免费文献传递   相关文献

Determination of ellagic acid compounds in Euscaphis japonicaby using UPLC

UPLC测定鸡眼睛药材中鞣花酸类化合物的含量



全 文 :UPLC测定鸡眼睛药材中鞣花酸类化合物的含量
王爱民1,刘智2,王海军1,李勇军1,廖尚高1,王永林1
(1贵阳医学院 药学院,贵州 贵阳 550004,
2贵州益康制药有限公司,贵州 贵阳 550008)
[摘要] 目的:建立超高效液相色谱(UPLC)法测定鸡眼睛(野鸦椿)中鞣花酸类化合物含量的方法。方法:采用Acquity
BEHC18(21mm×150mm,17μm)色谱柱;以乙腈01%磷酸为流动相,梯度洗脱;流速02mL·min
-1;检测波长245nm。
结果:鸡眼睛药材中五种鞣花酸类化合物在20min内得到完全分离并进行了含量测定。方法快速、专属,线性关系、精密度和
准确度良好。结论:通过研究制定了鸡眼睛(野鸦椿)药材中鞣花酸类化合物的质量控制方法。
[关键词] 鸡眼睛(野鸦椿);鞣花酸类;超高液相色谱(UPLC)
[收稿日期] 20090807
[基金项目] 贵州省中药现代化科技产业研究开发专项基金项目
(黔科合中药专字[2007]5014号)
[通信作者] 王永林,Tel:(0851)6908899,Email:gywam100@
gmailcom
  鸡眼睛为省沽油科植物野鸦椿Euscaphisjapon
ica(Thunb)Dippel的带花或果的枝叶,在我国大部
分省份和地区均有分布[1],为贵州省少数民族用
药,收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》
2003年版,具有理气止痛,消肿散结,祛风止痒之功
效,临床用于头痛,眩晕,胃痛等症[2]。文献报道鸡
眼睛(野鸦椿)含有苯丙素类、黄酮类、酚酸类、生物
碱类、三萜类和芳香化合物等[39] ,经作者对其化
学成分研究,从中分离出齐墩果酸,3,3′二甲氧基
鞣花酸4′Oβ葡萄糖苷,香草醛,没食子酸,原儿
茶酸,junipetriolosideA,香草酸,Sinapicaldehyde,3,
3′二甲氧基鞣花酸4′Oα阿拉伯糖苷,3,3′二甲
氧基鞣花酸4′Oβ木糖苷、3,3′二甲氧基鞣花酸、
corchoionosideC,5羟甲基糠醛、鞣花酸等化合物。
《贵州省中药、民族药材质量标准》2003年版中
对鸡眼睛(野鸦椿)药材的质量控制只有性状和理
化鉴别,目前对该药材的质量研究国内仅见性状和
显微鉴别的研究[10],未见含量测定方面研究的报
道。为此,作者选择了其中具一定有活血化瘀和抗
氧化等活性作用的鞣花酸类化合物[1113]作为质量
控制指标进行含量测定研究,结果表明,所建立的方
法快速、专属和准确,可为该药材的开发应用提供试
验基础。
1 仪器与试药
ACQUITYUPLC(美国 Waters公司,包括二元
高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极
管阵列检测器、Empower2色谱工作站);AE240电
子天平(1/10万,瑞士梅特勒托利上海公司);实验
室超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。
鞣花酸、3,3′二甲氧基鞣花酸4′Oβ葡萄糖
苷,3,3′二甲氧基鞣花酸4′OαD阿拉伯糖苷,3,
3′二甲氧基鞣花酸4′Oβ木糖苷和 3,3′二甲氧
基鞣花酸5种对照品为作者从鸡眼睛(野鸦椿)药
材中提取分离制备,采用1HNMR,13CNMR,MS,UV,
IR波谱进行了结构鉴定,上述 5种对照品分别用
UPLCPDA在多个检测波长下测定,其峰面积归一
化结果均大于98%;乙腈为色谱纯(Merck公司)、
甲醇、磷酸等试剂均为国产分析纯。实验用药材9
批由贵州益康制药有限公司提供,均采收至贵阳市
乌当区,由贵阳医学院龙庆德副教授鉴定为省沽油
科植物野鸦椿Ejaponica的干燥枝叶。
2 方法与结果
21 色谱条件 ACQUITYUPLCBEHC18色谱
(21mm×100mm,17μm);流动相乙腈(A)
01%磷酸(B)梯度洗脱,0~1min,A6%,1~19
min,A从 6% ~35%,19~20min,A从 35% ~
100%;梯度曲线均为直线;流速02mL·min-1;柱
温40℃;检测波长245nm,进样量10μL。
22 适用性试验 分别吸取对照品混合溶液和药
材供试品溶液10μL,在上述色谱条件下,用 UP
LCPDA测定,结果供试品溶液色谱中5种被测成
·22·
第34卷第24期
2009年12月
                           
