全 文 :位点特异性 PCR方法的建立及对近源种
鹿茸药材的鉴别研究
王学勇1,刘春生1,张蓉1,黄璐琦2,崔光红2
(1北京中医药大学 中药学院,北京 100102;2中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:针对正品鹿茸与近源种鹿茸药材饮片鉴别的难点,建立一种简便、快速、准确的近源种鹿茸药材分子鉴别
方法。方法:根据鹿科鹿属种动物Cytb全序列比对分析,设计1对能准确鉴别正品鹿茸(包括梅花鹿和马鹿)和其他近源种鹿
茸的引物,在此基础上建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法,并对影响PCR结果的主要因素退火温度、Taq用量、循环次数
以及模板用量和重复性等进行方法学考察和优化。结果:在方法学考察的基础上,在25μLPCR反应体系,退火温度为65℃
的条件下,能准确扩增出约323bp大小的阳性DNA条带,经测序验证结果表明,系正品鹿茸原动物的Cytb基因序列片段,而
伪品鹿茸未扩增出条带。结论:所建立的位点特异性PCR方法,能将正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材鉴别开来,具有较高的
特异性、重复性,可广泛应用于鹿类药材的鉴别。
[关键词] 位点特异性PCR;近源种鹿茸药材;鉴别
[收稿日期] 20090615
[基金项目] 《中国药典》2010版一部标准研究项目(YD1951)
[通信作者] 黄璐琦,Tel:(010)84738625,Email:huangluqi@
263net
鹿茸为传统名贵中药材,正品鹿茸来源于鹿科
动物马鹿CervuselaphusLinnaeus或梅花鹿 Cnip
ponTemminck的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角,具壮
肾阳,益精血,强筋骨等功效[1]。鹿茸来源较为复
杂,除马鹿和梅花鹿外,常来源于白唇鹿、水鹿、训
鹿、驼鹿、豚鹿等的幼角[2]。目前,鹿茸主要依据外
部形态、显微特征和理化性状等进行鉴别。陈贷贤
等对多种鹿茸药材和饮片进行了性状、理化鉴别以
及显微组织鉴定等研究[24],为鹿类药材的鉴定和质
量评价提供了一定的参考依据,但上述方法需要丰
富的鉴别经验,主观性较强,未能实现鹿茸鉴定的准
确、快速和客观的理想要求。
鹿类药材如鹿血、鹿鞭、鹿筋及鹿茸等的分子鉴
别研究也有不少文献报道[56],但鲜见有关方法学建
立和考察的研究报道。分子鉴别特别是诸如位点特
异性PCR鉴别对实验条件要求非常严格,考虑到实
验的特异性和重复性,很有必要对所建立方法进行
方法学的严格考察和优化。另外,在报道的鹿类药
材分子鉴别文献中,大多存在近源种鹿茸样本偏少
的现象,而常混有鹿血、鹿鞭等药材样本参与分析鉴
别。这似乎与近源种鹿茸样本收集困难或鹿茸
DNA提取尚有一定难度有关。
本文基于鹿茸正品原动物(包括马鹿和梅花
鹿)及其9种近源物种鹿科动物的 Cytb基因全序
列,设计了一对特异引物,通过方法学考察和条件的
优化,建立了较为简便、准确、稳定的鹿茸DNA鉴别
方法,并对6批不同商品规格的鹿茸正品和9种鹿
科鹿属其他鹿科动物的鹿茸进行了PCR扩增鉴别。
1 材料
11 药材 鹿茸药材及其伪品主要来自吉林、大
连、新疆、北京、甘肃、海南、四川以及新西兰等地,样
品均经大连药品检验所陈贷贤研究员鉴定,详见
表1。
12 试剂与仪器 DNA提取试剂盒(上海生工生
物工程有限公司),UNIQ10柱式动物基因组 DNA
抽提试剂盒(SK1205/1206),蛋白酶 K(Proteinase
K):BBI(货号 LJ072581508J),DNATakararTaq聚
合酶(含dNTP及上样缓冲液)。
Takara公司(DR001A),DNAmarker(100~
2000bp):上海生工生物工程有限公司(GM335),
琼脂糖:AgaroseI上海生工生物工程有限公司
(A0710),电泳缓冲液配制试剂 EDTA,Tris为分子
生物 学 级 试 剂,冰 醋 酸 为 分 析 纯;TC3000
(TECHNE)PCR仪,BioRAD公司电泳系统,Sigma
公司 3K15型离心机,AmpGene紫外凝胶成像分
析仪。
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表1 近源种鹿茸样本
No 来源 商品规格 产地 CytbGenbank号
