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Constituents from Alternanthera philoxeroides and their antitumor activity

空心莲子草化学成分及抗癌活性研究



全 文 :空心莲子草化学成分及抗癌活性研究
方进波1,2,陈家春2,刘焱文3,段宏泉4
(1.天津大学 药学院,天津 300072;
2.华中科技大学 同济药学院 湖北省天然药物化学与资源评价重点实验室,湖北 武汉 430030;
3.湖北中医学院,湖北 武汉 430061;4.天津医科大学 药学院 基础医学研究中心,天津 300070)
[摘要] 目的:研究空心莲子草 Alternantheraphiloxeroides正丁醇提取物的抗肿瘤活性成分。方法:以硅胶柱、凝胶柱色
谱分离,制备HPLC纯化,采用MS,NMR等波谱方法以及酸水解进行结构鉴定,以MTT法测试石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取
物以及各化合物的细胞毒活性。结果:从正丁醇提取部位分离得到7个化合物:齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖醛酸苷(olean
olicacid3OβDglucuropyranoside,1),齐墩果酸28OβD吡喃葡萄糖苷(oleanolicacid28OβDglucopyranoside,2),齐墩果
酸3OβD吡喃葡萄糖醛酸苷6′O甲酯(oleanolicacid3OβDglucuronopyranoside6′Omethylester,3),竹节参苷 IVa甲酯
(chikusetsusaponinIVamethylester,4),常春藤皂苷元3OβD吡喃葡萄糖醛酸苷6′O甲酯(hederagenin3OβDglucuro
nopyranoside6′Omethylester,5),4,5二羟基布卢姆醇(4,5dihydroblumenol,6),(6S,7E,9R)6,9dihydroxymegastigma4,7
dien3one9OβDglucopyranoside(7),化合物1在30mg·L-1剂量时对Hela和 L929抑制率分别为913%和929%。结论:
化合物4,5,7首次从该属植物中分得,化合物1在 30mg·L-1剂量时对Hela和L929具有显著抑制活性。
[关键词] 空心莲子草;正丁醇提取物;抗癌活性
[收稿日期] 20090426
[通信作者] 段宏泉,Tel:(022)23542018,Email:duanhq@tijmu.
edu.cn
  空心莲子草 Alternantheraphiloxeroides(Mart.)
Griseb.又名螃蜞菊、空心苋、水花生,为苋科莲子草
属植物空心莲子草的干燥全草,性寒、味苦;具有清
热、凉血、解毒等功效;临床上用于治疗麻疹、流行性
感冒、乙型脑炎、流行性出血热等病毒性疾患。文献
报道其提取物体外具有抗病毒、保肝、免疫调节等作
用。药理试验表明,空心莲子草的醇提物的正丁醇
部位具有较强的抗肿瘤活性,在200mg·L-1给药
剂量时,对Hela和L929细胞抑制率分别为100%,
9725%。为研究其活性成分,作者利用多种柱色谱
方法,从中分得了7个化合物。
1 材料
BrukerAVANCE300instrument;日本分光公司
(JASCO),PU2089(泵),RI2031和 UV2075(检测
器);制备色谱柱:Econosphere(20mm×250mm,7
μm)(Altech),YMCPackSIL06(20mm×250mm,
5μm)(YMC),YMCPackODSA(20mm×250mm,
5μm)(YMC);ToyopearlHW40C(Tosoh);JEOL
JMSSX102A(EI,ESIMS)质谱仪;液质联用色谱仪:
Aliance2695,QuatroMicroTMESI(Waters)。
D葡萄糖、D葡萄糖醛酸(Sigma);薄层色谱和柱
色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂生产,所用试剂均为
分析纯。美国BioRad550酶标仪;美国REVCOCO2
培养箱。胎牛血清为杭州四季青公司产品。Hela和
L929细胞株均由天津医药科学研究所提供。
空心莲子草2004年11月采集于湖北省武汉市
武昌区南湖,经中南民族大学生命科学学院万定荣
教授鉴定为A.philoxeroides,标本(D20040803)存放
于天津医科大学药学院。
2 提取与分离
干燥的空心莲子草(地上部分)90kg,切段,加
95%乙醇回流提取,减压浓缩得稠浸膏,加水混悬,
依次用水饱和的石油醚(60~90℃)、醋酸乙酯和正
丁醇萃取,分别得到石油醚(60~90℃)提取物77
g,醋酸乙酯提取物53g,正丁醇提取物2715g。取
正丁醇提取物(30g)分别经硅胶柱和凝胶柱(Toyo
pearlHW40C)反复分离,制备HPLC纯化得到化合
物1(366mg),2(644mg),3(127mg),4(820
mg),5(111mg),6(100mg),7(351mg)。
3结构鉴定
化合物(1~5,7) 1mg溶于2mL70%乙醇溶
液中,加入1mL1mol·L-1的三氟乙酸,封管回流
