全 文 :空心莲子草化学成分及抗癌活性研究
方进波1,2,陈家春2,刘焱文3,段宏泉4
(1.天津大学 药学院,天津 300072;
2.华中科技大学 同济药学院 湖北省天然药物化学与资源评价重点实验室,湖北 武汉 430030;
3.湖北中医学院,湖北 武汉 430061;4.天津医科大学 药学院 基础医学研究中心,天津 300070)
[摘要] 目的:研究空心莲子草 Alternantheraphiloxeroides正丁醇提取物的抗肿瘤活性成分。方法:以硅胶柱、凝胶柱色
谱分离,制备HPLC纯化,采用MS,NMR等波谱方法以及酸水解进行结构鉴定,以MTT法测试石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取
物以及各化合物的细胞毒活性。结果:从正丁醇提取部位分离得到7个化合物:齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖醛酸苷(olean
olicacid3OβDglucuropyranoside,1),齐墩果酸28OβD吡喃葡萄糖苷(oleanolicacid28OβDglucopyranoside,2),齐墩果
酸3OβD吡喃葡萄糖醛酸苷6′O甲酯(oleanolicacid3OβDglucuronopyranoside6′Omethylester,3),竹节参苷 IVa甲酯
(chikusetsusaponinIVamethylester,4),常春藤皂苷元3OβD吡喃葡萄糖醛酸苷6′O甲酯(hederagenin3OβDglucuro
nopyranoside6′Omethylester,5),4,5二羟基布卢姆醇(4,5dihydroblumenol,6),(6S,7E,9R)6,9dihydroxymegastigma4,7
dien3one9OβDglucopyranoside(7),化合物1在30mg·L-1剂量时对Hela和 L929抑制率分别为913%和929%。结论:
化合物4,5,7首次从该属植物中分得,化合物1在 30mg·L-1剂量时对Hela和L929具有显著抑制活性。
[关键词] 空心莲子草;正丁醇提取物;抗癌活性
[收稿日期] 20090426
[通信作者] 段宏泉,Tel:(022)23542018,Email:duanhq@tijmu.
edu.cn
空心莲子草 Alternantheraphiloxeroides(Mart.)
Griseb.又名螃蜞菊、空心苋、水花生,为苋科莲子草
属植物空心莲子草的干燥全草,性寒、味苦;具有清
热、凉血、解毒等功效;临床上用于治疗麻疹、流行性
感冒、乙型脑炎、流行性出血热等病毒性疾患。文献
报道其提取物体外具有抗病毒、保肝、免疫调节等作
用。药理试验表明,空心莲子草的醇提物的正丁醇
部位具有较强的抗肿瘤活性,在200mg·L-1给药
剂量时,对Hela和L929细胞抑制率分别为100%,
9725%。为研究其活性成分,作者利用多种柱色谱
方法,从中分得了7个化合物。
1 材料
BrukerAVANCE300instrument;日本分光公司
(JASCO),PU2089(泵),RI2031和 UV2075(检测
器);制备色谱柱:Econosphere(20mm×250mm,7
μm)(Altech),YMCPackSIL06(20mm×250mm,
5μm)(YMC),YMCPackODSA(20mm×250mm,
5μm)(YMC);ToyopearlHW40C(Tosoh);JEOL
JMSSX102A(EI,ESIMS)质谱仪;液质联用色谱仪:
Aliance2695,QuatroMicroTMESI(Waters)。
D葡萄糖、D葡萄糖醛酸(Sigma);薄层色谱和柱
色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂生产,所用试剂均为
分析纯。美国BioRad550酶标仪;美国REVCOCO2
培养箱。胎牛血清为杭州四季青公司产品。Hela和
L929细胞株均由天津医药科学研究所提供。
空心莲子草2004年11月采集于湖北省武汉市
武昌区南湖,经中南民族大学生命科学学院万定荣
教授鉴定为A.philoxeroides,标本(D20040803)存放
于天津医科大学药学院。
2 提取与分离
干燥的空心莲子草(地上部分)90kg,切段,加
95%乙醇回流提取,减压浓缩得稠浸膏,加水混悬,
依次用水饱和的石油醚(60~90℃)、醋酸乙酯和正
丁醇萃取,分别得到石油醚(60~90℃)提取物77
g,醋酸乙酯提取物53g,正丁醇提取物2715g。取
正丁醇提取物(30g)分别经硅胶柱和凝胶柱(Toyo
pearlHW40C)反复分离,制备HPLC纯化得到化合
物1(366mg),2(644mg),3(127mg),4(820
mg),5(111mg),6(100mg),7(351mg)。
3结构鉴定
化合物(1~5,7) 1mg溶于2mL70%乙醇溶
液中,加入1mL1mol·L-1的三氟乙酸,封管回流
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水解6h,减压蒸干溶剂,残留物用70%甲醇溶解,