CN1 Cervusnippon 骨片 黑龙江 AB021091~B021093
CN2 Cnippon 纱片 辽宁大连
CN3 Cnippon 纱片 吉林
CE1 Celaphus 粉片 北京 AB021096B021098
CE2 Celaphus 纱片 新疆
CE3 Celaphus 粉片 新西兰
ED Elaphurusdavidianus 粉片 大连 AF423194
CP Cporcinus 纱片 北京 DQ379301
CEL Celdihainarus 粉片 海南 未注册
CU Cunicolor 蜡片 四川 EU882029
RT Rangifertarandus 粉片 吉林 DQ673135
AA Alcesalces 粉片 吉林 AJ000026
DD Damadama 纱片 北京 AJ000022
CA Calbirostris 纱片 四川 AY044863
CT Ctimorensis 纱片 北京 FJ556573
2 方法与结果
2.1 DNA的提取及质量检测
取供试品(鹿茸饮片)适量(约05g),液氮中充
分研磨成粉末,用UNIQ10柱式动物基因组DNA抽
提试剂盒进行鹿茸DNA的提取,具体步骤按试剂盒
说明书进行操作,结果经电泳检测可见有弥散条带
(图 1)。然后以试剂盒提取的 DNA为模板,以
L14724 5′CGAGATCTGAAAAACCATCGTTG3′和
H15149 5′AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTT
GTCCTCA3′作为通用引物[2],PCR反应参数为94
℃ 预变性5min,然后94℃变性30s,54℃复性30s,
72℃延伸1min,共计35个循环,72℃延伸 7min,
对上述各模板进行 PCR扩增,检验模板质量。如各
模板PCR扩增产物在电泳图谱中出现425bp大小的
DNA条带(图1),说明模板质量达到 PCR扩增鉴别
要求,可以进行下游PCR扩增鉴别研究。
A提取的总DNA;B采用通用引物L14724/H15149PCR扩增
后电泳图;1~15CN1,CN2,CN3,CE1,CE2,CE3,ED,CP,
CEL,CU,RT,AA,DD,CA,CT(同表1)。
图1 DNA的提取及质量检测
22 特异性引物的设计
从GenBank下载鹿类中药材的正品原动物梅
花鹿(Cervusnipponkeramae,Cnipponmageshimae,
Cnipponnippon,Cnipponcentralis)(Genbank登陆
号AB021091AB021094)和马鹿(CelaphusCana
densis,Celaphusxanthopygus,Celaphusscoticus,
Celaphuskansuensis)(Genbank登陆号AB021096
AB021098)及表1中所有混伪品原动物的 Cytb基
因全序列 (GenBank登录号依次为 AF423194,
DQ379301, EU882029, DQ673135, AJ000026,
AJ000022,AY044863,FJ556573),经 DNAMAN软件
比对分析后,分析正、混伪品间DNA序列差异,设计
出一对能特异性扩增梅花鹿和马鹿 Cytb基因片段
的位点特异性鉴别引物)PMLF25′GACCTC
CCAGCCCCATCG3′和 PMLR5′GCTGTGGCTATA
ACTGTAAATAGGAGG3′(上海生工合成)。
23 特异性鉴别PCR方法学考察
231 退火温度考察 利用正品药材以及其常见
的混淆品驯鹿退火温度考察。分别设置退火温度为
58,60,62,64,65,68℃进行 PCR,结果58~68℃,
鹿茸正品均能扩增目的条带,而阴性对照均未出现
条带,但是当温度超过65℃时,扩增条带较弱。同
时为防止温度低后其他伪品出现假阳性条带,以及
兼顾不同 PCR的温度误差,最终确定 PCR退火温
度为65℃。
232 DNA模板量考察 对25μLPCR反应体系中
的模板DNA用量进行了考察,分别设置为025μL
(60ng),05μL(120ng),1μL(240ng),结果
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025~1μL均能有效扩增。为防止模板浓度高后抑
制PCR反应及节省模板角度考虑,最终选择25μL
体系中加入05μL模板作为最终浓度。由于适宜
PCR扩增的模板DNA浓度范围较宽,因此,DNA提
取以后可以省去测定浓度和纯度的步骤,直接采用
琼脂糖电泳检测DNA的提取情况。
