全 文 ：木犀草素对缺血再灌损伤神经元的
保护作用及机制研究
方露玫１，张明明１，丁悦敏２，方玉婷１，姚春蕾１，张雄１
（１浙江大学 医学院 生理系，浙江 杭州 ３１００５８；
２浙江大学 城市学院 生物技术系，浙江 杭州 ３１００１５）
［摘要］ 目的：探讨黄酮类化合物木犀草素对缺血／再灌损伤神经元的作用以及可能的作用机制。方法：原代培养的海
马神经元经２ｈ的氧糖剥夺和２４ｈ的再灌处理，分别检测细胞活性，乳酸脱氢酶漏出率和细胞凋亡率，采用 Ｐｕｌｓｉｎｅｌｉ四动脉
阻断法对ＳＤ大鼠施行１０ｍｉｎ全脑缺血和２４ｈ再灌，检测钠泵活性。结果：经氧糖剥夺／再灌后，海马神经元的活性比未经氧
糖剥夺／再灌组显著地降低，乳酸脱氢酶漏出率和细胞凋亡率均显著地增高。在氧糖剥夺期间给予的木犀草素，在１０～１００
μｍｏｌ·Ｌ－１能呈剂量依赖地逆转这些改变。进一步实验发现木犀草素能够显著地增强大鼠全脑缺血／再灌后的钠泵活性。在
神经元氧糖剥夺／再灌模型上，利用钠泵抑制剂哇巴因能阻断木犀草素的神经元保护作用。结论：木犀草素能减轻缺血／再灌
所致的神经元损伤，其保护机制可能与增强了神经元细胞膜上的钠泵活性有关。
［关键词］ 木犀草素；缺血；神经元；钠泵
［收稿日期］ ２００９０８０５
［基金项目］ 浙江省自然科学基金项目（Ｙ２０６１７９）；浙江大学医学
院第１１期ＳＲＴＰ
［通信作者］ 张雄，副教授，Ｔｅｌ：（０５７１）８８２０８４８２，Ｆａｘ：（０５７１）
８８２０８２５３，Ｅｍａｉｌ：ｘｉｏｎｇｚｈａｎｇ＠ｚｊｕｅｄｕｃｎ
［作者简介］ 方露玫，硕士研究生，主要研究方向是缺血性脑损伤
的机制和治疗
木犀草素（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）又名 ３′，４′，５，７四羟基黄
酮，是存在于多种植物中的天然黄酮类化合物，它与
槲皮素、山柰素等都具有共同的 ２苯基色原酮结
构，区别主要在于反映抗氧化活性的 Ｂ环和 Ｃ环酚
羟基数目不同。对木犀草素的结构分析以及生物学
研究都已经证实它有显著的抗氧化作用，可以减轻
氧化剂及自由基对细胞造成的损伤［１２］，但是它能否
保护缺血／再灌损伤的神经元尚无直接证据。另外，
目前的研究把木犀草素的生物学效应主要归因于它
的抗氧化特性，然而在缺血性器官损伤的病人中应
用强抗氧化剂并无显著疗效［３］，这提示仅从抗氧化
特性上并不能完全解释木犀草素的某些效应，所以
本研究从非抗氧化途径探讨了它可能的机制。
１ 材料与方法
１１ 海马神经元的原代培养 出生２４ｈ内的 ＳＤ
大鼠，由浙江大学实验动物中心提供。动物经乙醇
消毒后断头取脑，并分离出海马组织，在０２５％的
胰酶中３７℃消化１５～１６ｍｉｎ。终止消化后，依次进
行３次机械吹打以分离细胞，分别收集细胞悬液离
心沉淀，再把细胞重悬于含 ２０％的 Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ公
司，美国），双抗和 Ｌ谷氨酰胺的 Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培养基
中（Ｇｉｂｃｏ公司，美国），并于培养初期添加 Ｌ谷氨酸
（Ｇｉｂｃｏ公司，美国），然后种植于用多聚赖氨酸（Ｓｉｇ
ｍａ公司，美国）包被过的２４孔培养板或玻片上，培
养第２天到第４天加阿糖胞苷抑制胶质细胞增生，
每隔３ｄ进行半量换液，培养１０ｄ后的细胞用于试
验。
１２ 神经元的氧糖剥夺／再灌注（Ｏｘｙｇｅｎｇｌｕｃｏｓｅ
ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ＯＧＤ／Ｒ） 将培养基换为预
先经９５％Ｎ２和５％ＣＯ２混合气饱和的无糖细胞外液
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）（ＮａＣｌ１３７，ＫＣｌ５４，ＣａＣｌ２１８，Ｍｇ
ＳＯ４０８，ＨＥＰＥＳ１０），然后将细胞立即置于持续通
有混合气体（９５％ Ｎ２＋５％ＣＯ２）的密闭容器中，并
继续通气２０ｍｉｎ后夹闭通气口和出气口，在培养箱
内培养。对照组细胞的培养液则换成添加５ｍｍｏｌ
·Ｌ－１葡萄糖的细胞外液后置于培养箱内培养。所
有细胞经２ｈ培养后重新把细胞外液换回Ｎｅｕｒｏｂａｓ
ａｌ培养基，在培养箱内继续培养 ２４ｈ。木犀草素