硅胶G薄层色谱,以D葡萄糖、D葡萄糖醛酸对照,
展开剂三氯甲烷甲醇1%冰醋酸(12∶8∶2),茴香醛
-浓硫酸试剂显色,葡萄糖醛酸(Rf044),葡萄糖
(Rf058)。
化合物1 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
631[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:081,
085,091,094,095,106,116(each3H,s,7×
CH3),524(1H,brs,H12),435(1H,d,J=77
Hz,GlcUAH1′),318(1H,dd,J=46,115Hz,H
3)。13CNMR(CD3OD,75MHz)见表1。以上波谱数
据与文献[1]一致。化合物 1经酸水解后与D葡萄
糖醛酸薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定为oleanolic
acid3OβDglucuropyranoside。
化合物2 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
617[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:080,
085,091,093,095,105,116(each3H,s,7×
CH3),525(1H,brs,H12),538(1H,d,J=79
Hz,GlcH1′),320(1H,overlapped,H3)。13CNMR
(CD3OD,75MHz)见表 1。以上波谱数据与文献
[1]一致。化合物2经酸水解后与D葡萄糖薄层色
谱对照,Rf值一致,故鉴定为 oleanolicacid28Oβ
Dglucopyranoside。
化合物3 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
645[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:081,
085,091,094,094,104,116(各 3H,s,7×
CH3),524(1H,brs,H12),438(1H,d,J=77
Hz,GlcUAH1′),377(3H,s,GlcUA6′OMe)。13C
NMR(CD3OD,75MHz)见表1。以上波谱数据与文
献[2]一致。化合物3经酸水解后与D葡萄糖醛酸
薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定为oleanolicacid3
OβDglucuronopyranoside6′Omethylester。
化合物4 白色针状结晶(MeOH)。(-)ESI
MSm/z807[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:
076,080,091,093,095,104,111(each3H,s,
7×CH3),525(1H,brs,H12),538(1H,d,J=77
Hz,GlcH1″),438(1H,d,J=77Hz,GlcUAH
1′)。13CNMR(CD3OD,75MHz)见表1。以上波谱数
据与文献[3]一致。化合物4经酸水解后与 D葡萄
糖醛酸、D葡萄糖薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定
为 oleanolicacid3O[βDglucuronopyranosyl6′O
methylester]28OβDglucopyranoside,即竹节参苷
表1 化合物1~5的13CNMR(CD3OD,75MHz)数据
No. 1 2 3 4 5
1 399 400 398 399 395
2 290 270 271 271 265
3 910 788 912 912 835
4 403 408 402 403 431
5 571 571 570 571 481
6 194 179 194 194 189
7 340 336 339 340 335
8 407 403 406 408 406
9 500 481 491 499 499
10 380 380 379 380 377
11 247 247 241 241 241
12 1238 1240 1237 1239 1237
13 1453 1449 1453 1449 1453
14 429 430 430 430 431
15 286 286 289 290 289
16 242 241 246 246 246
17 474 473 477 473 477
18 430 427 428 427 428
19 478 472 473 473 473
20 317 316 317 316 317
21 350 350 350 350 350
22 341 341 341 332 337
23 265 290 286 285 647
24 171 171 170 170 135
25 161 162 160 161 165
26 179 194 178 178 179
27 270 264 266 264 266
