全 文 ：位点特异性 ＰＣＲ方法的建立及对近源种
鹿茸药材的鉴别研究
王学勇１，刘春生１，张蓉１，黄璐琦２，崔光红２
（１北京中医药大学 中药学院，北京 １００１０２；２中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００）
［摘要］ 目的：针对正品鹿茸与近源种鹿茸药材饮片鉴别的难点，建立一种简便、快速、准确的近源种鹿茸药材分子鉴别
方法。方法：根据鹿科鹿属种动物Ｃｙｔｂ全序列比对分析，设计１对能准确鉴别正品鹿茸（包括梅花鹿和马鹿）和其他近源种鹿
茸的引物，在此基础上建立鹿茸药材位点特异性ＰＣＲ鉴别方法，并对影响ＰＣＲ结果的主要因素退火温度、Ｔａｑ用量、循环次数
以及模板用量和重复性等进行方法学考察和优化。结果：在方法学考察的基础上，在２５μＬＰＣＲ反应体系，退火温度为６５℃
的条件下，能准确扩增出约３２３ｂｐ大小的阳性ＤＮＡ条带，经测序验证结果表明，系正品鹿茸原动物的Ｃｙｔｂ基因序列片段，而
伪品鹿茸未扩增出条带。结论：所建立的位点特异性ＰＣＲ方法，能将正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材鉴别开来，具有较高的
特异性、重复性，可广泛应用于鹿类药材的鉴别。
［关键词］ 位点特异性ＰＣＲ；近源种鹿茸药材；鉴别
［收稿日期］ ２００９０６１５
［基金项目］ 《中国药典》２０１０版一部标准研究项目（ＹＤ１９５１）
［通信作者］ 黄璐琦，Ｔｅｌ：（０１０）８４７３８６２５，Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｌｕｑｉ＠
２６３ｎｅｔ
鹿茸为传统名贵中药材，正品鹿茸来源于鹿科
动物马鹿ＣｅｒｖｕｓｅｌａｐｈｕｓＬｉｎｎａｅｕｓ或梅花鹿 Ｃｎｉｐ
ｐｏｎＴｅｍｍｉｎｃｋ的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具壮
肾阳，益精血，强筋骨等功效［１］。鹿茸来源较为复
杂，除马鹿和梅花鹿外，常来源于白唇鹿、水鹿、训
鹿、驼鹿、豚鹿等的幼角［２］。目前，鹿茸主要依据外
部形态、显微特征和理化性状等进行鉴别。陈贷贤
等对多种鹿茸药材和饮片进行了性状、理化鉴别以
及显微组织鉴定等研究［２４］，为鹿类药材的鉴定和质
量评价提供了一定的参考依据，但上述方法需要丰
富的鉴别经验，主观性较强，未能实现鹿茸鉴定的准
确、快速和客观的理想要求。
鹿类药材如鹿血、鹿鞭、鹿筋及鹿茸等的分子鉴
别研究也有不少文献报道［５６］，但鲜见有关方法学建
立和考察的研究报道。分子鉴别特别是诸如位点特
异性ＰＣＲ鉴别对实验条件要求非常严格，考虑到实
验的特异性和重复性，很有必要对所建立方法进行
方法学的严格考察和优化。另外，在报道的鹿类药
材分子鉴别文献中，大多存在近源种鹿茸样本偏少
的现象，而常混有鹿血、鹿鞭等药材样本参与分析鉴
别。这似乎与近源种鹿茸样本收集困难或鹿茸
ＤＮＡ提取尚有一定难度有关。
本文基于鹿茸正品原动物（包括马鹿和梅花
鹿）及其９种近源物种鹿科动物的 Ｃｙｔｂ基因全序
列，设计了一对特异引物，通过方法学考察和条件的
优化，建立了较为简便、准确、稳定的鹿茸ＤＮＡ鉴别
方法，并对６批不同商品规格的鹿茸正品和９种鹿
科鹿属其他鹿科动物的鹿茸进行了ＰＣＲ扩增鉴别。
１ 材料
１１ 药材 鹿茸药材及其伪品主要来自吉林、大
连、新疆、北京、甘肃、海南、四川以及新西兰等地，样
品均经大连药品检验所陈贷贤研究员鉴定，详见
表１。
１２ 试剂与仪器 ＤＮＡ提取试剂盒（上海生工生
物工程有限公司），ＵＮＩＱ１０柱式动物基因组 ＤＮＡ
