全 文 ：料) , 1993 (3) : 262291
[ 13 ]　Reddy D M , Sakhare R S, Kam ble T C1 Co rrelation and
path analysis in safflow er [J ]1 N ew A g ric, 1992, 3 (2) : 2092
2121
[ 14 ]　Patil H P1 Yield componen t analysis in safflow er (Cartham us
tinctorius L. ) [J ]1 A nna ls A g ric R es, 1997, 18 ( 3) : 3322
3361
[ 15 ]　Pandya N K, Gup ta S C, N agda A K1 Path analysis of som e
yield con tribu ting traits in safflow er [J ]1 C rop R es H isar,
1996, 11 (3) : 31323181
[ 16 ]　Patil B R , D eshm ukh S G, D eshm ukh M P1 Studies on co r2
relation and path analysis in safflow er [J ]1 A nna ls P lan t
P hy siol, 1990, 4 (1) : 862911
[ 17 ]　M alleshappa C, Goud J V , Patil S S1 Path analysis fo r seed
yield in safflow er [J ]1 J M aharash tra A g ric U n iv , 1989, 14
(2) : 23122321
[ 18 ]　M athur J R , T ikka S B S, Sharm a R K, et a l. Genetic vari2
ab ility and path coefficien t analysis of yield componen ts in
safflow er [J ]1 Ind ian J H ered ity , 1976, 8: 3241
[ 19 ]　Kubsad V S, D esai S A , M allapur C P1 Path coefficien t
analysis in safflow er [J ]1 J M aharash tra A g ric U n iv , 2001,
25 (3) : 32123221
[ 20 ]　T hom bre M V , Jo sh i B P1 Co rrelation and path analysis in
safflow er (Cartham us tinctorius L. ) varieties [J ]1 J M aha2
rash tra A g ric U n iv , 1981, 6 (3) : 19121931
[ 21 ]　Patil H S1 Genetic variab ility, association and path analysis
in safflow er [J ]1 Ind ian J A g ric R es, 1998, 32 (1) : 462501
[ 22 ]　Yan Z S, W ang R Q , Feng J F, et a l. Path2analysis of char2
acters related to yield per p lan t in m ulch ing safflow er [J ]1
Ch in J O il C rop S ci (中国油料作物学报) , 2004, 26 (2) : 352
381
[ 23 ]　L u X P, L i X W , M i F G, et a l. T he genetic po ten tial and
genetic co rrelation of p rincipal econom ic characters of saf2
flow er [J ]1 J Inner M ong olia Inst A g ric A n im a l H usban (内
蒙古农牧学院学报) , 1996, 17 (3) : 672701
[ 24 ]　N ie Z, Sh i X C, Chen P T , et a l. A study on the hereditab il2
ity genetic advance and genetic co rrelation of m ain agronom ic
characters in safflow er [J ]1 O il C rop s Ch ina (中国油料) ,
1987 (2) : 182221
[ 25 ]　L u X P, LüX L , Zhang Z, et a l. M ulti2genetic analysis of
quan titative characters in safflow er [J ]1 Ch in J O il C rop S ci
(中国油料作物学报) , 2004, 26 (2) : 392421
[ 26 ]　L u X P, Sun X X, L i X W 1 E stim ation of stab ility param e2
ters fo r safflow er varieties [J ]1 J Inner M ong olia Inst A g ric
A n im a l H usban (内蒙古农牧学院学报) , 1996, 17 (2) : 252
291
[ 27 ]　T ang Q Y, Feng M G1 D PS D ata P rocessing S y stem f or
P ractica l S ta tistics (实用统计分析及其D PS 数据处理系统)
[M ]1 Beijing: Science P ress, 20021
[ 28 ]　N ie Z, Chen F T , Sh i X C1 Study on the slection indices of
yield of flow er per p lan t in safflow er [J ]1 H ered itas (遗传) ,
1992, 14 (5) : 342361
[ 29 ]　Fu S Q , Xu X L , L iL Y1 Comparison on the chem ical cons2
t ituen ts of Chuanhonghua2É w ith J ianyang Honghua [J ]1
Ch ina J Ch in M ater M ed (中国中药杂志) , 1996, 21 (2) : 782
791
霍山石斛及相似种的位点特异性 PCR 鉴别
刘石泉2, 1, 李小军2, 余庆波2, 周根余2Ξ
(11 湖南城市学院 化学与环境工程系, 湖南 益阳　413000; 21 上海师范大学生命与环境科学学院
生物系遗传学实验室, 上海　200234)
摘　要: 目的　设计出霍山石斛的位点特异性鉴别引物, 仅通过 PCR 就能对霍山石斛的真伪进行准确鉴别。方法
利用石斛属植物基因库中 rDNA IT S 序列数据库进行同源性比较, 在与霍山石斛差异较大的区段设计 1 对特异性
引物, 然后对 19 份石斛属植物DNA 模板进行 PCR 扩增, 阳性者即为霍山石斛正品。结果　发现在退火温度为 60
℃ 时, 该引物能把霍山石斛的模板从 19 份石斛属植物中扩增出来, 而其他的石斛属植物均为阴性。结论　运用位
点特异性鉴别引物成功地对霍山石斛进行 PCR 鉴别, 该鉴别反应重现性好, 能在霍山石斛鉴别时发挥重要的作
用, 与形态学、DNA 测序等鉴别方法相比, 该方法具有高效、准确、简便、省时等优点。
关键词: 霍山石斛; 位点特异性 PCR; 鉴别
中图分类号: R 282121　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2006) 01 0111 05
A llele- spec if ic d iagnostic PCR authen tica tion of D end robium huoshanense
and its a ll ied spec ies of D end robium Sw.