（Ｓｉｇｍａ公司，美国），哇巴因（Ｓｉｇｍａ公司，美国）等
均在ＯＧＤ前加至细胞外液中。
１３ 大鼠的全脑缺血／再灌模型 雄性ＳＤ大鼠，体
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重２００～２５０ｇ，由浙江大学实验动物中心提供。采用
改良的 Ｐｕｌｓｉｎｅｌｉ四动脉阻断法建立大鼠的全脑缺
血／再灌模型［４］。大鼠经水合氯醛（３５０ｍｇ·ｋｇ－１）腹
腔注射麻醉后，用电针烧闭第一颈椎两侧翼小孔内的
双侧椎动脉，并分离双侧颈总动脉套环备用，缝合切
口后把动物移回笼内饲养２４ｈ。在大鼠完全清醒的
状态下，用动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉，造成短暂
的全脑缺血，１０ｍｉｎ后解除动脉夹，恢复脑血流，凡缺
血后有癫痫、惊厥等症状的大鼠弃用。缺血后的大鼠
继续饲养２４ｈ后断头取海马组织，测定蛋白活性。
对照组动物进行相同的手术但不夹闭颈总动脉。各
组动物均在夹闭颈总动脉９０ｍｉｎ前经腹腔注射木犀
草素或羧甲基纤维素钠溶液。
１４ ＭＴＴ比色法检测细胞存活度 在培养孔中加
入０５ｇ·Ｌ－１的 ＭＴＴ与神经元孵育４ｈ，弃上清后
每孔加入４００μＬ的二甲基亚砜溶解甲瓒，利用酶标
仪在４９０ｎｍ波长下测定甲瓒的吸光度值，反映细胞
存活度。以对照组的细胞存活度为１００％，实验组
细胞存活度 ＝实验组吸光度／对照组吸光度 ×
１００％。
１５ 乳酸脱氢酶（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）漏出
率的测定 细胞损伤或死亡后胞内的 ＬＤＨ会漏出
到培养液中，收集细胞培养液，利用 ＬＤＨ检测试剂
盒（江苏南京建成生物工程研究所）进行反应，在
４４０ｎｍ波长处测定吸光度，为培养液 ＬＤＨ的活性。
神经元经细胞裂解后收集裂解液，测定 ＬＤＨ活性，
此为细胞 ＬＤＨ活性。ＬＤＨ漏出率（％）＝培养液
ＬＤＨ活性 ／（培养液ＬＤＨ活性＋细胞ＬＤＨ活性）×
１００％。
１６ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色测细胞凋亡率 利用 Ｈｏ
ｅｃｈｓｔ细胞凋亡检测试剂盒（江苏碧云天生物技术研
究所），将待测细胞用固定液固定１０ｍｉｎ后进行染
色，封片后在荧光显微镜（Ｎｉｋｏｎ公司，日本）３５０ｎｍ
激发光下观察并计数。凋亡细胞显示核ＤＮＡ浓染、
碎裂、出现凋亡小体等典型的形态学改变。在５００
倍放大下选择紧邻的５个视野计数，以凋亡阳性细
胞数所占细胞总数的百分比为细胞凋亡率。
１７ 钠泵活性的检测 取海马组织称重，在４℃下
按１∶１０的比例加入生理盐水匀浆，经 ３５００ｒ·
ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ后取上清，培养神经元则经细胞
裂解后取上清，用考马斯亮蓝法测定上清液中总蛋
白含量，同时利用 ＡＴＰ酶检测试剂（南京建成生物
工程研究所）进行反应，在６６０ｎｍ波长下测定吸光
度值代表钠泵活性。以钠泵活性与总蛋白量的比值
来反映单位组织中的钠泵活性。
１８ 统计分析 用 Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍ统计及绘图软
件分析实验数据，结果以 珋ｘ±ｓ表示，使用单因素方
差分析，各组间用 ＮｅｗｍａｎＫｅｕｌｓ分析，Ｐ＜００５为
统计学上差异显著，Ｐ＜００１为差异非常显著。
２ 结果
２１ 木犀草素抑制 ＯＧＤ／Ｒ诱导的神经元损伤
培养的海马神经元经氧糖剥夺 ２ｈ和再灌注 ２４ｈ
后，细胞存活度降低到对照组的（６８０８±３１５）％，
而ＬＤＨ漏出率从对照组的（１７００±６２５）％增加到
ＯＧＤ／Ｒ后的（５０４９±９００）％，表明氧糖剥夺／再灌
注会严重损伤神经元。浓度为２０μｍｏｌ·Ｌ－１以上
的木犀草素能显著地改善 ＯＧＤ／Ｒ导致的神经元存
活度下降和 ＬＤＨ漏出率增加，尤其是浓度为 ５０
μｍｏｌ·Ｌ－１的木犀草素近似达到了最大效应，分别
增加细胞存活度到（９２３５±１０５８）％，减少ＬＤＨ漏
出率到（２９３３±２２７）％（Ｐ＜００５），而１０μｍｏｌ·
Ｌ－１浓度以下的木犀草素对神经元的损伤没有明显