抽提试剂盒（ＳＫ１２０５／１２０６），蛋白酶 Ｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋ）：ＢＢＩ（货号 ＬＪ０７２５８１５０８Ｊ），ＤＮＡＴａｋａｒａｒＴａｑ聚
合酶（含ｄＮＴＰ及上样缓冲液）。
Ｔａｋａｒａ公司（ＤＲ００１Ａ），ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（１００～
２０００ｂｐ）：上海生工生物工程有限公司（ＧＭ３３５），
琼脂糖：ＡｇａｒｏｓｅＩ上海生工生物工程有限公司
（Ａ０７１０），电泳缓冲液配制试剂 ＥＤＴＡ，Ｔｒｉｓ为分子
生物 学 级 试 剂，冰 醋 酸 为 分 析 纯；ＴＣ３０００
（ＴＥＣＨＮＥ）ＰＣＲ仪，ＢｉｏＲＡＤ公司电泳系统，Ｓｉｇｍａ
公司 ３Ｋ１５型离心机，ＡｍｐＧｅｎｅ紫外凝胶成像分
析仪。
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表１ 近源种鹿茸样本
Ｎｏ 来源 商品规格 产地 ＣｙｔｂＧｅｎｂａｎｋ号
ＣＮ１ Ｃｅｒｖｕｓｎｉｐｐｏｎ 骨片 黑龙江 ＡＢ０２１０９１～Ｂ０２１０９３
ＣＮ２ Ｃｎｉｐｐｏｎ 纱片 辽宁大连
ＣＮ３ Ｃｎｉｐｐｏｎ 纱片 吉林
ＣＥ１ Ｃｅｌａｐｈｕｓ 粉片 北京 ＡＢ０２１０９６Ｂ０２１０９８
ＣＥ２ Ｃｅｌａｐｈｕｓ 纱片 新疆
ＣＥ３ Ｃｅｌａｐｈｕｓ 粉片 新西兰
ＥＤ Ｅｌａｐｈｕｒｕｓｄａｖｉｄｉａｎｕｓ 粉片 大连 ＡＦ４２３１９４
ＣＰ Ｃｐｏｒｃｉｎｕｓ 纱片 北京 ＤＱ３７９３０１
ＣＥＬ Ｃｅｌｄｉｈａｉｎａｒｕｓ 粉片 海南 未注册
ＣＵ Ｃｕｎｉｃｏｌｏｒ 蜡片 四川 ＥＵ８８２０２９
ＲＴ Ｒａｎｇｉｆｅｒｔａｒａｎｄｕｓ 粉片 吉林 ＤＱ６７３１３５
ＡＡ Ａｌｃｅｓａｌｃｅｓ 粉片 吉林 ＡＪ００００２６
ＤＤ Ｄａｍａｄａｍａ 纱片 北京 ＡＪ００００２２
ＣＡ Ｃａｌｂｉｒｏｓｔｒｉｓ 纱片 四川 ＡＹ０４４８６３
ＣＴ Ｃｔｉｍｏｒｅｎｓｉｓ 纱片 北京 ＦＪ５５６５７３
２ 方法与结果
２．１ ＤＮＡ的提取及质量检测
取供试品（鹿茸饮片）适量（约０５ｇ），液氮中充
分研磨成粉末，用ＵＮＩＱ１０柱式动物基因组ＤＮＡ抽
提试剂盒进行鹿茸ＤＮＡ的提取，具体步骤按试剂盒
说明书进行操作，结果经电泳检测可见有弥散条带
（图 １）。然后以试剂盒提取的 ＤＮＡ为模板，以
Ｌ１４７２４ ５′ＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣＧＴＴＧ３′和
Ｈ１５１４９ ５′ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴ
ＧＴＣＣＴＣＡ３′作为通用引物［２］，ＰＣＲ反应参数为９４
℃ 预变性５ｍｉｎ，然后９４℃变性３０ｓ，５４℃复性３０ｓ，
７２℃延伸１ｍｉｎ，共计３５个循环，７２℃延伸 ７ｍｉｎ，
对上述各模板进行 ＰＣＲ扩增，检验模板质量。如各
模板ＰＣＲ扩增产物在电泳图谱中出现４２５ｂｐ大小的
ＤＮＡ条带（图１），说明模板质量达到 ＰＣＲ扩增鉴别
要求，可以进行下游ＰＣＲ扩增鉴别研究。
Ａ提取的总ＤＮＡ；Ｂ采用通用引物Ｌ１４７２４／Ｈ１５１４９ＰＣＲ扩增
后电泳图；１～１５ＣＮ１，ＣＮ２，ＣＮ３，ＣＥ１，ＣＥ２，ＣＥ３，ＥＤ，ＣＰ，
ＣＥＬ，ＣＵ，ＲＴ，ＡＡ，ＤＤ，ＣＡ，ＣＴ（同表１）。
图１ ＤＮＡ的提取及质量检测
２２ 特异性引物的设计
从ＧｅｎＢａｎｋ下载鹿类中药材的正品原动物梅
花鹿（Ｃｅｒｖｕｓｎｉｐｐｏｎｋｅｒａｍａｅ，Ｃｎｉｐｐｏｎｍａｇｅｓｈｉｍａｅ，
