全 文 ：杜仲毛状根培养条件优化及其桃叶珊瑚苷药用
成分的研究
杨蕊，张家辉，孙雪梅，孙敏
（西南大学 生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点试验室，重庆 ４００７１５）
［摘要］ 目的：诱导杜仲毛状根的发生及筛选优良毛状根系。方法：利用发根农杆菌Ｃ５８Ｃ１诱导杜仲不同外植体产生毛
状根，并利用ＨＰＬＣ测定桃叶珊瑚苷含量。结果：采用杜仲无菌苗胚轴经菌液浸染２０ｍｉｎ，共培养３ｄ可得到最佳转化效果。
液体培养的生长量优于固体培养，最有利于毛状根生物量和药用成分的积累，并筛选到桃叶珊瑚苷高产根系 Ｅ１。结论：可通
过毛状根的培养来获得桃叶珊瑚苷药用成分。
［关键词］ 杜仲；毛状根；桃叶珊瑚苷
［收稿日期］ ２００８１２１０
［通信作者］ 孙敏，教授，博士生导师。Ｔｅｌ：（０２３）６８２５４９０１，Ｅ
ｍａｉｌ：ｊｗｃｓｍ＠ｓｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
杜仲ＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓＯｌｉｖ．为杜仲科植物，是
我国特有经济林木和名贵药用植物。已证实杜仲在
心血管系统、免疫系统、消化系统、性激素样作用和
抗菌保肝防癌等方面有较好的药理作用而被广泛用
于医疗事业。但由于人们超量滥挖，绝大部分地区
杜仲濒临灭绝，恢复生产非一时能够见效。因而，寻
找新的药源十分必要。毛状根具有生长迅速和遗传
稳定，且能合成与原植物含量相当或高于原植物含
量的次生代谢产物［１］。因此毛状根培养已成为近
年来发展起来的生产药用植物有效次生代谢物的培
养系统。目前，关于木本植物杜仲的毛状根诱导培
养尚缺乏报道。本研究报道利用发根农杆菌诱导杜
仲外植体产生毛状根的离体培养系统并筛选出高产
毛状根系，为杜仲药物资源的可持续开发利用提供
技术支持。
１ 材料与方法
１．１ 材料
杜仲种子购自湖北郧西县，经西南大学生命科
学学院邓洪平博士鉴定确认；无菌苗由本实验室培
养［２］；发根农杆菌 Ｃ５８Ｃ１［３］由廖志华教授提供，
Ｃ５８Ｃ１是根癌农杆菌经“Ｄｉｓａｒｍｅｄ”改造后，保留
Ｈｅｌｐｅｒ质粒，导入ｐＲｉＡ４质粒而成的发根农杆菌。
１．２ 方法
１．２．１ 农杆菌的保存与活化 适量农杆菌 Ｃ５８Ｃ１
加入到ＹＥＢ＋４０ｍｇ·Ｌ－１利福平（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ，Ｒｉｆ）
与灭菌甘油 ７∶３培养菌液混合均匀后液氮速冻，
－７０℃下保存。取 －７０℃保存的菌株 Ｃ５８Ｃ１２００
μＬ，加入到２５ｍＬＹＥＢ（附加 Ｒｉｆ４０ｍｇ·Ｌ－１）液体
培养基中，２００ｒ·ｍｉｎ－１，２７℃快速振荡培养２４ｈ，
复苏菌体，备用。
１．２．２ 发根农杆菌 Ｃ５８Ｃ１转化杜仲 将杜仲无菌
苗幼嫩真叶、子叶及胚轴切成小块预培养３ｄ后用
Ｃ５８Ｃ１浸染 ５～２５ｍｉｎ，转接于 ＭＳ＋乙酰丁香酮
（ＡＳ）共培养基上２～５ｄ后转入头孢噻肟钠（Ｃｅｆ）
除菌培养基，２～３周后观察到毛状根的形成。
１．２．３ 杜仲毛状根的培养 毛状根长约５ｃｍ时剪
下，接种于１／２ＭＳ＋Ｃｅｆ５００ｍｇ·Ｌ－１培养基，１５～２０
ｄ继代培养１次，重复５～６次。挑选生长迅速、分
支多的毛状根在１／２ＭＳ＋Ｃｅｆ２５０ｍｇ·Ｌ－１的培养基
上继代培养５次。取除菌彻底的毛状根分别转入
１／２ＭＳ，１／２ＭＳ＋ＩＢＡ０２ｍｇ·Ｌ－１固体培养基和
１／２ＭＳ液体培养基的摇瓶中，（２５±１０）℃的恒温
培养箱和摇床（１１０ｒ·ｍｉｎ－１）暗培养，每１５～２０ｄ
继代培养１次，充分扩大毛状根系。
１．２．４ 转化毛状根ｒｏｌＢ，ｒｏｌＣ的ＰＣＲ检测 取２００
ｍｇ除菌彻底的毛状根应用 ＳＤＳ法［４］提取总 ＤＮＡ，