L IU Sh i2quan2, 1, L I X iao2jun2, YU Q ing2bo 2, ZHOU Gen2yu2
(11D epartm ent of Chem istry and Environm ent Engineering, H unan C ity U niversity, Y iyang 413000, Ch ina;
2. Genetics L abo rato ry, D epartm ent of B io logy, Co llege of L ife and Environm ent Science,
ShanghaiN o rm al U niversity, Shanghai 200234, Ch ina)
Abstract: Objective　To design a pair of a llele2specif ic d iagno st ic p rim er fo r au then t ica t ing D end robi2
·111·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005205210
基金项目: 上海市高等学校科学技术发展基金项目 (03D Z02)
作者简介: 刘石泉 (1969—) , 男, 湖南益阳人, 讲师, 硕士, 研究方向为植物组织培养及分子检测。E2m ail: lsq205@ tom. com3 通讯作者　周根余　Tel: (021) 64323698　E2m ail: zhougenyu@ sina. com
um huoshanense from o ther species of D end robium Sw. on ly by PCR. M ethods　Based on rDNA IT S se2
quences database of D . huoshanense and o ther species of D end robium Sw. , an allele2specif ic d iagno st ic
p rim er pairs w as designed. D iagno st ic PCR s w ere perfo rm ed u sing the p rim er w ith the to ta l DNA s of 19
o rig inal p lan ts from D end robium Sw. as temp la tes. T he po sit ive w as the genu ine. Results　W hen the
annealing temperatu re w as ra ised to 60 ℃, the temp la te DNA of D . huoshanense cou ld be amp lif ied w here2
as the diagno st ic PCR of the rest species w ere all negat ive. Conclusion　T he diagno st ic PCR s can au then t i2
cate D. huoshanense from o ther species of D end robium Sw. eff icien t ly. Compared to the au then t ica t ion
m ethod by sequencing DNA fragm en ts and mo rpho logica l t ra its etc. , the allele2specif ic d iagno st ic PCR is
no t on ly simp le w ith t im e2saving bu t a lso p ract ica l and effect ive.
Key words: D end robium huoshanense C. Z. T ang et S. J. Cheng; a llele2specif ic d iagno st ic PCR;
au then t ica t ion
　　石斛作为传统贵重的中药材, 早在《神农本草
经》中就有记载, 有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等
功效[1 ]。霍山石斛 D end robium huoshanense C. Z.
T ang et S. J. Cheng 又名米斛, 兰科石斛属植物,
原产安徽霍山, 是药用石斛中的极品。由于石斛是一
种附生植物, 对生态环境要求比较严格, 自然繁殖频
率极低 (< 5% ) , 加上长期采集, 野生植株已濒临灭
绝。我国现有的 76 种石斛属植物中, 作药用的就有
40 多种。其药理作用主要是强阴益精、补肾益力、明
目和延年益寿。霍山石斛因其质量上乘而驰名中外,
多年来市场上霍山石斛有名无实, 有价无市, 资源接
近枯竭。现在国内外市场上, 凡冠以“霍山石斛”“霍
斗”或“野生金霍斛”等名称的一些枫斗产品, 均非真
正的霍山石斛加工而成[2 ] , 再加上目前尚无快速、准
确的霍山石斛鉴别方法, 其伪品产量日益增大, 市场
极度混乱, 目前市场上常用的假冒霍山石斛主要有
石斛 D. nobile L indl. 、铁皮石斛 D. of f icina le
K im u ra et M igo、细茎石斛 D . m on ilif orm e (L. )
Sw eet. 、黄花石斛 D . tosaense M ak ino、矮石斛 D .
bella tu lum Ro lfe、重唇石斛 D. hercog lossum R e2
ichb. f. 、美花石斛 D. lod d ig esii Ro lfe、细叶石斛
D . hancock ii Ro lfe、曲茎石斛 D. f lex icau le Z. H.
