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Establishment of allele-specific diagnostic PCR method for identification of antlers

位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究



全 文 :位点特异性 PCR方法的建立及对近源种
鹿茸药材的鉴别研究
王学勇1,刘春生1,张蓉1,黄璐琦2,崔光红2
(1北京中医药大学 中药学院,北京 100102;2中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:针对正品鹿茸与近源种鹿茸药材饮片鉴别的难点,建立一种简便、快速、准确的近源种鹿茸药材分子鉴别
方法。方法:根据鹿科鹿属种动物Cytb全序列比对分析,设计1对能准确鉴别正品鹿茸(包括梅花鹿和马鹿)和其他近源种鹿
茸的引物,在此基础上建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法,并对影响PCR结果的主要因素退火温度、Taq用量、循环次数
以及模板用量和重复性等进行方法学考察和优化。结果:在方法学考察的基础上,在25μLPCR反应体系,退火温度为65℃
的条件下,能准确扩增出约323bp大小的阳性DNA条带,经测序验证结果表明,系正品鹿茸原动物的Cytb基因序列片段,而
伪品鹿茸未扩增出条带。结论:所建立的位点特异性PCR方法,能将正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材鉴别开来,具有较高的
特异性、重复性,可广泛应用于鹿类药材的鉴别。
[关键词] 位点特异性PCR;近源种鹿茸药材;鉴别
[收稿日期] 20090615
[基金项目] 《中国药典》2010版一部标准研究项目(YD1951)
[通信作者] 黄璐琦,Tel:(010)84738625,Email:huangluqi@
263net
  鹿茸为传统名贵中药材,正品鹿茸来源于鹿科
动物马鹿CervuselaphusLinnaeus或梅花鹿 Cnip
ponTemminck的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角,具壮
肾阳,益精血,强筋骨等功效[1]。鹿茸来源较为复
杂,除马鹿和梅花鹿外,常来源于白唇鹿、水鹿、训
鹿、驼鹿、豚鹿等的幼角[2]。目前,鹿茸主要依据外
部形态、显微特征和理化性状等进行鉴别。陈贷贤
等对多种鹿茸药材和饮片进行了性状、理化鉴别以
及显微组织鉴定等研究[24],为鹿类药材的鉴定和质
量评价提供了一定的参考依据,但上述方法需要丰
富的鉴别经验,主观性较强,未能实现鹿茸鉴定的准
确、快速和客观的理想要求。
鹿类药材如鹿血、鹿鞭、鹿筋及鹿茸等的分子鉴
别研究也有不少文献报道[56],但鲜见有关方法学建
立和考察的研究报道。分子鉴别特别是诸如位点特
异性PCR鉴别对实验条件要求非常严格,考虑到实
验的特异性和重复性,很有必要对所建立方法进行
方法学的严格考察和优化。另外,在报道的鹿类药
材分子鉴别文献中,大多存在近源种鹿茸样本偏少
的现象,而常混有鹿血、鹿鞭等药材样本参与分析鉴
别。这似乎与近源种鹿茸样本收集困难或鹿茸
DNA提取尚有一定难度有关。
本文基于鹿茸正品原动物(包括马鹿和梅花
鹿)及其9种近源物种鹿科动物的 Cytb基因全序
列,设计了一对特异引物,通过方法学考察和条件的
优化,建立了较为简便、准确、稳定的鹿茸DNA鉴别
方法,并对6批不同商品规格的鹿茸正品和9种鹿
科鹿属其他鹿科动物的鹿茸进行了PCR扩增鉴别。
1 材料
11 药材 鹿茸药材及其伪品主要来自吉林、大
连、新疆、北京、甘肃、海南、四川以及新西兰等地,样
品均经大连药品检验所陈贷贤研究员鉴定,详见
表1。
12 试剂与仪器 DNA提取试剂盒(上海生工生
物工程有限公司),UNIQ10柱式动物基因组 DNA
抽提试剂盒(SK1205/1206),蛋白酶 K(Proteinase
K):BBI(货号 LJ072581508J),DNATakararTaq聚
合酶(含dNTP及上样缓冲液)。
Takara公司(DR001A),DNAmarker(100~
2000bp):上海生工生物工程有限公司(GM335),
琼脂糖:AgaroseI上海生工生物工程有限公司
(A0710),电泳缓冲液配制试剂 EDTA,Tris为分子
生物 学 级 试 剂,冰 醋 酸 为 分 析 纯;TC3000
(TECHNE)PCR仪,BioRAD公司电泳系统,Sigma