ＰＣＲ引物：ｒｏｌＢ（４２３ｂｐ）的引物为 ｆｒｏｌＢ（５′ＧＣＴＣＴ
ＴＧＣＡＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＴ３′）， ｒｏｌＢ （５′ＧＡＡＧＧＴＧ
ＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＣＴＣ３′）；ｒｏｌＣ（６２６ｂｐ）的引物为ｆｒｏｌＣ
（５′ＴＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣ３′），ｒｏｌＣ（５′
ＡＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＣ３′）。反应体系均为
（２５μＬ）：ｄｄＨ２Ｏ１８μＬ，１０×ＰＣＲｂｕｆｅｒ２５μＬ，２５
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ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２２０μＬ，１０ｍｍｏｌ·Ｌ
－１ｄＮＴＰｍｉｘ
０２５μＬ，１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｐｒｉｍｅｒ１０２５μＬ，１０ｍｍｏｌ·
Ｌ－１ｐｒｉｍｅｒ２０２５μＬ，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０２５μＬ
（１２５Ｕ），模板ＤＮＡ１５μＬ。反应条件：９４℃预变
性５ｍｉｎ，９４℃变性４０ｓ，５５℃退火４０ｓ，７２℃反应
１ｍｉｎ，３５个循环后７２℃延伸８ｍｉｎ。
１．２．５ 杜仲毛状根药用成分桃叶珊瑚苷的提取
通过分子检测且长势良好的杜仲毛状根称取鲜重后
于５０℃下烘干，称重后研磨成粉，称取１５０ｍｇ毛状
根干粉用 １０ｍＬ７２％的乙醇水溶液超声破碎（６０
ｋＨｚ）３０ｍｉｎ，过滤，重复１次，合并滤液。滤液于旋
转蒸干仪上浓缩蒸干（５０℃），用甲醇（色谱级）定
容至１０ｍＬ，－２０℃保存，作为供试样品溶液。对照
为以同样方法提取的自然杜仲根及皮供试样品溶
液。样液于测定前用０４５μｍ微孔滤膜过滤备用。
１．２．６ ＨＰＬＣ测定桃叶珊瑚苷含量 Ｗａｔｅｒｓ高效液
相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ１５２５型泵，Ｗａｔｅｒｓ２４８７型检测池）。
ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８ＰＡＱ色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５
μｍ）；流动相乙腈水相（１５∶８５），其中水相为水四氢
呋喃（ＴＨＦ）Ｈ３ＰＯ４（８５∶１２∶０３），流速为１０ｍＬ·
ｍｉｎ－１，检测波长２１０ｎｍ。标准曲线绘制：桃叶珊瑚苷
对照品（Ｓｉｇｍａ公司），以１０００，５００，２５０，１００，５０，２５，
１０，５ｍｇ·Ｌ－１标准液作ＨＰＬＣ分析，用峰面积对浓度
进行线性分析获得标准曲线。
２ 结果与分析
２．１ 不同类型外植体对诱导频率的影响
本实验用农杆菌Ｃ５８Ｃ１感染杜仲不同外植体。培
养１５ｄ后，有的外植体从切口处的少量淡黄色的愈伤
组织上生长出毛状根；也有少数外植体（叶片）直接从
切口处产生毛状根，毛状根被白色短根毛（图１）。
图１ 分别从胚轴（Ａ）真叶（Ｂ）和子叶（Ｃ）诱导生长出的毛状根
利用发根农杆菌诱导木本植物产生毛状根的成
功率很低，并且对其毛状根进行继代培养也因毛状
根易褐化而显得艰难，本实验中杜仲幼苗３种不同
的外植体（子叶、真叶、胚轴）对农杆菌 Ｃ５８Ｃ１的反
应能力不一样，差异非常明显（表１），其中以胚轴的
诱导频率最高，可达到７６６７％，并且从胚轴上诱导
出的毛状根数量较多，生长速度较快，继代培养可以