T si, S. C. Sun et L. G. Xu、广东石斛D. w ilson ii
Ro lfe、罗河石斛 D . lohohense T. T ang et F. T.
W ang、河南石斛 D . henanense J. L. L u et L. X.
Gao 等[2 ]。笔者已亲自实地考察了霍山县长冲乡种
植的霍山石斛, 发现已有混杂。本实验试图在传统的
形态标记、生化标记、组织细胞标记等这些以基因间
接产物作为鉴别依据之外发展一种准确、迅速、简捷
的霍山石斛鉴定方法, 利用石斛属植物基因库中
rDNA IT S 序列数据库进行同源性比较, 在与霍山
石斛差异较大的区段设计位点特异性引物, 然后对
19 种石斛属植物 DNA 模板进行 PCR 扩增, 阳性
者即为霍山石斛正品。仅通过 PCR 就能对霍山石
斛的真伪进行准确鉴别, 以期能在霍山石斛鉴别时
发挥重要的作用。
1　材料与来源
　　实验所用的材料来自于云南、安徽、浙江、河南、
台湾等产区, 其中 7 种由上海职工医院生药学教授
顺庆生于 2004 年 3 月和 8 月提供, 8 种材料 2002
年 12 月亲自采于霍山县长冲乡, 其余材料由云南西
南大地苗艺有限公司张申洪总经理于 2004 年 4 月
采回, 共计 19 份 (表 1)。1～ 15 由上海职工医院生药
学教授顺庆生鉴定; 16～ 19 由上海师范大学植物分
类学教授胡世福鉴定。所有材料均取新鲜单株叶片
分别于 - 70 ℃ 保存。
引物由生工公司合成, 引物顺序为: H SSH 2F 5′
A TAAA T GGGT T TCGT GGGA , H SSH 2R 5′CA 2
A CGCA T GAA T T GGGA TC; P125′A CGAA T TC2
A T GGTCCGGT GAA GT GT TCG, P225′TA GAA 2
T TCCCCGGT TCGCTCGCCGT TA C; T aq 酶购自
生工公司。PCR 仪为美国M J 公司 PTC—100TM。
2　方法
211　DNA 的提取: 单株分别提取 DNA , 参见彭锐
方法[3 ] , 略加改进, 沉淀干燥, 加入 30 ΛL T E 溶解,
- 20 ℃ 保存备用。用分光光度计测得其DNA 质量
浓度为 50 ngöΛL。
212　位点特异性引物的设计: 在设计鉴别性 PCR
引物前, 对霍山石斛和常见 12 种霍山石斛伪品的
IT S 序列用V ecto r Ê 软件进行对位排列比较, 在与
霍山石斛差异较大的区段设计了 1 对位点特异性引
物 (图 1 ) , 其碱基顺序为: HH S2F 5′2A TAAA 2
T GGGT T TCGT GGGA 3′; H SSH 2R 5′2CAA CG2
CA T GAA T T GGGA TC3′; PCR 产物理论长度为
432 bp , 包括部分 IT S1 和 IT S2 序列及全部 518 S
序列, 设计引物时主要选择 IT S 序列中与其他石斛
·211· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
表 1　石斛样品来源
Table 1　Or ig in of samples from D end robium Sw.