28 1821 1782 1820 1782 1820
29 337 333 337 336 337
30 241 241 241 241 241
3GlucA
1′ 1069 1071 1071 1061
2′ 756 753 754 753
3′ 780 775 776 776
4′ 738 732 733 733
5′ 768 766 767 776
6′ 1765 1715 1715 1715
6′OMe 529 529 529
28Glc
1″ 958 958
2″ 740 740
3″ 782 784
4″ 712 712
5″ 784 788
6″ 625 625
IVa甲酯(chikusetsusaponinIVamethylester)。
化合物5 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
663[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:071,
081,091,094,098,118(each3H,s,6×CH3),
524(1H,brs,H12),446(1H,d,J=77Hz,Glc
H1″)。13CNMR(CD3OD,75MHz)见表1。以上波
谱数据与文献[2]一致。化合物5经酸水解后与D
葡萄糖醛酸薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定为
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hederagenin3OβDglucuronopyranoside6′Omethyl
ester。
化合物6 白色无定形粉末。EIMSm/z224
[M]+。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:248(1H,d,
J=169Hz,H2a),216(1H,d,J=169Hz,H
2b),588(1H,brs,H4),552(1H,d,1H,J=156
Hz,H7),606(1H,dd,J=50,157Hz,H8),
432(1H,m,H9),124(3H,d,J=65Hz,Me10),
102(3H,s,Me11),104(3H,s,Me12),191(3H,
brs,Me13)。13CNMR(CD3OD,75MHz)δ:425(C
1),509(C2),2013(C3),1272(C4),1675(C
5),802(C6),1371(C7),1301(C8),687(C
9),246(C10),236(C11),239(C12),196(C
13)。以上波谱数据与文献[4]一致,故鉴定为4,5
dihydroblumenol。
化合物7 白色无定形粉末。(-)ESIMSm/z
385[M-H]-。1HNMR(CD3OD,300MHz)δ:250
(1H,d,J=165Hz,H2a),214(1H,d,J=165
Hz,H2b),582(1H,brs,H4),586(1H,d,1H,
J=157Hz,H7),584(1H,dd,J=63,157Hz,
H8),443(1H,q,J=63Hz,H9),128(3H,d,
J=63Hz,Me10),103(3H,s,Me11),103(3H,
s,Me12),192(3H,brs,Me13),434(1H,d,J=
77Hz,GlcH1′)。13CNMR(CD3OD,75MHz)δ:
425(C1),508(C2),2013(C3),1272(C4),
1673(C5),801(C6),1316(C7),1353(C8),
782(C9),213(C10),236(C11),248(C12),
196(C13);Glc:1028(C1′),781(C3′),774
(C5′),753(C2′),717(C4′),629(C6′)。以
上波谱数据与文献[5]一致。化合物7经酸水解后
与D葡萄糖薄层色谱对照,Rf值一致,故鉴定为
(6S,7E,9R)6,9dihydroxymegastigma4,7dien3
one9OβDglucopyranoside。
4 细胞毒作用
取对数生长期的癌细胞,用含10%胎牛血清的
RPM1640培养液稀释成5×104个/mL-1单细胞悬
液,接种于96孔培养板中,每孔180μL,于37℃,
5%CO2条件下培养24h后,加入不同浓度样品液
20μL,样品用DMSO溶解(DMSO浓度≤005%,实
验证实该浓度对细胞生长无影响)后,按照设计配
制不同成终浓度的药物溶液,每个浓度平行6孔,对
照组加入等体积的 RPIM1640培养液。培养 72h
后,小心吸去上清液,每孔加入以无血清培养液新鲜
配制的1g·L-1MTT[3(4,5dimethylthiazol2yl)
2,5diphenyltetrazoliumbromide,3(4,5二甲基噻唑
2)2,5二苯基四氮唑溴盐],37℃温育 4h,弃
MTT,每孔加入150μLDMSO,于酶标仪570nm处
测A值并计算细胞增殖抑制率,结果见表2,3。
细胞抑制率=1-(加药细胞A/对照细胞A)×100%
表2 空心莲子草萃取物对Hela和L929细胞
生长的抑制率(n=6) %
萃取物
质量浓度
/mg·L-1
