角)
O(1)C(20) 1467(4) C(6)C(7) 1503(4) O(11)C(15) 1455(4)
O(1)C(20) 1467(4) C(6)C(8) 1511(5) C(13)C(14) 1529(4)
O(1)C(1) 1478(4) C(8)C(9) 1543(4) C(14)C(15) 1529(5)
C(1)C(20) 1471(5) C(9)C(10) 1506(4) C(15)C(19) 1536(5)
C(1)C(3) 1505(5) C(10)O(10) 1433(4) C(15)C(16) 1544(5)
C(1)C(2) 1507(5) C(10)C(11) 1547(4) C(16)C(17) 1527(5)
C(3)C(4) 1540(5) C(11)O(11) 1461(3) C(16)C(18) 1538(5)
C(4)C(5) 1500(4) C(11)C(12) 1521(4) C(19)C(20) 1503(4)
C(5)C(6) 1331(4) C(11)C(13) 1530(4)    
C(20)O(1)C(1) 599(2) C(10)C(9)C(8) 1131(3) O(11)C(15)C(19) 1079(2)
C(20)C(1)O(1) 596(2) O(10)C(10)C(9) 1082(3) C(14)C(15)C(19) 1120(3)
C(20)C(1)C(3) 1192(3) O(10)C(10)C(11) 1089(3) O(11)C(15)C(16) 1071(3)
O(1)C(1)C(3) 1122(3) C(9)C(10)C(11) 1144(3) C(14)C(15)C(16) 1143(3)
C(20)C(1)C(2) 1200(3) O(11)C(11)C(12) 1070(3) C(19)C(15)C(16) 1110(3)
O(1)C(1)C(2) 1139(3) O(11)C(11)C(13) 1058(3) C(17)C(16)C(18) 1103(3)
C(3)C(1)C(2) 1173(3) C(12)C(11)C(13) 1133(3) C(17)C(16)C(15) 1133(3)
C(1)C(3)C(4) 1140(3) O(11)C(11)C(10) 1069(2) C(18)C(16)C(15) 1114(3)
C(5)C(4)C(3) 1134(3) C(12)C(11)C(10) 1121(3) C(20)C(19)C(15) 1132(3)
C(6)C(5)C(4) 1289(3) C(13)C(11)C(10) 1111(3) O(1)C(20)C(1) 604(2)
C(5)C(6)C(7) 1225(3) C(15)O(11)C(11) 1110(2) O(1)C(20)C(19) 1168(3)
C(5)C(6)C(8) 1203(3) C(14)C(13)C(11) 1050(3) C(1)C(20)C(19) 1246(3)
C(7)C(6)C(8) 1172(3) C(13)C(14)C(15) 1038(3)    
C(6)C(8)C(9) 1140(3) O(11)C(15)C(14) 1040(3)    
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图2 化合物1的ORTEP结构
  化合物2 无色针晶(丙酮),10%硫酸乙醇液
显紫红色。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ:090(3H,
d,J=69Hz,H16),092(3H,d,J=69Hz,H
17),113(3H,s,H18),122(3H,s,H20),162
(3H,s,H19),208(3H,s,CH3CO),495(1H,d,
J=105Hz,H5),527(1H,t,J=60Hz,H9)。
13CNMR(CDCl3,75MHz)谱数据见表1。该化合物
的数据与化合物1十分相似,所不同的是1HNMR
多出1个乙酰基上甲基信号 δ208(3H,s),13C
NMR中多出了 1组乙酰基碳信号 δ1714和 δ
213,而且5位上的质子信号与化合物1相比显著
向低场位移,因此,推断化合物2为化合物1的5位
上的羟基发生乙酰化。与文献[7]对照,其波谱数
据与acetylincensoleoxide基本一致,确定该化合物
为acetylincensoleoxide。
化合物3 淡黄色油状物,10%硫酸乙醇液显
紫红色。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ:090(6H,d,
J=68Hz,H16,17),107(3H,s,H18),150
(3H,s,H20),162(3H,s,H19),330(1H,d,J=
  
100Hz,H5),510(2H,m,H9,13)。13CNMR
(CDCl3,75MHz)谱数据见表 1。将其波谱数据与
文献[3]对照基本一致,确定该化合物的结构为 in
censole。
化合物4 淡黄色油状物,10%硫酸乙醇液显
紫红色。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ:089(3H,d,
J=68Hz,H16),091(3H,d,J=68Hz,H17),
111(3H,s,H18),155(3H,s,H20),159(3H,s,
H19),206(3H,s,CH3CO),488(1H,d,J=102
Hz,H5),516(2H,m,H9,13)。13CNMR(CDCl3,
75MHz)谱数据见表1。将其光谱数据与文献[7]
对照基本一致,确定该化合物为acetylincensole。
[致谢] 单晶 X射线衍射由 CenterforPharmaceutical
BiotechnologyandDepartmentofMedicinalChemistryandPhar
macognosy,UniversityofIlinois(Chicago,USA)测定,美国西
奈山医学院景永奎教授及王蕊博士代测化合物抗肿瘤活性。
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Cembranediterpenesinolibanum
WANGFeng1,2,LIZhanlin1,LIUTao1,HUAHuiming1
(1.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;
2.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)
[Abstract] Objective:Tostudytheconstituentsinthechloroformextractofolibanumandtheirantitumoractivities.Method:
Thecompoundswereisolatedbychromatographicmethodsandtheirstructureswereidentifiedonthebasisofspectroscopicmethodsand
Xraydifraction.TheantiproliferativeefectofthecompoundsinhumanleukemiaHL60celswastestedbyviablecelcounting.Re
sult:Fourcembranediterpeneswereisolatedandidentifiedasincensoleoxide(1),acetylincensoleoxide(2),incensole(3),and
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acetylincensole(4).Conclusion:Compounds2and4wereisolatedfromthegenusBosweliaforthefirsttime.Compound4showed
growthinhibitoryefectagainsthumanleukemiaHL60cellineswithIG50valueof163±34μm.
[Keywords] Bosweliacarteri;cembranediterpene;antitumoractivity
[责任编辑 王亚君]
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