Vol.34,Issue 24
 December,2009
分的保留时间与上述5种对照品保留时间一致,与
其他物质峰分离度大于 15,理论塔板数均在
160000以上,各被测定成分色谱峰的紫外光谱与各
自对照品的紫外光谱一致,色谱分析结果见图1。
A对照品;B样品;1鞣花酸;23,3′二甲氧基鞣花酸4′Oβ葡萄糖苷;33,3′二甲氧基鞣花酸4′Oα阿拉伯糖苷;43,3′二甲
氧基鞣花酸4′Oβ木糖苷;53,3′二甲氧基鞣花酸(表1,2同)。
图1 对照品和供试品溶液的UPLC图
23 溶液制备 对照品溶液制备:分别称取鞣花
酸,3,3′二甲氧基鞣花酸4′Oβ葡萄糖苷,3,3′二
甲氧基鞣花酸4′OαD阿拉伯糖苷,3,3′二甲氧
基鞣花酸4′Oβ木糖苷和 3,3′二甲氧基鞣花酸
对照品2023,884,478,1330和658mg,分别置
5个25mL量瓶中,加甲醇适量,超声使溶解,加甲
醇至刻度,摇匀,得对照品储备液。分别精密量取上
述对照品储备液各1mL,置10mL量瓶中,加甲醇
稀释至刻度,摇匀,即得。
供试品的制备 取药材粉末约1g(过40目),
精密称定,置索氏提取器中,加甲醇适量,加热回流
6h,用少量甲醇洗涤容器,洗液并入提取液,水浴浓
缩至约5mL,转移至10mL量瓶中,用甲醇稀释至
刻度,摇匀,即得。
24 线性关系考察 分别精密量取上述5种对照
品储备液各02,06,1,14,18mL,分别置10mL
量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得系列浓度的对
照品溶液,按21项的色谱条件进样测定。以进样
质量浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,绘制
标准曲线,线性回归方程见表1。
表1 线性回归方程和线性范围
化合物 线性回归方程
相关系数
/r
线性范围
/mg·L-1
1 Y=1249×107X-6159×104 09998 162~146
2 Y=6754×106X-1102×104 09997 707~636
3 Y=1248×107X-1345×104 09998 382~344
4 Y=9068×106X-1872×104 09998 106~958
5 Y=6953×106X-9048×103 09998 526~474
25精密度试验 取鸡眼睛药材样品9份,分别按
05,1,15g3种取量,每种称量各3份,精密称定,
照供试品溶液的制备方法制备份供试液,分别测定,
RSD值分别为24%,28%,29%,27%,20%。
26 耐用性考察 取同一供试品溶液,分别于
0,1,2,4,8h进样测定,结果 5种被测成分平均
峰面 积 的 RSD分 别 为 14%,16%,21%,
17%,12%(n=5),表明供试品溶液稳定性在
8h内稳定。另取样品粉末按供试品溶液的制备
方法制备3份供试液,分别采用3支不同批次的
ACQUITYUPLCBEHC18(21mm×100mm,17
μm)色 谱 柱 (系 列 号:01573807015501,
01573828035301和01573807015558)在上述色
谱条件下进行测定,其结果基本一致;同时还对
不同柱温(35,40,45℃)进行考察,其结果也基
本一致,表明方法的耐用性较好。
27 回收率试验 精密称取已测定含量的鸡眼
睛药材6份(过40目筛)各05g,分别精密加入
上述5种混合对照品溶液适量,室温挥干,按23
项制备供试品溶液,按 21项色谱条件测定,各
成分的回收率在 9716% ~1021%,RSD小于
32%,见表2。
28 样品测定 取不同批次的鸡眼睛药材1g,精
密称定,照23项制备供试品溶液,按21项色谱条
件测定,计算含量,结果见表3。
3 讨论
在供试品溶液制备中分别考察了不同浓度乙
醇、甲醇等溶剂进行回流、超声、索式提取等方法,结
果以甲醇索式提取效果较好。
经UPLCPDA测定,其中 3,3′二甲氧基鞣花
酸、3,3′二甲氧基鞣花酸4′Oβ木糖苷、3,3′二甲
氧基鞣花酸4′Oα阿拉伯糖苷、3,3′二甲氧基鞣
·32·
第34卷第24期
2009年12月
                           