Ｃｎｉｐｐｏｎｎｉｐｐｏｎ，Ｃｎｉｐｐｏｎｃｅｎｔｒａｌｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ登陆
号ＡＢ０２１０９１ＡＢ０２１０９４）和马鹿（ＣｅｌａｐｈｕｓＣａｎａ
ｄｅｎｓｉｓ，Ｃｅｌａｐｈｕｓｘａｎｔｈｏｐｙｇｕｓ，Ｃｅｌａｐｈｕｓｓｃｏｔｉｃｕｓ，
Ｃｅｌａｐｈｕｓｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ登陆号ＡＢ０２１０９６
ＡＢ０２１０９８）及表１中所有混伪品原动物的 Ｃｙｔｂ基
因全序列 （ＧｅｎＢａｎｋ登录号依次为 ＡＦ４２３１９４，
ＤＱ３７９３０１， ＥＵ８８２０２９， ＤＱ６７３１３５， ＡＪ００００２６，
ＡＪ００００２２，ＡＹ０４４８６３，ＦＪ５５６５７３），经 ＤＮＡＭＡＮ软件
比对分析后，分析正、混伪品间ＤＮＡ序列差异，设计
出一对能特异性扩增梅花鹿和马鹿 Ｃｙｔｂ基因片段
的位点特异性鉴别引物）ＰＭＬＦ２５′ＧＡＣＣＴＣ
ＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧ３′和 ＰＭＬＲ５′ＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＡ
ＡＣＴＧＴＡＡＡＴＡＧＧＡＧＧ３′（上海生工合成）。
２３ 特异性鉴别ＰＣＲ方法学考察
２３１ 退火温度考察 利用正品药材以及其常见
的混淆品驯鹿退火温度考察。分别设置退火温度为
５８，６０，６２，６４，６５，６８℃进行 ＰＣＲ，结果５８～６８℃，
鹿茸正品均能扩增目的条带，而阴性对照均未出现
条带，但是当温度超过６５℃时，扩增条带较弱。同
时为防止温度低后其他伪品出现假阳性条带，以及
兼顾不同 ＰＣＲ的温度误差，最终确定 ＰＣＲ退火温
度为６５℃。
２３２ ＤＮＡ模板量考察 对２５μＬＰＣＲ反应体系中
的模板ＤＮＡ用量进行了考察，分别设置为０２５μＬ
（６０ｎｇ），０５μＬ（１２０ｎｇ），１μＬ（２４０ｎｇ），结果
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０２５～１μＬ均能有效扩增。为防止模板浓度高后抑
制ＰＣＲ反应及节省模板角度考虑，最终选择２５μＬ
体系中加入０５μＬ模板作为最终浓度。由于适宜
ＰＣＲ扩增的模板ＤＮＡ浓度范围较宽，因此，ＤＮＡ提
取以后可以省去测定浓度和纯度的步骤，直接采用
琼脂糖电泳检测ＤＮＡ的提取情况。
２３３ 不同 Ｔａｑ酶用量考察 ２５μＬ体系中 Ｔａｑ
酶分别加００５（０２５Ｕ），０１μＬ（０５Ｕ），０１３μＬ
（０６５Ｕ），０５μＬ（２５Ｕ），结果加 ０１～０１３μＬ
的鉴别结果较理想，而当０５μＬ时，伪品驼鹿出现
了假阳性条带，表明 Ｔａｑ酶用量不能超过０５μＬ，
考虑到成本及实验结果准确性，终确定２５μＬＰＣＲ
反应体系中Ｔａｑ酶用量为０１３μＬ，即０６５Ｕ。
２３４ 循环次数考察 分别选用３０个循环和４０
个循环进行考察，结果３０个循环和４０个循环均能
得到准确鉴别，但３０个循环的条带略浅，为防止降
解严重的ＤＮＡ循环次数少后，条带太弱以至于造成
假阴性的误判，将循环次数确定为４０个循环。
２３５ 重复性考察 高特异引物（ＰＬＲＦ／ＰＬＲＲ）
在９４℃ 预变性５ｍｉｎ，然后９４℃ 变性３０ｓ，６５℃
复性３０ｓ，７２℃ 延伸１ｍｉｎ共计４０个循环，最后７２
℃延伸 ７ｍｉｎ的ＰＣＲ反应条件下，选用普通的 ｒＴａｑ
酶，２５μＬ的 ＰＣＲ反应体系就能将正品鹿茸（马鹿
和梅花鹿）与其他鹿科动物的混淆品鉴别开来，经
多次重复，其重复性良好，达到推广使用的标准。