改善作用。
２２ 木犀草素抑制 ＯＧＤ／Ｒ诱导的神经元凋亡
在常氧的对照组中，神经元凋亡率为（８６３±
２１２）％，经过 ＯＧＤ／Ｒ处理后，神经元的凋亡率显
著地增加到（２８８８±６４１）％。而木犀草素呈剂量
依赖地降低了 ＯＧＤ／Ｒ诱导的神经元凋亡率，当木
犀草素的浓度达到５０μｍｏｌ·Ｌ－１时，神经元的凋亡
率降低到（９０３±１１７）％，达到最大效应（图１）。
２３ 木犀草素增强了缺血／再灌后钠泵的活性 木
犀草素使培养细胞的钠泵活性从 ＯＧＤ／Ｒ处理后的
（２６６±０３６）Ｕ·ｍｇ－１增加到了（４０９±０４４）Ｕ
·ｍｇ－１。进一步在大鼠全脑缺血／再灌模型上，海
马组织的钠泵活性从对照组的（６０６±１２７）Ｕ·
ｍｇ－１，减少到了缺血／再灌组的（３６４±０１８）Ｕ·
ｍｇ－１，腹腔注射木犀草素（２００ｍｇ·ｋｇ－１）使缺血／
再灌后的钠泵活性恢复到了（４８９±０１９）Ｕ·
ｍｇ－１，差异非常显著（Ｐ＜００１，ｎ＝６）。
２４ 哇巴因阻断了木犀草素的抗缺血／再灌损伤作
用 为了进一步明确木犀草素是否通过增强钠泵活
性从而抑制缺血／再灌后的神经元损伤，实验用钠泵
抑制剂哇巴因抑制了钠泵的活性，结果发现哇巴因
（１００μｍｏｌ·Ｌ－１）本身并不显著改变 ＯＧＲ／Ｒ后
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经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色的细胞核荧光照片，其中凋亡细胞的核浓缩深染，见图中标记。
图１ 木犀草素对ＯＧＤ／Ｒ后的神经元凋亡的影响
的神经元活性，但它阻断了木犀草素（５０μｍｏｌ·
Ｌ－１）的神经元保护作用，使得细胞存活度和ＬＤＨ漏
出率均接近到了未经木犀草素处理的 ＯＧＤ／Ｒ后的
水平，分 别 为 （７１９１±３６８）％ 和 （４８５４±
７１９）％，差异极显著（Ｐ＜００１，ｎ＝６）。
３ 讨论
急性脑缺血将造成神经元坏死和凋亡，并最终
导致患者神经功能障碍甚至死亡。目前针对抗缺血
损伤而开发植物黄酮类化合物的研究发展迅速。本
实验室前期的研究结果发现，从浙江特产杭白菊中
提取的总黄酮能有效的减少大鼠脑缺血／再灌后的
梗死面积，并且抑制线粒体的肿胀［５］。然而杭白菊
中提取的总黄酮成分复杂，难以形成有效的治疗浓
度和科学的给药剂量，所以本研究进一步对杭白菊
总黄酮的主要成分之一木犀草素进行了研究，结果
发现木犀草素能显著地减少缺氧／再灌诱导的神经
元损伤和凋亡，这提示了木犀草素可能就是杭白菊
抗脑缺血／再灌损伤的有效成分。这为进一步开发
和利用杭白菊的药用价值提供了依据。
一直以来，黄酮类化合物的抗氧化特性被认为
是其抗缺血／再灌损伤的主要机制，然而临床应用抗
氧化剂维生素 Ｃ和维生素 Ｅ等并没有取得相应疗
效［３］，而且相比于体外抗氧化能力更强的槲皮素，
木犀草素表现出了更高的体内抗脂质过氧化特
性［２］，以及更好的抗氧化应激心肌细胞保护作
用［６］。由此推测木犀草素除了能清除自由基保护
缺血损伤的神经元，还有其他更复杂的作用机制。
所以本研究从非抗氧化效应的途径上探讨了木犀草
素抗缺血／再灌损伤的可能机制。当脑缺血时，由于
氧气和葡萄糖供应缺乏，以及自由基对线粒体的损
伤作用，使得线粒体产生的 ＡＴＰ量显著减少，从而
首先导致了对 ＡＴＰ依赖性很强的钠泵活性的抑
制［７］，这一结果一方面引起细胞内钠离子增多，渗
透压升高，大量的水进入细胞内造成神经元肿胀、变
性和坏死；另一方面由于胞外钾离子增多使细胞持
续去极化以及Ｎａ＋Ｃａ２＋交换的增强，使细胞内钙离
子浓度增高，释放谷氨酸造成细胞毒性，并激活钙依
赖的酶活性，如蛋白水解酶，核酸内切酶等，诱导细
胞凋亡和坏死。从这一发展过程看，钠泵活性的减
弱对后继的神经元损伤起了至关重要的作用［８９］。
所以本研究检测了脑缺血／再灌后的钠泵活性，结果
发现钠泵活性显著减弱，而木犀草素能部分恢复钠
泵活性，并且在特异性阻断钠泵活性后，木犀草素的
保护作用消失，这一方面说明了木犀草素有逆转缺
血所致的钠泵活性下降的作用，这可能与木犀草素
能抑制细胞膜脂质过氧化从而保护钠泵活性有
关［２，１０］；另一方面说明了木犀草素的抗缺血／再灌损
伤需要通过增强钠泵活性途径起作用，这为今后研
究和治疗脑缺血损伤提供了目标作用点。目前，又