Vol.34,Issue 24
 December,2009
   表2 5个鞣花酸类化合物加样回收率
化合物
样品量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
RSD
/%
1 0.2261 0.226 0.4569 102.1 98.52 2.7
0.2239 0.4411 96.11
0.2288 0.4501 97.92
0.2321 0.4477 95.40
0.2314 0.4539 98.45
0.2278 0.4563 101.1
2 0.1068 0.118 0.2259 100.93 102.1 3.1
0.1057 0.2283 103.9
0.1080 0.2308 104.1
0.1096 0.2291 101.3
0.1093 0.2336 105.3
0.1076 0.2223 97.20
3 0.1110 0.121 0.2294 97.85 98.71 3.0
0.1099 0.2303 99.50
0.1123 0.2291 96.53
0.1140 0.2357 100.58
0.1136 0.2379 102.7
0.1119 0.2272 95.29
4 0.1325 0.142 0.2726 98.7 97.16 2.9
0.1312 0.2667 95.42
0.1341 0.2736 98.24
0.1360 0.2729 96.41
0.1356 0.2822 103.2
0.1355 0.2706 95.14
5 0.1229 0.135 0.2596 101.3 98.52 3.2
0.1217 0.2504 95.33
0.1243 0.2607 101.0
0.1261 0.2584 98.00
0.1258 0.2556 96.15
0.1238 0.2631 103.2
表3 不同批次鸡眼睛药材中5个鞣花酸类
化合物质量分数(n=2) mg·g-1
批号 1 2 3 4 5 总量
20080306 0.45580.21520.22380.26710.2477 1.410
20080523 0.45530.24720.28490.29220.2937 1.573
20080626 0.51180.24020.25850.29950.2688 1.579
20080825 0.32690.18460.20100.24940.2240 1.186
20081114 0.43260.19840.19160.18430.1752 1.182
20090210 0.78980.52390.32360.48080.3276 2.446
20090311 0.67090.36760.25490.32920.4231 2.046
20090319 0.24830.14060.15520.91840.3726 1.835
20090320 0.36270.60510.33440.79880.4398 1.936
花酸4′Oβ葡萄糖苷在245nm均具有最大吸收,
鞣花酸在254nm有最大吸收,但在245nm也有较
大吸收,综合考虑选择245nm为含量测定波长。
本试验将超高液相色谱用于鸡眼睛中多指标成
分含量测定研究,与普通 HPLC采用5μmC18填料
的色谱柱(46mm×250mm)比较,其分析速度提
高了近4倍,具有较高的分析通量,同时也具有良好
的准确度、精密度和耐用性,可见超高效液相色谱作
为一种新的色谱技术应用于中药材及其制剂质量控
制有着非常广阔的前景。
[参考文献]
[1] 葛玉珍 野鸦椿资源及其利用[J]中国野生植物资源,
2004,23(5):24
[2] 贵州省中药、民族药材质量标准[S].2003:210
[3] 董玫,广田满野鸦椿的植物化学成分研究[J]天然产物研
究与开发,2002,14(4):34
[4] GilesC,JosephVPhenylpropanoidsfromleavesofJuniperus
phoenicea[J]Phytochemistry,1997,45(8):1679
[5] TenjiK,Teppei,ShiuK,etalConstituentsofthecapsulesof
Euscaphisjaponica(THUNB)KANTIZ[J]Pharmaceuticalso
cietyJapan,1996,44(4):863
[6] YoshioT,Yoshiohiro,ToshiyaM,etalNewMegastigmane
andTetraketidefromtheleavesofEuscaphisjaponica[J]Chem
PharmBul,2000,48(5):752754
[7] KōtaroT,SatoshiK,KenichiN,etalStudiesonconstituents
ofmedicinalplantsⅩⅢConstituentsofthepericarpsofthe
capsulesofEuscaphisjaponicaPax(1)[J]ChemPharmBul,
1974,22(3):650
[8] 中国药品生物制品检定所中国民族药志第2卷[M]北
京:人民卫生出版社,1990:493
[9] 江苏新医学学院中药大辞典下册 [M]上海:上海科学
技术出版社,1996:2154
[10] 刘文启野鸦椿鉴别研究[J]中国中药杂志,2007,32(3):
261
[11] DamasJ,RemacleGThethrombopenicefectofelagicacidin
theratAnothermodelofplateletstimulation“invivo”[J]Per
gamonJLetd,1987,45:153
[12] 郑英俊,梁武鞣花酸抗肿瘤作用的分子机制[J]国际肿瘤
学杂志,2007,34(1):11
[13]李素琴,袁其朋,徐健梅鞣花酸的生理功能及工艺开发研究
现状[J]天然产物研究与开发,2001,13(5):71
·42·
第34卷第24期
2009年12月
                           