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水解6h,减压蒸干溶剂,残留物用70%甲醇溶解,
硅胶G薄层色谱,以D葡萄糖、D葡萄糖醛酸对照,
展开剂三氯甲烷甲醇1%冰醋酸(12∶8∶2),茴香醛
-浓硫酸试剂显色,葡萄糖醛酸(Rf044),葡萄糖
(Rf058)。
化合物1 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
631[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:081,
085,091,094,095,106,116(each3H,s,7×
CH3),524(1H,brs,H12),435(1H,d,J=77
Hz,GlcUAH1′),318(1H,dd,J=46,115Hz,H
3)。13CNMR(CD3OD,75MHz)见表1。以上波谱数
据与文献[1]一致。化合物 1经酸水解后与D葡萄
糖醛酸薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定为oleanolic
acid3OβDglucuropyranoside。
化合物2 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
617[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:080,
085,091,093,095,105,116(each3H,s,7×
CH3),525(1H,brs,H12),538(1H,d,J=79
Hz,GlcH1′),320(1H,overlapped,H3)。13CNMR
(CD3OD,75MHz)见表 1。以上波谱数据与文献
[1]一致。化合物2经酸水解后与D葡萄糖薄层色
谱对照,Rf值一致,故鉴定为 oleanolicacid28Oβ
Dglucopyranoside。
化合物3 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
645[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:081,
085,091,094,094,104,116(各 3H,s,7×
CH3),524(1H,brs,H12),438(1H,d,J=77
Hz,GlcUAH1′),377(3H,s,GlcUA6′OMe)。13C
NMR(CD3OD,75MHz)见表1。以上波谱数据与文
献[2]一致。化合物3经酸水解后与D葡萄糖醛酸
薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定为oleanolicacid3
OβDglucuronopyranoside6′Omethylester。
化合物4 白色针状结晶(MeOH)。(-)ESI
MSm/z807[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:
076,080,091,093,095,104,111(each3H,s,
7×CH3),525(1H,brs,H12),538(1H,d,J=77
Hz,GlcH1″),438(1H,d,J=77Hz,GlcUAH
1′)。13CNMR(CD3OD,75MHz)见表1。以上波谱数
据与文献[3]一致。化合物4经酸水解后与 D葡萄
糖醛酸、D葡萄糖薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定
为 oleanolicacid3O[βDglucuronopyranosyl6′O
methylester]28OβDglucopyranoside,即竹节参苷
表1 化合物1~5的13CNMR(CD3OD,75MHz)数据
No. 1 2 3 4 5
1 399 400 398 399 395
2 290 270 271 271 265
3 910 788 912 912 835
4 403 408 402 403 431
5 571 571 570 571 481
6 194 179 194 194 189
7 340 336 339 340 335
8 407 403 406 408 406
9 500 481 491 499 499
10 380 380 379 380 377
11 247 247 241 241 241
12 1238 1240 1237 1239 1237
13 1453 1449 1453 1449 1453
14 429 430 430 430 431
15 286 286 289 290 289
16 242 241 246 246 246
17 474 473 477 473 477
18 430 427 428 427 428
19 478 472 473 473 473
20 317 316 317 316 317
21 350 350 350 350 350
22 341 341 341 332 337
23 265 290 286 285 647
24 171 171 170 170 135
25 161 162 160 161 165
26 179 194 178 178 179
27 270 264 266 264 266
28 1821 1782 1820 1782 1820