有大量文献证实增强钠泵活性是缺血预处理保护细
胞的机制之一［８９，１１］。这进一步的提示，脑缺血时给
予木犀草素治疗起了类似于缺血预处理的保护
作用。
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［１１］ ＴｉａｎＤ，ＤｍｉｔｒｉｅｖａＲＩ，ＤｏｒｉｓＰＡ，ｅｔａｌＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＭｚｅｔａ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＮａ／ＫＡＴＰａｓｅ：Ａｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｍｅｃｈａ
ｎｉｓｍｏｆｉｓｃｈｅｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｌｉｃｅｃｕｌｔｕｒｅｓ
［Ｊ］ＢｒａｉｎＲｅｓ，２００８，１２１３：１２７
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｏｆｌｕｔｅｏｌｉｎｏｎｎｅｕｒｏｎｓａｇａｉｎｓｔｏｘｙｇｅｎｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／
ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｖｉａｉｍｐｒｏｖｉｎｇＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ＦＡＮＧＬｕｍｅｉ１，ＺＨＡＮＧＭｉｎｇｍｉｎｇ１，ＤＩＮＧＹｕｅｍｉｎ２，ＦＡＮＧＹｕｔｉｎｇ１，ＹＡＯＣｈｕｎｌｅｉ１，ＺＨＡＮＧＸｉｏｎｇ１
（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５８，Ｃｈｉｎａ；
２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｉｔｙＣｏｌｅｇｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００１５，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｌｕｔｅｏｌｉｎ，ａｆｌａｖｏｎｅ，ｈａｓｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｂｙｉｔｓａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍＨｏｗｅｖ
ｅｒ，ｉｔｉｓｓｔｉｌｕｎｃｌｅａｒｗｈｅｔｈｅｒｌｕｔｅｏｌｉｎｃａｎｐｒｏｔｅｃｔｎｅｕｒｏｎｓａｇａｉｎｓｔｏｘｙｇｅｎｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（ＯＧＤ／Ｒ）ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｊｕｒｙ
Ｍｅｔｈｏｄ：Ａｆｔｅｒ２ｈｏｕｒｓｏｘｙｇｅｎｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎａｎｄ２４ｈｏｕｒｓｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓ，ｔｈｅ
ｎｅｕｒｏｎｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙ，ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ｌｅａｋａｇｅａｓｓａｙａｎｄｈｏ
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ｄｏｉ：１０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１００８２５
［责任编辑 张宁宁］
·４５０１·
第３５卷第８期
２０１０年４月
Ｖｏｌ３５，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２０１０