形成较多分枝，为最佳外植体；真叶及子叶诱导出的
毛状根较少且较短，生长速度缓慢，尤其是真叶上生
长出的毛状根容易褐化死亡，继代培养中也容易发
生褐化，最终死亡。
表１ 农杆菌Ｃ５８Ｃ１对不同外植体感染结果
外植体类型
出根外植体
／个
诱导率
／％
出根时间
／ｄ
胚轴 ２３ ７６６７ １３
真叶 ４ １３３３ ２０
子叶 １４ ４６６７ １８
注：外植体个数均为３０（表２同）。
２．２ 菌液浸染时间对诱导率的影响
浸染５～１０ｍｉｎ的胚轴，由于时间太短，农杆菌
不能有效的感染外植体；浸染２０ｍｉｎ，胚轴的诱导率
最高为８０％，为最佳浸染时间。浸染２５ｍｉｎ后，外
植体伤口处因附着过多乳白色农杆菌菌液而导致外
植体被毒害而褐化、软腐、死亡（表２）。
表２ 菌液浸染时间对诱导频率的影响
浸染时间
／ｍｉｎ
出根外植体
／个
诱导率
／％
０（对照） ０ ０
５ ０ ０
１０ ４ １３３３
１５ １３ ４３３３
２０ ２４ ８０００
２５ １６ ５３３３
２．３ 共培养时间对诱导频率的影响
在共培养０～５ｄ，随着共培养时间的延长，转化
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后出根的诱导率逐渐上升，共培养３ｄ诱导率最高，
为７３％；当共培养时间增长至５ｄ时，诱导率明显下
降，因此选用的共培养时间为３ｄ。
２．４ 毛状根的离体培养
培养于１／２ＭＳ固体培养基中的毛状根较为健
壮，生长略为缓慢；培养于 １／２ＭＳ＋ＩＢＡ０２ｍｇ·
Ｌ－１固体培养基中的毛状根略微愈伤化，但分支明显
增多，生长较为旺盛；培养于１／２ＭＳ液体培养基中
的毛状根生长最旺盛，分支较多（图２）。
２．５ 毛状根的ＰＣＲ检测（图３）
Ａ．１／２ＭＳ固体培养基；Ｂ．１／２ＭＳ＋ＩＢＡ固体培养基；Ｃ．１／２ＭＳ液体培养基。
图２ 毛状根的离体培养
Ｍ．核酸相对分子质量标准ＤＬ２０００，＋．阳性对照Ｃ５８Ｃ１
菌株质粒；－．阴性对照杜仲无菌苗；
Ｄ１～Ｄ５．不同的毛状根单克隆。
图３ 杜仲毛状根中ｒｏｌＢ，ｒｏｌＣ基因的ＰＣＲ检测
２．６ 毛状根次生代谢产物桃叶珊瑚苷的含量测定
２．６．１ 桃叶珊瑚苷标准曲线 在实验色谱条件下，
以桃叶珊瑚苷对照品各质量浓度所得的峰面积为纵
坐标（Ｙ），桃叶珊瑚苷的质量浓度（ｍｇ·Ｌ－１）为横
坐标（Ｘ）进行线性回归，回归方程为 Ｙ＝１９３７８Ｘ＋
３２７２６（ｒ＝０９９９３），线性范围 １０～１０００ｍｇ·
Ｌ－１。
２．６．２ 精密度试验 取５００ｍｇ·Ｌ－１的对照品溶
液，按实验色谱条件连续进样６次，计算桃叶珊瑚苷
色谱峰的峰面积ＲＳＤ为０３２％。
２．６．３ 稳定性试验 取供试样品，在３６ｈ内每隔３
ｈ按实验色谱条件测定样品中的桃叶珊瑚苷，结果
表明桃叶珊瑚苷的 ＲＳＤ为１６７％，因此在３６ｈ内
样品稳定。
２．６．４ 重复性试验 取Ｅ１号毛状根样品，按１．２．５
方法制备６份，在实验色谱条件下测定桃叶珊瑚苷，
ＲＳＤ２４３％，表明实验方法重复性良好。
２．６．５ 不同毛状根系和自然根、皮的生物量及桃叶
珊瑚苷含量 １２个毛状根系中 Ｅ１的桃叶珊瑚苷质
量分数最高，高达３０１０５ｍｇ·ｇ－１，且高于自然根及
皮。在３种培养方式中，液体培养的毛状根系生物
量增长最快，桃叶珊瑚苷含量最高，１／２ＭＳ＋ＩＢＡ固
体培养的毛状根系较１／２ＭＳ固体培养的毛状根系
而言生物量大，但是其桃叶珊瑚苷含量远不如
１／２ＭＳ固体培养的毛状根系。各毛状根系经多次继
代培养后，以相同方法检测其中桃叶珊瑚苷药用成
分含量并将其与自然杜仲根、皮对比，结论与前一致
（图４，表３）。
Ａ．桃叶珊瑚苷对照品；Ｂ．杜仲毛状根样品；Ｃ．杜仲自然皮样品；
ａ桃叶珊瑚苷。
图４ 桃叶珊瑚苷对照品及杜仲样品ＨＰＬＣ图
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表３ 供试的不同单克隆毛状根系及自然根、