29 337 333 337 336 337
30 241 241 241 241 241
3GlucA          
1′ 1069   1071 1071 1061
2′ 756   753 754 753
3′ 780   775 776 776
4′ 738   732 733 733
5′ 768   766 767 776
6′ 1765   1715 1715 1715
6′OMe     529 529 529
28Glc          
1″   958   958  
2″   740   740  
3″   782   784  
4″   712   712  
5″   784   788  
6″   625   625
IVa甲酯(chikusetsusaponinIVamethylester)。
化合物5 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
663[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:071,
081,091,094,098,118(each3H,s,6×CH3),
524(1H,brs,H12),446(1H,d,J=77Hz,Glc
H1″)。13CNMR(CD3OD,75MHz)见表1。以上波
谱数据与文献[2]一致。化合物5经酸水解后与D
葡萄糖醛酸薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定为
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hederagenin3OβDglucuronopyranoside6′Omethyl
ester。
  化合物6 白色无定形粉末。EIMSm/z224
[M]+。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:248(1H,d,
J=169Hz,H2a),216(1H,d,J=169Hz,H
2b),588(1H,brs,H4),552(1H,d,1H,J=156
Hz,H7),606(1H,dd,J=50,157Hz,H8),
432(1H,m,H9),124(3H,d,J=65Hz,Me10),
102(3H,s,Me11),104(3H,s,Me12),191(3H,
brs,Me13)。13CNMR(CD3OD,75MHz)δ:425(C
1),509(C2),2013(C3),1272(C4),1675(C
5),802(C6),1371(C7),1301(C8),687(C
9),246(C10),236(C11),239(C12),196(C
13)。以上波谱数据与文献[4]一致,故鉴定为4,5
dihydroblumenol。
化合物7 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
385[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:250
(1H,d,J=165Hz,H2a),214(1H,d,J=165
Hz,H2b),582(1H,brs,H4),586(1H,d,1H,
J=157Hz,H7),584(1H,dd,J=63,157Hz,
H8),443(1H,q,J=63Hz,H9),128(3H,d,
J=63Hz,Me10),103(3H,s,Me11),103(3H,
s,Me12),192(3H,brs,Me13),434(1H,d,J=
77Hz,GlcH1′)。13CNMR(CD3OD,75MHz)δ:
425(C1),508(C2),2013(C3),1272(C4),
1673(C5),801(C6),1316(C7),1353(C8),
782(C9),213(C10),236(C11),248(C12),
196(C13);Glc:1028(C1′),781(C3′),774
(C5′),753(C2′),717(C4′),629(C6′)。以
上波谱数据与文献[5]一致。化合物7经酸水解后
与D葡萄糖薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定为
(6S,7E,9R)6,9dihydroxymegastigma4,7dien3
one9OβDglucopyranoside。
4 细胞毒作用
取对数生长期的癌细胞,用含10%胎牛血清的
RPM1640培养液稀释成5×104个/mL-1单细胞悬
液,接种于96孔培养板中,每孔180μL,于37℃,
5%CO2条件下培养24h后,加入不同浓度样品液
20μL,样品用DMSO溶解(DMSO浓度≤005%,实
验证实该浓度对细胞生长无影响)后,按照设计配
制不同成终浓度的药物溶液,每个浓度平行6孔,对
照组加入等体积的 RPIM1640培养液。培养 72h
后,小心吸去上清液,每孔加入以无血清培养液新鲜
配制的1g·L-1MTT[3(4,5dimethylthiazol2yl)
2,5diphenyltetrazoliumbromide,3(4,5二甲基噻唑
2)2,5二苯基四氮唑溴盐],37℃温育 4h,弃
MTT,每孔加入150μLDMSO,于酶标仪570nm处