２３６ ＰＣＲ方法的建立 在上述方法学考察的基础
上，最终确立的鹿茸位点特异 ＰＣＲ鉴别方法。其中
ＰＣＲ反应体系为：在２００μＬＰＣＲ反应管中依次加
入１０×ＰＣＲ缓冲液２５μＬ，ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
２μＬ，引物（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）０５μＬ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合
酶（５Ｕ·μＬ－１）０１３μＬ，模板０５μＬ（约１００ｎｇ），
无菌双蒸水１９μＬ。根据待测样品的数量配制ｎ＋１
管的上述混合溶液，然后进行分装。ＰＣＲ反应参数
为：９４℃ 预变性５ｍｉｎ，然后９４℃ 变性３０ｓ，６５℃
复性３０ｓ，７２℃ 延伸１ｍｉｎ共计４０个循环，最后７２
℃延伸７ｍｉｎ。实验中设置无模板ＤＮＡ的空白对照
以及阴性对照和阳性对照。
２４ １１种鹿茸药材的特异性ＰＣＲ鉴别结果
采用上述优化后的体系和条件，对６种不同批
次的正品鹿茸（马鹿和梅花鹿）和９种近源种鹿茸
进行ＰＣＲ扩增鉴别，结果正品梅花鹿、马鹿和阳性
对照均扩增出约３２３ｂｐ大小的 ＤＮＡ条带，经测序
验证结果表明，阳性ＤＮＡ条带确实系马鹿和梅花鹿
的Ｃｙｔｂ基因序列片段。该结果表明该方法特异较
高，能准确的鉴别正品鹿茸（花鹿茸和马鹿茸），见
图２。同源性聚类分析结果见图３。
１～３ＣＮ１，ＣＮ２，ＣＮ３；４～６ＣＥ１，ＣＥ２，ＣＥ３；７空白对照；
８阳性对照；１０～１７近源种鹿茸样本 ＥＤ，ＣＰ，ＣＥＬ，ＣＵ，ＲＴ，
ＡＡ，ＤＤ，ＣＡ，ＣＴ；Ｍ２０００ｂｐＤＮＡ相对标准分子质量。
图２ 鹿茸药材ＰＣＲ鉴别
编号ＣＮ１～ＡＡ样本与表１相一致。
图３ 同源性聚类分析
３ 结论与讨论
鹿茸鉴别的瓶颈和难点是正品鹿茸饮片与近源
种鹿茸混用品的鉴别。因此，建立一种简便特异的
鹿茸药材分子鉴别方法具重要的现实意义。
研究结果表明，本方法具有较高的特异性、重复
性，能准确将正品鹿茸与同科同属的其他鹿茸鉴别
开来，经可广泛应用于鹿类药材的鉴别。
对药典规定的正品茸原动物梅花鹿和马鹿以及
其他９种鹿科鹿属近源种的 Ｃｙｔｂ基因全序列进行
了比对分析发现，不同产地梅花鹿种内同源性达
９９％以上，马鹿种内同源性为９７％以上；种间同源
性分析发现，１１种鹿科动物中，马鹿和梅花鹿种间
的同源性最高，达９５％以上，而与其他鹿鹿科动物
相比，同源性相对较低。同源性聚类分析表明，梅花
鹿和马鹿聚为一类，与其他同源性相对较低鹿科动
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物处于不同的分支。这表明处于同一聚类分支内的
梅花鹿和马鹿（正品）Ｃｙｔｂ基因间变的异较小，较为
保守，而与其他分支的近源种比较，Ｃｙｔｂ基因间变
异较大，保守性较低，与文献报道一致。鹿科动物
Ｃｙｔｂ基因的这一特点为设计能同时将梅花鹿和马
鹿茸与伪品相鉴别开的特异引物（ＰＬＲＦ／ＰＬＲＲ）
奠定了理论基础。
理论上，所设计的特异引物特别是３′端与正品
鹿马鹿和梅花鹿的Ｃｙｔｂ基因序列严格互补配对，而
与其他混用品鹿的不配对或配对不严谨。因此，在
高严谨 ＰＣＲ条件下，仅配对严谨的正品鹿茸 ＤＮＡ
模板能扩增出阳性ＤＮＡ条带，而其他鹿科动物或作
假鹿茸饮片则出现阴性扩增。但在实验过程中，由
于鹿茸类药材本身骨质化和角质化以及加工炮制和
储存时间等因素均会对ＤＮＡ造成不同程度的降解，
这有可能会造成鹿茸正品的假阴性扩增。因此，在
进行ＤＮＡ提取时，需尽可能的获取较完整的基因组