233 不同 Taq酶用量考察 25μL体系中 Taq
酶分别加005(025U),01μL(05U),013μL
(065U),05μL(25U),结果加 01~013μL
的鉴别结果较理想,而当05μL时,伪品驼鹿出现
了假阳性条带,表明 Taq酶用量不能超过05μL,
考虑到成本及实验结果准确性,终确定25μLPCR
反应体系中Taq酶用量为013μL,即065U。
234 循环次数考察 分别选用30个循环和40
个循环进行考察,结果30个循环和40个循环均能
得到准确鉴别,但30个循环的条带略浅,为防止降
解严重的DNA循环次数少后,条带太弱以至于造成
假阴性的误判,将循环次数确定为40个循环。
235 重复性考察 高特异引物(PLRF/PLRR)
在94℃ 预变性5min,然后94℃ 变性30s,65℃
复性30s,72℃ 延伸1min共计40个循环,最后72
℃延伸 7min的PCR反应条件下,选用普通的 rTaq
酶,25μL的 PCR反应体系就能将正品鹿茸(马鹿
和梅花鹿)与其他鹿科动物的混淆品鉴别开来,经
多次重复,其重复性良好,达到推广使用的标准。
236 PCR方法的建立 在上述方法学考察的基础
上,最终确立的鹿茸位点特异 PCR鉴别方法。其中
PCR反应体系为:在200μLPCR反应管中依次加
入10×PCR缓冲液25μL,dNTP(25mmol·L-1)
2μL,引物(10μmol·L-1)05μL,rTaqDNA聚合
酶(5U·μL-1)013μL,模板05μL(约100ng),
无菌双蒸水19μL。根据待测样品的数量配制n+1
管的上述混合溶液,然后进行分装。PCR反应参数
为:94℃ 预变性5min,然后94℃ 变性30s,65℃
复性30s,72℃ 延伸1min共计40个循环,最后72
℃延伸7min。实验中设置无模板DNA的空白对照
以及阴性对照和阳性对照。
24 11种鹿茸药材的特异性PCR鉴别结果
采用上述优化后的体系和条件,对6种不同批
次的正品鹿茸(马鹿和梅花鹿)和9种近源种鹿茸
进行PCR扩增鉴别,结果正品梅花鹿、马鹿和阳性
对照均扩增出约323bp大小的 DNA条带,经测序
验证结果表明,阳性DNA条带确实系马鹿和梅花鹿
的Cytb基因序列片段。该结果表明该方法特异较
高,能准确的鉴别正品鹿茸(花鹿茸和马鹿茸),见
图2。同源性聚类分析结果见图3。
1~3CN1,CN2,CN3;4~6CE1,CE2,CE3;7空白对照;
8阳性对照;10~17近源种鹿茸样本 ED,CP,CEL,CU,RT,
AA,DD,CA,CT;M2000bpDNA相对标准分子质量。
图2 鹿茸药材PCR鉴别
编号CN1~AA样本与表1相一致。
图3 同源性聚类分析
3 结论与讨论
鹿茸鉴别的瓶颈和难点是正品鹿茸饮片与近源
种鹿茸混用品的鉴别。因此,建立一种简便特异的
鹿茸药材分子鉴别方法具重要的现实意义。
研究结果表明,本方法具有较高的特异性、重复
性,能准确将正品鹿茸与同科同属的其他鹿茸鉴别
开来,经可广泛应用于鹿类药材的鉴别。
对药典规定的正品茸原动物梅花鹿和马鹿以及
其他9种鹿科鹿属近源种的 Cytb基因全序列进行
了比对分析发现,不同产地梅花鹿种内同源性达
99%以上,马鹿种内同源性为97%以上;种间同源
性分析发现,11种鹿科动物中,马鹿和梅花鹿种间
的同源性最高,达95%以上,而与其他鹿鹿科动物
相比,同源性相对较低。同源性聚类分析表明,梅花
鹿和马鹿聚为一类,与其他同源性相对较低鹿科动
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物处于不同的分支。这表明处于同一聚类分支内的
梅花鹿和马鹿(正品)Cytb基因间变的异较小,较为
保守,而与其他分支的近源种比较,Cytb基因间变
异较大,保守性较低,与文献报道一致。鹿科动物
Cytb基因的这一特点为设计能同时将梅花鹿和马
鹿茸与伪品相鉴别开的特异引物(PLRF/PLRR)
奠定了理论基础。
理论上,所设计的特异引物特别是3′端与正品
鹿马鹿和梅花鹿的Cytb基因序列严格互补配对,而
与其他混用品鹿的不配对或配对不严谨。因此,在
高严谨 PCR条件下,仅配对严谨的正品鹿茸 DNA
模板能扩增出阳性DNA条带,而其他鹿科动物或作
假鹿茸饮片则出现阴性扩增。但在实验过程中,由
于鹿茸类药材本身骨质化和角质化以及加工炮制和
储存时间等因素均会对DNA造成不同程度的降解,
这有可能会造成鹿茸正品的假阴性扩增。因此,在
进行DNA提取时,需尽可能的获取较完整的基因组