测A值并计算细胞增殖抑制率,结果见表2,3。
细胞抑制率=1-(加药细胞A/对照细胞A)×100%
表2 空心莲子草萃取物对Hela和L929细胞
生长的抑制率(n=6) % 
萃取物
质量浓度
/mg·L-1
抑制率
Hela L929
石油醚萃取物  400 9837 9088
  200 9770 7618
  100 3609 6603
醋酸乙酯萃取物 400 9144 6461
  200 9724 8475
  100 8609 176
正丁醇萃取物  400 100 9779
  200 100 9725
  100 9174 7147
表3 化合物1~7对L929细胞生长的抑制率
(n=6) % 
化合物
抑制率/%
30mg·L-1 10mg·L-1
1 929 62
2 529 302
3 665 89
4 715 13
5 559 190
6 19 -62
7 220 104
  同法测定化合物1在 30mg·L-1和10mg·
L-1剂量时对Hela细胞增殖抑制率分别为913%和
02%。
5 讨论
本论文对空心莲子草的各提取部位的细胞毒筛
选结果表明,各提取物均有较强的抑制癌细胞生长
作用,其对于 Hela细胞作用近似,但对 L929细胞,
正丁醇提取物细胞毒作用相对较强。各单体化合物
筛选结果表明,除化合物6以外,其他化合物均具有
明确的细胞毒作用,其中化合物1对于Hela和L929
细胞生长具有较强生长抑制作用。
[参考文献]
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ConstituentsfromAlternantheraphiloxeroidesandtheirantitumoractivity
FANGJinbo1,2,CHENJiachun2,LIUYanwen3,DUANHongquan4
(1.SchoolofPharmaceuticalScienceandTechnology,TianjinUniversity,Tianjin300072,China;
2.HubeiKeyLaboratoryofNaturalProductsChemistryandResourceEvaluation,TongjiSchoolofPharmacy,HuazhongUniversityof
ScienceandTechnology,Wuhan430030,China;
3.HubeiColegeofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061,China;
4.ResearchCenterofBasicMedicalSciences,ColegeofPharmacy,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigateantitumorconstituentsfromnbutylalcoholextractofAlternantheraphiloxeroides.Meth
od:Theconstituentswereisolatedwithsilicagel,gelpermeationchromatography,andpurifiedbyHPLC.Theirstructureswereeluci
datedbyspectroscopyandacidhydrolysis.TheantitumorefectsofextractsandisolatedcompoundsweretestedbyMTTmethodin
vitro.Result:Sevencompoundswereisolatedandelucidatedasfolowings:oleanolicacid3OβDglucuronopyranoside(1),oleanol
icacid28OβDglucopyranoside(2),oleanolicacid3OβDglucuronopyranoside6′Omethylester(3),chikusetsusaponinIVa
methylester(4),hederagenin3OβDglucuronopyranoside6′Omethylester(5),4,5dihydroblumenol(6),6S,7E,9R6,9di
hydroxymegastigma4,7dien3one9OβDglucopyranoside(7).Compound1showedsignificantinhibitoryefectagainstHelaand
L929withinhibitiveratios913% and929% at30mg·L-1,respectively.Conclusion:Compounds4,5and7wereisolatedfrom
thisgenusforthefirsttime.Compound1(oleanolicacid3OβDglucuronopyranoside)showedsignificantinhibitoryefectagainstHe
laandL929at30mg·L-1.
[Keywords] Alternantheraphiloxeroides;nbutylalcoholextract;antitumoractivity
[责任编辑 王亚君]
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