公司 3K15型离心机,AmpGene紫外凝胶成像分
析仪。
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表1 近源种鹿茸样本
No 来源 商品规格 产地 CytbGenbank号
CN1 Cervusnippon 骨片 黑龙江  AB021091~B021093
CN2 Cnippon 纱片 辽宁大连
CN3 Cnippon 纱片 吉林  
CE1 Celaphus 粉片 北京   AB021096B021098
CE2 Celaphus 纱片 新疆  
CE3 Celaphus 粉片 新西兰 
ED Elaphurusdavidianus 粉片 大连   AF423194
CP Cporcinus 纱片 北京   DQ379301
CEL Celdihainarus 粉片 海南   未注册
CU Cunicolor 蜡片 四川   EU882029
RT Rangifertarandus 粉片 吉林   DQ673135
AA Alcesalces 粉片 吉林   AJ000026
DD Damadama 纱片 北京   AJ000022
CA Calbirostris 纱片 四川   AY044863
CT Ctimorensis 纱片 北京   FJ556573
2 方法与结果
2.1 DNA的提取及质量检测
取供试品(鹿茸饮片)适量(约05g),液氮中充
分研磨成粉末,用UNIQ10柱式动物基因组DNA抽
提试剂盒进行鹿茸DNA的提取,具体步骤按试剂盒
说明书进行操作,结果经电泳检测可见有弥散条带
(图 1)。然后以试剂盒提取的 DNA为模板,以
L14724 5′CGAGATCTGAAAAACCATCGTTG3′和
H15149 5′AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTT
GTCCTCA3′作为通用引物[2],PCR反应参数为94
℃ 预变性5min,然后94℃变性30s,54℃复性30s,
72℃延伸1min,共计35个循环,72℃延伸 7min,
对上述各模板进行 PCR扩增,检验模板质量。如各
模板PCR扩增产物在电泳图谱中出现425bp大小的
DNA条带(图1),说明模板质量达到 PCR扩增鉴别
要求,可以进行下游PCR扩增鉴别研究。
A提取的总DNA;B采用通用引物L14724/H15149PCR扩增
后电泳图;1~15CN1,CN2,CN3,CE1,CE2,CE3,ED,CP,
CEL,CU,RT,AA,DD,CA,CT(同表1)。
图1 DNA的提取及质量检测
22 特异性引物的设计
从GenBank下载鹿类中药材的正品原动物梅
花鹿(Cervusnipponkeramae,Cnipponmageshimae,
Cnipponnippon,Cnipponcentralis)(Genbank登陆
号AB021091AB021094)和马鹿(CelaphusCana
densis,Celaphusxanthopygus,Celaphusscoticus,
Celaphuskansuensis)(Genbank登陆号AB021096
AB021098)及表1中所有混伪品原动物的 Cytb基
因全序列 (GenBank登录号依次为 AF423194,
DQ379301, EU882029, DQ673135, AJ000026,
AJ000022,AY044863,FJ556573),经 DNAMAN软件
比对分析后,分析正、混伪品间DNA序列差异,设计
出一对能特异性扩增梅花鹿和马鹿 Cytb基因片段
的位点特异性鉴别引物)PMLF25′GACCTC
CCAGCCCCATCG3′和 PMLR5′GCTGTGGCTATA
ACTGTAAATAGGAGG3′(上海生工合成)。
23 特异性鉴别PCR方法学考察
231 退火温度考察 利用正品药材以及其常见
的混淆品驯鹿退火温度考察。分别设置退火温度为
58,60,62,64,65,68℃进行 PCR,结果58~68℃,
鹿茸正品均能扩增目的条带,而阴性对照均未出现
条带,但是当温度超过65℃时,扩增条带较弱。同
时为防止温度低后其他伪品出现假阳性条带,以及
兼顾不同 PCR的温度误差,最终确定 PCR退火温
度为65℃。
232 DNA模板量考察 对25μLPCR反应体系中
的模板DNA用量进行了考察,分别设置为025μL
(60ng),05μL(120ng),1μL(240ng),结果
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025~1μL均能有效扩增。为防止模板浓度高后抑