ＤＮＡ；另外，在进行特异引物ＰＣＲ扩增之前，运用通
用引物Ｌ１４７２４／Ｈ１５１４９对提取的ＤＮＡ模板进行扩
增检测，以检验模板ＤＮＡ质量是否符合下游操作要
求，如能扩增出约４２５ｂｐ的ＤＮＡ条带，证明模板质
量符合位点特ＰＣＲ扩增要求。
影响位点特异ＰＣＲ扩增的因素很多，比如在退
火温度参数考察过程中，发现５８～６８℃，鹿茸正品
均能扩增目的条带，但是当温度超过６５℃时，扩增
条带较弱，从特异性上来考虑，６８℃特异性相对较
高，但需兼顾重复性和稳定性考虑，因此选用６５℃
作为ＰＣＲ扩增的最佳退火温度。
鉴于ＤＮＡ作为遗传信息的直接载体，不受外界
因素和生物个体发育及器官差异的影响，每个生物个
体不同器官的任一细胞均含有相同的遗传信息，因此
从理论上来说，只要满足ＤＮＡ质量要求，所建立的方
法还适用与鹿相关的其他任何细胞组织包括鹿角、鹿
胎、鹿鞭等的鉴别。另外，由于分子鉴别是基于ＤＮＡ
遗传信息的定性鉴别，仅能解决药材的“真、伪”问
题，而对与鹿类药材“优、劣”的判别还需结合性状鉴
定和显微观察等方法综合进行综合分析。
［参考文献］
［１］ 中国药典一部［Ｓ］２００５：２２６
［２］ 陈代贤，郭月秋，任玮，等１２种鹿茸药材的性状鉴别［Ｊ］中
药材，１９９９，２２（９）：４４１
［３］ 陈代贤，郭月秋，任玮，等１１种鹿茸组织特征比较鉴别［Ｊ］
中药材，２０００，２３（１２）：７４３
［４］ 陈代贤，郭月秋，任玮１３种鹿茸片性状及荧光特征鉴定［Ｊ］
中药材，１９９９，２２（１０）：５０４
［５］ 刘向华，王义权，周开亚鹿类中药材的位点特异性ＰＣＲ鉴定
研究［Ｊ］药学学报，２００１，３６（８）：６３１
［６］ 白根本，张林源，刘春生鹿源类中药材 ＤＮＡ序列分析及马
鹿和梅花鹿的ＰＣＲ鉴定［Ｊ］中草药，２００６，３７（１０）：１５６６
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃｄｉａｇｎｏｓｔｉｃＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｔｌｅｒｓ
ＷＡＮＧＸｕｅｙｏｎｇ１，ＬＩＵＣｈｕｎｓｈｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＲｏｎｇ１，ＨＵＡＮＧＬｕｑｉ２，ＣＵＩＧｕａｎｇｈｏｎｇ２
（１ＣｏｌｅｇｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０２，Ｃｈｉｎａ；
２ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｑｕｉｃｋａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｒｕｄｅｄｒｕｇｓｏｆ
ａｎｔｌｅｒｓｄｕｅｔｏｔｈｅｄｉｆｉｃｕｌｔｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｇｅｎｕｉｎｅａｎｔｌｅｒａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓＭｅｔｈｏｄ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆｆｕｌｌｅｎｇｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣｙｔｂｇｅｎｅｆｒｏｍｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｅｒｖｕｓ，ｏｎｅｐａｉｒｏｆａｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃｄｉａｇｎｏｓｔｉｃＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｗａｓｄｅ
ｓｉｇｎｅｄＦａｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｄｏｓａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｔｉｍｅｓｏｆｃｙｃｌｅｓａｎｄｄｏｓａｇｅｏｆｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡｔｈａｔｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅ
ＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄＲｅｓｕｌｔ：Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｔｕｄｙｍｅｎｔｉｏｎｅｄａｂｏｖｅ，ａｂｏｕｔ３２３ｂｐｐｏｓｉｔｉｖｅｂａｎｄｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅ
ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ６５℃ ｉｎｔｈｅｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅｏｆ２５μＬＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｔｈｅｇｅｎｕｉｎｅａｎｔｌｅｒＤＮＡａｓｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｂａｎｄｗａｓｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＣｙｔｂｇｅｎｅｆｒｏｍｂｏｔｈＣｅｌａｐｈｕｓＬｉｎｎａｅｕｓａｎｄＣｎｉｐｐｏｎＴｅｍｍｉｎｃｋＣｏｎｃｌｕ
ｓｉｏｎ：Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｍｅｔｈｏｄ，ｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，ｃｏｕｌｄａｃｃｕｒａｔｅｌｙｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｇｅｎｕｉｎｅａｎｔｌｅｒｆｒｏｍｉｔｓａｄｕｌｔｅｒ
ａｎｔｓａｎｄｗｏｕｌｄｂｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎＣｅｒｖｕｓｒｅｌａｔｅｄＣｈｉｎｅｓｅｃｒｕｄｅｄｒｕｇｓ′ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＡｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃｄｉａｇｎｏｓｔｉｃＰＣＲ；ａｎｔｌｅｒｓｆｒｏｍｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｅｒｖｕｓ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
［责任编辑 吕冬梅］
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