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海龙及其常见伪品的 ＲＡＰＤ鉴别
吴艳，刘佳，王梦月，鞠培俊，李晓波
（上海交通大学 药学院，上海 ２００２４０）
［摘要］ 目的：提供一种鉴别中药材海龙及其伪品的方法。方法：采用随机引物扩增ＤＮＡ技术，对拟海龙、刁海龙、尖海
龙、粗吻海龙、海鱼、宝珈海龙进行基于Ｎｅｉ＆Ｌｉ＇ｓ相似系数的ＵＰＧＭＡ聚类分析，并构建其鉴别模式。结果：从１８条随机引
物中筛选到ＬＪ０４，ＬＪ０９，ＬＪ１６，ＬＪ１９４条引物能扩增出稳定可靠的条带。基于以上４条随机引物构建的聚类图能较好的从属水
平区分各海龙样品，且与样品外观分析结果一致。基于ＬＪ０９，ＬＪ１９２条引物的扩增结果构建的６种海龙的鉴别模式可以将海
龙正品逐一鉴别出来。结论：随机引物扩增ＤＮＡ技术能较好地鉴别海龙及其伪品。
［关键词］ 海龙；伪品；ＲＡＰＤ
［收稿日期］ ２００８０９２５
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３０６７２６２０）
［通信作者］ 李晓波，教授、博士生导师，Ｔｅｌ：（０２１）３４２０４８０６，
Ｆａｘ：（０２１）３４２０４８０４，Ｅｍａｉｌ：ｘｂｌｉ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
海龙是传统名贵的补益中药，始载于《本草纲
目拾遗》，性温，味甘，具有温肾壮阳、散结消肿之功
效，主治阳痿遗精、肾虚咳喘、瘕积聚、瘰疬痰核、
跌打损伤，现代药理研究发现有抗肿瘤作用［１３］。
２００５年版《中国药典》规定海龙为刁海龙 Ｓｏｌｅｎｏｇ
ｎａｔｈｕｓｈａｒｄｗｉｃｋｉ（Ｇｒａｙ）、尖海龙 Ｓｙｎｇｎａｔｈｕｓａｃｕｓ
Ｌｉｎｎａｅｕｓ、拟海龙Ｓｙｎｇｎａｔｈｏｉｄｅｓｂｉａｃｕｌｅａｔｕｓ（Ｂｌｏｃｈ）的
干燥体［４］。我国有海龙科动物１２属２３种，除上述３
种外，粗吻海龙Ｔｒａｃｈｙｒｈａｍｐｈｕｓｓｅｒａｔｕｓ（Ｔｅｍｍｉｎｃｋｅｔ
ｓｃｈｌｅｇｅｌ）、海鱼Ｈａｌｉｃａｍｐｕｓｋｏｉｌｏｍａｔｏｄｏｎ（Ｂｌｅｅｋｅｒ）、
宝珈海龙 Ｍｉｃｒｏｐｈｉｓｂｏａｊａ（Ｂｌｅｅｋｅｒ）和贡氏柄颌海龙
Ｓ．ｇｕｎｔｈｅｒｉＤｕｎｊｋｅｒ等也作为海龙使用［５］，其中粗吻
海龙也为《湖南省中药材标准》收载［６］。
有关海龙的生药学研究报道较少，吴志高等［７］
对海龙药材粉末进行显微鉴别研究，从横纹肌纤维、
胶原纤维、皮肤碎片、骨骼碎片等方面对海龙类动物
进行鉴别。张朝晖等［８］对海龙类药材的表皮进行
扫描电镜观察，从骨环和皮膜的特征中找到了７种
海龙的鉴别依据。本实验探索了ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍ
ｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）技术鉴定不同种海龙药材，
为海龙药材的正确应用提供分子水平依据。
１ 材料
１．１ 海龙药材 海龙药材样品１４批，均经上海交
通大学李晓波教授鉴定，见表１。标本保存于上海
交通大学药学院中药品质与活性物质组学实验室。
１．２ 试药 １０×Ｂｕｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ），游离脱氧核苷三
磷酸ｄＮＴＰ，氯化镁，ＴａｑＤＮＡ聚合酶，２００ｂｐＤＮＡｌａｄ
ｄｅｒ均购自北京天为时代科技有限公司；牛血清白蛋白
组分五（ＡｌｂｕｍｉｎｂｏｖｉｎｅｆｒａｃｔｉｏｎＶ，ＢＳＡＶ），随机引物
ＬＪ０１～ＬＪ１８均购自上海生工生物工程有限公司；其余
的化学试剂均为分析纯。双蒸无菌水自制。
１．３ 仪器 ＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒｐｅｒｓｏｎａｌＰＣＲ扩增仪、Ｃｅｎ