抑制率
Hela L929
石油醚萃取物 400 9837 9088
200 9770 7618
100 3609 6603
醋酸乙酯萃取物 400 9144 6461
200 9724 8475
100 8609 176
正丁醇萃取物 400 100 9779
200 100 9725
100 9174 7147
表3 化合物1~7对L929细胞生长的抑制率
(n=6) %
化合物
抑制率/%
30mg·L-1 10mg·L-1
1 929 62
2 529 302
3 665 89
4 715 13
5 559 190
6 19 -62
7 220 104
同法测定化合物1在 30mg·L-1和10mg·
L-1剂量时对Hela细胞增殖抑制率分别为913%和
02%。
5 讨论
本论文对空心莲子草的各提取部位的细胞毒筛
选结果表明,各提取物均有较强的抑制癌细胞生长
作用,其对于 Hela细胞作用近似,但对 L929细胞,
正丁醇提取物细胞毒作用相对较强。各单体化合物
筛选结果表明,除化合物6以外,其他化合物均具有
明确的细胞毒作用,其中化合物1对于Hela和L929
细胞生长具有较强生长抑制作用。
[参考文献]
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[J].Phytochemistry,1999,50(5):859.
ConstituentsfromAlternantheraphiloxeroidesandtheirantitumoractivity
FANGJinbo1,2,CHENJiachun2,LIUYanwen3,DUANHongquan4
(1.SchoolofPharmaceuticalScienceandTechnology,TianjinUniversity,Tianjin300072,China;
2.HubeiKeyLaboratoryofNaturalProductsChemistryandResourceEvaluation,TongjiSchoolofPharmacy,HuazhongUniversityof
ScienceandTechnology,Wuhan430030,China;
3.HubeiColegeofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061,China;
4.ResearchCenterofBasicMedicalSciences,ColegeofPharmacy,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigateantitumorconstituentsfromnbutylalcoholextractofAlternantheraphiloxeroides.Meth
od:Theconstituentswereisolatedwithsilicagel,gelpermeationchromatography,andpurifiedbyHPLC.Theirstructureswereeluci
datedbyspectroscopyandacidhydrolysis.TheantitumorefectsofextractsandisolatedcompoundsweretestedbyMTTmethodin
vitro.Result:Sevencompoundswereisolatedandelucidatedasfolowings:oleanolicacid3OβDglucuronopyranoside(1),oleanol
icacid28OβDglucopyranoside(2),oleanolicacid3OβDglucuronopyranoside6′Omethylester(3),chikusetsusaponinIVa
methylester(4),hederagenin3OβDglucuronopyranoside6′Omethylester(5),4,5dihydroblumenol(6),6S,7E,9R6,9di
hydroxymegastigma4,7dien3one9OβDglucopyranoside(7).Compound1showedsignificantinhibitoryefectagainstHelaand
L929withinhibitiveratios913% and929% at30mg·L-1,respectively.Conclusion:Compounds4,5and7wereisolatedfrom
thisgenusforthefirsttime.Compound1(oleanolicacid3OβDglucuronopyranoside)showedsignificantinhibitoryefectagainstHe
laandL929at30mg·L-1.
[Keywords] Alternantheraphiloxeroides;nbutylalcoholextract;antitumoractivity
[责任编辑 王亚君]
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