DNA;另外,在进行特异引物PCR扩增之前,运用通
用引物L14724/H15149对提取的DNA模板进行扩
增检测,以检验模板DNA质量是否符合下游操作要
求,如能扩增出约425bp的DNA条带,证明模板质
量符合位点特PCR扩增要求。
影响位点特异PCR扩增的因素很多,比如在退
火温度参数考察过程中,发现58~68℃,鹿茸正品
均能扩增目的条带,但是当温度超过65℃时,扩增
条带较弱,从特异性上来考虑,68℃特异性相对较
高,但需兼顾重复性和稳定性考虑,因此选用65℃
作为PCR扩增的最佳退火温度。
鉴于DNA作为遗传信息的直接载体,不受外界
因素和生物个体发育及器官差异的影响,每个生物个
体不同器官的任一细胞均含有相同的遗传信息,因此
从理论上来说,只要满足DNA质量要求,所建立的方
法还适用与鹿相关的其他任何细胞组织包括鹿角、鹿
胎、鹿鞭等的鉴别。另外,由于分子鉴别是基于DNA
遗传信息的定性鉴别,仅能解决药材的“真、伪”问
题,而对与鹿类药材“优、劣”的判别还需结合性状鉴
定和显微观察等方法综合进行综合分析。
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鹿和梅花鹿的PCR鉴定[J]中草药,2006,37(10):1566
EstablishmentofalelespecificdiagnosticPCRmethodfor
identificationofantlers
WANGXueyong1,LIUChunsheng1,ZHANGRong1,HUANGLuqi2,CUIGuanghong2
(1ColegeofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;
2InstituteofChineseMeteriaMedica,ChinaAcademyofChineseSciences,Beijing100700China)
[Abstract] Objective:Toestablishaconvenient,quickandaccuratemolecularmethodfortheidentificationofcrudedrugsof
antlersduetothedificultdiscriminationbetweenthegenuineantleranditsadulterantsMethod:Accordingtothealignmentanalysis
offullengthsequencesofCytbgenefromcloselyrelatespeciesofCervus,onepairofalelespecificdiagnosticPCRprimerswasde
signedFactorssuchasannealingtemperature,dosageofpolymerase,timesofcyclesanddosageoftemplateDNAthatinfluencethe
PCRresultswerealsoinvestigatedResult:Basedonthestudymentionedabove,about323bppositivebandwasamplifiedunderthe
annealingtemperatureof65℃ inthetotalvolumeof25μLPCRreactionusingthegenuineantlerDNAasthetemplateSequencing
resultsprovedthatthepositivebandwasthefragmentofCytbgenefrombothCelaphusLinnaeusandCnipponTemminckConclu
sion:Theestablishedmethod,withhigherspecificityandreproducibility,couldaccuratelydiferentiategenuineantlerfromitsadulter
antsandwouldbewidelyusedinCervusrelatedChinesecrudedrugs′identification
[Keywords] AlelespecificdiagnosticPCR;antlersfromcloselyrelatespeciesofCervus;identification
[责任编辑 吕冬梅]
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