ｔｒｉｆｕｇｅ５４１５离心机、各型号微量移液器均购自 Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ公司。ＧＩＳ２０１０凝胶成像分析系统、ＥＰＳ１００
水平电泳仪均来自天能公司。
２ 方法
２．１ 总ＤＮＡ制备 样品粉碎，按照酚氯仿抽提法
提取模板ＤＮＡ［９］。
２．２ ＲＡＰＤ扩增 ＰＣＲ反应体系２５μＬ，其中１０×
ＰＣＲＢｕｆｅｒ２５μＬ，ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ·
μＬ－１）０６μＬ，ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｅａｃｈ）０４μＬ，
Ｍｇ２＋（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）２５μＬ，引物（２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
１μＬ，模板 ＤＮＡ１μＬ，ＢＳＡＶ（１ｇ·Ｌ－１）２５μＬ，去
离子水１４５μＬ。
扩增参数：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，
３６℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，热循环４５次；７２
℃延伸７ｍｉｎ后终止于４℃。取６μＬ反应液经２％
琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色，紫外凝胶分析检测，成
像。每个引物进行２次ＲＡＰＤ扩增及检测。
２．３ 数据处理 对每一个样品根据在凝胶上同一
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第３４卷第１４期
２００９年７月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ １４
Ｊｕｌｙ，２００９
表１ 海龙药材ＲＡＰＤ分析试验样品
Ｎｏ． 药材基源 收集地点 收集时间 实验编号
１ 尖海龙 Ｓｙｎｇｎａｔｈｕｓａｃｕｓ 海南海口 ２００３１２ Ｓａｃ１
２ 尖海龙 Ｓ．ａｃｕｓ 海南海口 ２００６１２ Ｓａｃ２
３ 尖海龙 Ｓ．ａｃｕｓ 海南海口 ２００７０４ Ｓａｃ３
４ 拟海龙 Ｓｙｎｇｎａｔｈｏｉｄｅｓｂｉａｃｕｌｅａｔｕｓ 上海 ２００７０５ Ｓｂｉ１
５ 拟海龙 Ｓ．ｂｉａｃｕｌｅａｔｕｓ 安徽马鞍山 ２００６１２ Ｓｂｉ２
６ 拟海龙 Ｓ．ｂｉａｃｕｌｅａｔｕｓ 广东广州 ２００７０４ Ｓｂｉ３
７ 刁海龙 Ｓｏｌｅｇｎａｔｈｕｓｈａｒｄｗｉｃｋｉ 上海 ２００７０３ Ｓｈａ１
８ 刁海龙 Ｓ．ｈａｒｄｗｉｃｋｉ 广西桂林 ２００７０２ Ｓｈａ２
９ 刁海龙 Ｓ．ｈａｒｄｗｉｃｋｉ 北京 ２００７０３ Ｓｈａ３
１０ 粗吻海龙 Ｔｙｒｈａｍｐｈｕｓｓｅｒａｔｕｓ 辽宁大连 ２００７０３ Ｔｓｅ１
１１ 粗吻海龙 Ｔ．ｓｅｒａｔｕｓ 安徽亳州 ２００６１２ Ｔｓｅ２
１２ 粗吻海龙 Ｔ．ｓｅｒａｔｕｓ 陕西西安 ２００７０２ Ｔｓｅ３
１３ 海鱼 Ｈａｌｉｃａｍｐｕｓｋｏｉｌｏｍａｔｏｄｏｎ 海南海口 ２００７０４ Ｈｋｏ１
１４ 宝珈海龙 Ｍｉｃｒｏｐｈｉｓｂｏａｊａ 上海 ２００７０５ Ｍｂｏ１
位置所扩增的 ＤＮＡ条带的有或无分别标记为１或
０（条带存在为１，条带不存在为０），采用 ＰＯＰＧＥＮＥ
分析软件根据统计的二元数据计算样品间的 Ｎｅｉ＆
Ｌｉ＇ｓ相似系数，用 ＵＰＧＭＡ聚类方法分析，得到各样
品的亲缘关系树系图。同时采用凝胶成像分析系统
计算各样品基于４条引物的扩增条带碱基数，从中