制PCR反应及节省模板角度考虑,最终选择25μL
体系中加入05μL模板作为最终浓度。由于适宜
PCR扩增的模板DNA浓度范围较宽,因此,DNA提
取以后可以省去测定浓度和纯度的步骤,直接采用
琼脂糖电泳检测DNA的提取情况。
233 不同 Taq酶用量考察 25μL体系中 Taq
酶分别加005(025U),01μL(05U),013μL
(065U),05μL(25U),结果加 01~013μL
的鉴别结果较理想,而当05μL时,伪品驼鹿出现
了假阳性条带,表明 Taq酶用量不能超过05μL,
考虑到成本及实验结果准确性,终确定25μLPCR
反应体系中Taq酶用量为013μL,即065U。
234 循环次数考察 分别选用30个循环和40
个循环进行考察,结果30个循环和40个循环均能
得到准确鉴别,但30个循环的条带略浅,为防止降
解严重的DNA循环次数少后,条带太弱以至于造成
假阴性的误判,将循环次数确定为40个循环。
235 重复性考察 高特异引物(PLRF/PLRR)
在94℃ 预变性5min,然后94℃ 变性30s,65℃
复性30s,72℃ 延伸1min共计40个循环,最后72
℃延伸 7min的PCR反应条件下,选用普通的 rTaq
酶,25μL的 PCR反应体系就能将正品鹿茸(马鹿
和梅花鹿)与其他鹿科动物的混淆品鉴别开来,经
多次重复,其重复性良好,达到推广使用的标准。
236 PCR方法的建立 在上述方法学考察的基础
上,最终确立的鹿茸位点特异 PCR鉴别方法。其中
PCR反应体系为:在200μLPCR反应管中依次加
入10×PCR缓冲液25μL,dNTP(25mmol·L-1)
2μL,引物(10μmol·L-1)05μL,rTaqDNA聚合
酶(5U·μL-1)013μL,模板05μL(约100ng),
无菌双蒸水19μL。根据待测样品的数量配制n+1
管的上述混合溶液,然后进行分装。PCR反应参数
为:94℃ 预变性5min,然后94℃ 变性30s,65℃
复性30s,72℃ 延伸1min共计40个循环,最后72
℃延伸7min。实验中设置无模板DNA的空白对照
以及阴性对照和阳性对照。
24 11种鹿茸药材的特异性PCR鉴别结果
采用上述优化后的体系和条件,对6种不同批
次的正品鹿茸(马鹿和梅花鹿)和9种近源种鹿茸
进行PCR扩增鉴别,结果正品梅花鹿、马鹿和阳性
对照均扩增出约323bp大小的 DNA条带,经测序
验证结果表明,阳性DNA条带确实系马鹿和梅花鹿
的Cytb基因序列片段。该结果表明该方法特异较
高,能准确的鉴别正品鹿茸(花鹿茸和马鹿茸),见
图2。同源性聚类分析结果见图3。
1~3CN1,CN2,CN3;4~6CE1,CE2,CE3;7空白对照;
8阳性对照;10~17近源种鹿茸样本 ED,CP,CEL,CU,RT,
AA,DD,CA,CT;M2000bpDNA相对标准分子质量。
图2 鹿茸药材PCR鉴别
编号CN1~AA样本与表1相一致。
图3 同源性聚类分析
3 结论与讨论
鹿茸鉴别的瓶颈和难点是正品鹿茸饮片与近源
种鹿茸混用品的鉴别。因此,建立一种简便特异的
鹿茸药材分子鉴别方法具重要的现实意义。
研究结果表明,本方法具有较高的特异性、重复
性,能准确将正品鹿茸与同科同属的其他鹿茸鉴别
开来,经可广泛应用于鹿类药材的鉴别。
对药典规定的正品茸原动物梅花鹿和马鹿以及
其他9种鹿科鹿属近源种的 Cytb基因全序列进行
了比对分析发现,不同产地梅花鹿种内同源性达
99%以上,马鹿种内同源性为97%以上;种间同源
性分析发现,11种鹿科动物中,马鹿和梅花鹿种间
的同源性最高,达95%以上,而与其他鹿鹿科动物
相比,同源性相对较低。同源性聚类分析表明,梅花
鹿和马鹿聚为一类,与其他同源性相对较低鹿科动
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物处于不同的分支。这表明处于同一聚类分支内的
梅花鹿和马鹿(正品)Cytb基因间变的异较小,较为
保守,而与其他分支的近源种比较,Cytb基因间变
异较大,保守性较低,与文献报道一致。鹿科动物
Cytb基因的这一特点为设计能同时将梅花鹿和马
鹿茸与伪品相鉴别开的特异引物(PLRF/PLRR)
奠定了理论基础。
理论上,所设计的特异引物特别是3′端与正品
鹿马鹿和梅花鹿的Cytb基因序列严格互补配对,而
与其他混用品鹿的不配对或配对不严谨。因此,在
高严谨 PCR条件下,仅配对严谨的正品鹿茸 DNA
模板能扩增出阳性DNA条带,而其他鹿科动物或作
假鹿茸饮片则出现阴性扩增。但在实验过程中,由
于鹿茸类药材本身骨质化和角质化以及加工炮制和
储存时间等因素均会对DNA造成不同程度的降解,