皮桃叶珊瑚苷含量检测（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
毛状根
单克隆
鲜重
／ｇ
干重
／ｇ
桃叶珊瑚苷
／ｍｇ·ｇ－１
Ｅ１ １３９１２±００７５９ ０３６５９±００８０９ ３０１０５±００１０５
Ｅ２ １４６０４±０２１３２ ０４３５１±０１９８２ １４０９３±０００４３
Ｅ３ １１８４９±０１６４３ ０１５９６±０１５５８ １１０６４±００１１２
Ｅ４ １３９７６±０１１２８ ０３７２３±０１４６３ １１７１３±０００１６
Ｅ５ １２５１４±００９８６ ０２２６１±０１１０２ １１６９９±０００６４
Ｅ６ １４４７９±０２０３３ ０４２２６±０１９４６ １７４３５±０００３４
Ｅ７ １１５０１±０１０４６ ０１２４８±０１０５７ １５５６６±０００５３
Ｅ８ １３２８３±０１３２５ ０３０３０±０１３１１ １４９２５±００００９
Ｅ９ １１９４０±０１６９７ ０１６８７±０１４５９ ７３８６±０００２９
Ｅ１０ １３１９３±０１６３１ ０２９４０±０１３２４ ５２６３±０００３３
Ｅ１１ １４０９６±００８９９ ０３８４３±００９８８ ６４６５±００１１８
Ｅ１２ １３５２８±０１０１０ ０３２７５±０１０８９ ２５６０±０００２８
ＤＲ １１７７９±０１４３６ ０１５２６±０１２９１ ２１９７８±０００９６
ＤＣ １１７３９±０１８４８ ０１４８６±０１０９９ ２６２３１±０００７８
注：Ｅ１３．１／２ＭＳ液体培养基；Ｅ４８．１／２ＭＳ固体培养基；Ｅ９１２．
１／２ＭＳ＋ＩＢＡ固体培养基；ＤＲ．杜仲自然根；ＤＣ．杜仲皮层。
３ 讨论
发根农杆菌种类、被感染部位细胞类型以及生
理状况等方面的不同，使ＴＤＮＡ插入植物基因组的
位置、长度和拷贝数千差万别［５］，且农杆菌附着、Ｔ
ＤＮＡ的转移及整合只在共培养时期内完成［６］。本
实验表明杜仲毛状根的诱导在外植体选择、浸染时
间和共培养天数上与其他草本、藤本植物有较大不
同，以无菌苗的胚轴为最佳外植体，且菌液浸染时间
和共培养时间明显用时长。毛状根离体培养中发
现，液体培养优于固体培养，添加生长素 ＩＢＡ能促
进毛状根的生长，但毛状根容易愈伤化。通过测定
毛状根系桃叶珊瑚苷的含量表明，不同单克隆毛状
根系生长速度及合成次生代谢产物能力明显不同，
液体培养最有利于毛状根生物量和药用成分桃叶珊
瑚苷的积累，添加生长素虽能促进毛状根的生长，但
不利于桃叶珊瑚苷的积累，这可能是生长激素的加
入干扰了桃叶珊瑚苷的合成，具体原因有待继续进
一步研究。对实验筛选出的桃叶珊瑚苷高产根系
Ｅ１进行大规模繁殖培养能获得理想的药用物质，有
望替代传统药源。同时，从单位时间生物量增长和
药用成分积累方面看，其他毛状根系的药用价值是
不可低估的，至于如何进一步提高杜仲毛状根中的
药用成分含量，尚待进一步研究。
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Ｈａｉｒｙｒｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｕｃｕｂｉｎｍｅｄｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ
ＹＡＮＧＲｕｉ１，ＺＨＡＮＧＪｉａｈｕｉ１，ＳＵＮＸｕｅｍｅｉ１，ＳＵＮＭｉｎ１，２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１５，Ｃｈｉｎａ；
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ；ｈａｉｒｙｒｏｏｔ；ａｕｃｕｂｉｎ ［责任编辑 吕冬梅］
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