寻找可以作为各种海龙的条带鉴别模式。
３ 结果及讨论
３．１ ＲＡＰＤ扩增结果 从１８个１０ｂｐ随机引物中
筛选出扩增性强、重复性好、多态性明显的 ４个引
物，用于全部海龙样品总ＤＮＡ的扩增。所用引物序
列见表２。４个引物共扩增出６８个条带，扩增产物
集中在２００～１０００ｂｐ。引物ＬＪ０９及ＬＪ１９对所有样
品分别进行２次ＲＡＰＤ扩增的结果见图１。
表２ 用于扩增样品的ＲＡＰＤ引物序列
名称 序列（５′３′）
ＬＪ０４ ＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧ
ＬＪ０９ ＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧ
ＬＪ１６ ＴＧＡＧＣＣＴＣＡＣ
ＬＪ１９ ＴＴＣＣＧＡＡＣＣＣ
３．２ 海龙的聚类分析 采用 ＵＰＧＭＡ聚类方法分
析得到各海龙样品亲缘关系树系图，见图２。聚类
图显示，除粗吻海龙外，其余各海龙样品都各自聚为
一类。说明ＲＡＰＤ方法可以较好地区分不同属海龙
药材。粗吻海龙样品中Ｔｓｅ２，Ｔｓｅ３聚为一类，而与
Ｔｓｅ１分开。
３．３ 海龙的ＲＡＰＤ鉴别模式 分析所有海龙样品
Ⅰ，Ⅱ．ＬＪ０９扩增结果；Ⅲ，Ⅳ．ＬＪ１９扩增结果；
Ｃ．空白对照；１～１４．同表１；Ｍ．２００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ。
图１ 海龙样品对引物ＬＪ０９及ＬＪ１９的ＲＡＰＤ扩增
对４个引物的ＲＡＰＤ扩增结果，发现引物ＬＪ０９结合
引物ＬＪ１９的扩增结果可以构建６种海龙药材的鉴
别模式，见图３。引物 ＬＪ０９扩增结果中的３１９，４５２
ｂｐ条带和引物 ＬＪ１９扩增结果中的２４６，５４０，５８７ｂｐ
条带可将６种海龙逐一鉴别出。
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第３４卷第１４期
２００９年７月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ １４
Ｊｕｌｙ，２００９
图２ 海龙样品基于Ｎｅｉ＆Ｌｉ＇ｓ相关系数的
ＵＰＧＭＡ聚类图
（＋）．对应条带呈阳性；（－）．对应条带呈阴性。
图３ 基于引物ＬＪ０９，ＬＪ１９扩增结果构建的海龙药材
鉴别模式
４ 讨论
海龙是重要的海洋动物类药材，含有丰富的氨
基酸、蛋白质，采用酚氯仿抽提法，虽然能扩增出条
带，但杂质抑制作用较严重。本实验在 ＲＡＰＤＰＣＲ
扩增体系中加入 ＢＳＡＶ，能较好地缓解杂质的抑制
作用，同时达到稳定ＴａｑＤＮＡ聚合酶的作用。
本实验中的６种海龙分别属于海龙科的不同
属。ＵＰＧＭＡ聚类图显示，除粗吻海龙外其余不同属
的海龙药材各聚为一类。粗吻海龙 Ｔｓｅ１与 Ｔｓｅ２，
Ｔｓｅ３未聚为一类，可能与收集的样品个体差异性有
关。对比粗吻海龙粉末样品，发现 Ｔｓｅ１的色泽显
著深于Ｔｓｅ２，Ｔｓｅ３，且 Ｔｓｅ１的粉末已出现轻度霉
变，说明 Ｔｓｅ１与Ｔｓｅ２，Ｔｓｅ３确实存在差异。外观
比较与聚类分析结果的一致性说明该方法能较灵敏
地区分各属的海龙。
［参考文献］
［１］ 李士敏，吴筱丹，曾苏，等．海龙体外抗肿瘤活性研究［Ｊ］．中国
中药杂志，２００１，２６（３）：１９３．
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中国海洋药物，１９９８，１７（４）：１０．
［４］ 中国药典．一部［Ｓ］．２００５：２０７．
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［６］ 湖南卫生厅．湖南省中药材标准［Ｓ］．１９９３：２５７．
［７］ 吴志高，胡嵘，陈琦．真伪海龙的显微鉴别［Ｊ］．长春中医学院
学报，１９９４（２）：８３．