这有可能会造成鹿茸正品的假阴性扩增。因此,在
进行DNA提取时,需尽可能的获取较完整的基因组
DNA;另外,在进行特异引物PCR扩增之前,运用通
用引物L14724/H15149对提取的DNA模板进行扩
增检测,以检验模板DNA质量是否符合下游操作要
求,如能扩增出约425bp的DNA条带,证明模板质
量符合位点特PCR扩增要求。
影响位点特异PCR扩增的因素很多,比如在退
火温度参数考察过程中,发现58~68℃,鹿茸正品
均能扩增目的条带,但是当温度超过65℃时,扩增
条带较弱,从特异性上来考虑,68℃特异性相对较
高,但需兼顾重复性和稳定性考虑,因此选用65℃
作为PCR扩增的最佳退火温度。
鉴于DNA作为遗传信息的直接载体,不受外界
因素和生物个体发育及器官差异的影响,每个生物个
体不同器官的任一细胞均含有相同的遗传信息,因此
从理论上来说,只要满足DNA质量要求,所建立的方
法还适用与鹿相关的其他任何细胞组织包括鹿角、鹿
胎、鹿鞭等的鉴别。另外,由于分子鉴别是基于DNA
遗传信息的定性鉴别,仅能解决药材的“真、伪”问
题,而对与鹿类药材“优、劣”的判别还需结合性状鉴
定和显微观察等方法综合进行综合分析。
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鹿和梅花鹿的PCR鉴定[J]中草药,2006,37(10):1566
EstablishmentofalelespecificdiagnosticPCRmethodfor
identificationofantlers
WANGXueyong1,LIUChunsheng1,ZHANGRong1,HUANGLuqi2,CUIGuanghong2
(1ColegeofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;
2InstituteofChineseMeteriaMedica,ChinaAcademyofChineseSciences,Beijing100700China)
  [Abstract] Objective:Toestablishaconvenient,quickandaccuratemolecularmethodfortheidentificationofcrudedrugsof
antlersduetothedificultdiscriminationbetweenthegenuineantleranditsadulterantsMethod:Accordingtothealignmentanalysis
offullengthsequencesofCytbgenefromcloselyrelatespeciesofCervus,onepairofalelespecificdiagnosticPCRprimerswasde
signedFactorssuchasannealingtemperature,dosageofpolymerase,timesofcyclesanddosageoftemplateDNAthatinfluencethe
PCRresultswerealsoinvestigatedResult:Basedonthestudymentionedabove,about323bppositivebandwasamplifiedunderthe
annealingtemperatureof65℃ inthetotalvolumeof25μLPCRreactionusingthegenuineantlerDNAasthetemplateSequencing
resultsprovedthatthepositivebandwasthefragmentofCytbgenefrombothCelaphusLinnaeusandCnipponTemminckConclu
sion:Theestablishedmethod,withhigherspecificityandreproducibility,couldaccuratelydiferentiategenuineantlerfromitsadulter
antsandwouldbewidelyusedinCervusrelatedChinesecrudedrugs′identification
[Keywords] AlelespecificdiagnosticPCR;antlersfromcloselyrelatespeciesofCervus;identification
[责任编辑 吕冬梅]
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