Vol.34,Issue 24
 December,2009
DeterminationofelagicacidcompoundsinEuscaphisjaponica
byusingUPLC
WANGAimin1,LIUZhi2,WANGHaijun1,LIYongjun1,LIAOShanggao1,WANGYonglin1
(1SchoolofPharmacy,GuiyangMedicalColedge,Guiyang550004,China;
2GuizhouEAKANPharmaceuticalCo,Ltd,Guiyang550008,China)
[Abstract] Objective:Todevelopanultraperformanceliquidchromatography(UPLC)methodforsimultaneousdetermination
offiveelagicacidsinEuscaphisjaponicaMethod:AnalysiswascariedoutonanAcquityBEHC18(21mm×150mm,17μm)
columnat40℃ elutedwithacetonitrile01% phosphoricacidaqueoussolutionasmobilephasesingradientelutionTheflowratewas
02mL·min-1,andthedetectionwavelengthsetwasmonitoredat245nmResult:Alcalibrationcurvesshowedgoodlinearrela
tionshipwithintestranges(r>09997),andtheoveralrecoverieswereintherangeof972%1021%,withRSDlessthan32%
(n=6).TheoveralRSDofprecisiontestwerelessthan29%Conclusion:Thedevelopedmethodwassimple,rapid,accurateand
reproducible,andcanbeusedforthequalitycontrolofEjaponica
[Keywords] Euscaphisjaponica;elagicacidcompounds;UPLC
[责任编辑 王亚君]
·52·
第34卷第24期
2009年12月
                           
Vol.34,Issue 24
 December,2009