［８］ 张朝晖，濮祖茂，徐珞珊，等．海龙类药材扫描电镜观察［Ｊ］．中
药材，１９９７，２０（１２）：６０４．
［９］ 李永明，赵玉琪．实用分子生物学方法手册［Ｍ］．北京：北京大
学出版社，１９９８：１７６．
ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｎＳｙｎｇｎａｔｈｕｓａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓｗｉｔｈｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ
ＷＵＹａｎ，ＬＩＵＪｉａ，ＷＡＮＧＭｅｎｇｙｕｅ，ＪＵＰｅｉｊｕｎ，ＬＩＸｉａｏｂｏ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏＴｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２４０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＳｙｎｇｎａｔｈｕｓａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ（ＲＡＰＤ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｂｙＵＰＧＭＡｍｅｔｈｏｄｂａｓｅｄｏｎＮｅｉ＆Ｌｉ＇ｓｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔａｎｄａｇｅｎｅｔｉｃａｆｉｎｉｔｙ
ｐａｔｅｒｎｆｏｒＳｙｎｇｎａｔｈｕｓａｃｕｓ，Ｓｏｌｅｎｏｇｎａｔｈｕｓｈａｒｄｗｉｃｋｉ，Ｓｙｎｇｎａｔｈｏｉｄｅｓｂｉａｃｕｌｅａｔｕｓ，Ｔｒａｃｈｙｒｈａｍｐｈｕｓｓｅｒａｔｕｓ，Ｈａｌｉｃａｍｐｕｓｋｏｉｌｏｍａｔ
ｏｄｏｎ，Ｍｉｃｒｏｐｈｉｓｂｏａｊａ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｆｏｕｒｐｒｉｍｅｒｓ，ＬＪ０４，ＬＪ０９，ＬＪ１６ａｎｄＬＪ１９，ｆｒｏｍ１８ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ
ｗｈｉｃｈｃａｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅＳｙｎｇｎａｔｈｕｓｉｎｇｅｎｕｓｌｅｖｅｌａｎｄｓｈｏｗｅｄａｇｒｅａｔｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅａｐｐｅａｒａｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃａｆｉｎｉｔｙ
ｐａｔｅｒｎｂａｓｅｄｏｎｐｒｉｍｅｒｓＬＪ０９ａｎｄＬＪ１９ｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＳｙｎｇｎａｔｈｕｓｆｒｏｍｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＲＡＰＤｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｔｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｙＳｙｎｇｎａｔｈｕｓａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｓｙｎｇｎａｔｈｕｓ；ａｄｕｌｔｅｒａｎｔ；ＲＡＰＤ
［责任编辑 吕冬梅］
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