编号 材料名称 采集日期 采集地点
1 H 1 霍山石斛D end robium huoshanense 2002212211 安徽霍山
2 H 9 霍山石斛 2002212211 安徽霍山
3 H 10 霍山石斛 2002212211 安徽霍山
4 H 14 霍山石斛 2002212211 安徽霍山
5 H 13 霍山石斛 2002212211 安徽霍山
6 霍山石斛 2004203216 安徽霍山
7 T 001 铁皮石斛D. of f icina le 2004203216 安徽霍山
8 T 002 铁皮石斛 2002212211 安徽霍山
9 T 31 铁皮石斛 2002212211 安徽霍山
10 铁皮石斛 2004203216 云南思茅
11 河南石斛D. henanense 2004203216 河南南台
12 黄花石斛D. tosaense 2004203216 台湾台南
13 细茎石斛D. m onilif orm e 2004208229 浙江乐沽
14 曲茎石斛D. f lex icau le 2004208229 河南西峡
15 齿瓣石斛D. d evon ianum 2004208229 云南瑞丽
16 石斛D. nobile 2004204228 云南瑞丽
17 鼓槌石斛D. ch ry sotox um 2004204228 云南瑞丽
18 翅萼石斛D. carin if erum 2004204228 云南瑞丽
19 密花石斛D. d ensif lorum 2004204228 云南瑞丽
　　1～ 5, 7～ 9: 材料分别来自于不同蒴果的实验室组培苗
　　1—5, 7—9: tissue cu ltu re p lan tlet in labo rato ry from differen t
cap su les
引物 P1、P2 和 H SSH 2R、H SSH 2F 分别扩增 IT S 区和霍山石斛
的特定区
P rim ers P1, P2; H SSH 2R , H SSH 2F are used to amp lify w ho le
IT S region and special sequence of D. huoshanense
图 1　ITS 区引物结构示意图
F ig. 1　Structure of whole ITS reg ion
材料差异较大的区域。
213　石斛属植物模板 DNA 鉴定 PCR 的扩增: 根
据 Emm anuel 等[4 ]对兰科植物 IT S 区的研究, 运用
1 对石斛属植物 IT S 区的扩增引物 P1 (位于 18 S
上)、P2 (位于 26 S 上) , PCR 反应在 30 ΛL 反应体
系中进行, 含 ddH 2O 1913 ΛL , 缓冲液 3 ΛL ,M g2+
( 215 mmo löL ) 3 ΛL , dN T P ( 100 Λmo löL ) 1. 2ΛL , 引物 (0. 6 Λmo löL ) 2. 4 ΛL , 模板 DNA 1 ΛL ,
T aq 酶 (5 U öΛL ) 011 ΛL。程序: 94 ℃ 预变性 3
m in, 94 ℃ 变性 50 s, 54 ℃ 复性 1 m in, 72 ℃ 延伸
2 m in, 循环 30 次; 最后 72 ℃ 延伸 5 m in。用 115%
琼脂糖、3 V öcm 电压、回流冷却电泳槽凝胶电泳分
离 PCR 产物, 用天龙科技有限公司 G IS22008 凝胶
成像仪成像。
214　霍山石斛鉴别性 PCR 的扩增: 将 213 中引物
P1 和 P2 换成 H SSH 2R 和 H SSH 2F, 复性温度提高
到 60 ℃, 其他条件相同。
3　结果
311　石斛属植物模板 DNA 鉴定 PCR: 从图 2 看
出, 19 个 DNA 模板均能扩增出预期的 660 bp 条
带, 该检测证明所有DNA 模板的质量均没有问题,
可以进行下一步的霍山石斛鉴别性 PCR 反应。
312　霍山石斛鉴别性 PCR 的扩增: 当复性温度提
高到 60 ℃ 时 (图 3) , 发现只有 1～ 6 号能扩增出
432 bp 条带, 其余模板没有条带, 证明该鉴别反应
具有极强的特异性。
02空白对照　1～ 192石斛材料
M 2M arker (条带位于 800～ 600 bp)
02nagetive con tro l　1- 192co rresponding to code num bers
in T ab le 1　M 2DNA M arker (band betw een 600—800 bp)
图 2　用 P1 和 P2 鉴定石斛属模板 D NA
F ig. 2　Template authen tication of D end robium Sw.
with P1 and P2
02空白对照　1～ 52组培霍山石斛　62野生霍山石斛　7～ 192其
他石斛材料　M 2M arker (特异性条带大小为 432 bp)
02nagetive con tro l　1- 52t issues cu ltu re of D. huoshanense
62w ild D. huoshanense　7- 192o ther D end robium species
M 2M arker ( special band is 432 bp)
图 3　霍山石斛位点特异性 PCR
F ig. 3　A llele- spec if ic d iagnostic PCR authen tication
of D. huoshanense
4　讨论
　　近年来, 随机扩增多态性 DNA (RA PD )、任意
引物 PCR (A P2PCR )、限制性片段长度多态
(R FL P) 等分子标记技术以及DNA 序列的直接测
定检验 (如植物叶绿体基因组的 rbcL、m atK、rpcL ,
核基因组的 rRNA、IT S 等) 不断应用于中药材的
鉴别。由于 RA PD、A P2PCR、R FL P 等方法对模板
DNA 及 PCR 条件的要求较高, 往往导致实验结果
不稳定, 从而影响了鉴定的准确性。目前虽然已经对
一些中药材进行了 DNA 的序列鉴定, 但大多数药
检部门尚不具备 DNA 测序的条件, 因此, 利用
DNA 序列分析方法鉴别药材的实用性受到限制。
自D eSalle 等[5 ] 1996 年在 N atu re 上发表了利用人
·311·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
工设计的引物鉴别鱼子酱中鱼卵所属鲟鱼的种类
后, 鉴别 PCR 在全世界得到推广和应用。国内学者
对石斛药材的分类和鉴定作了大量研究, 对石斛的
分类研究在形态解剖、生理性状等方面研究较多, 但
利用 DNA 特异性进行分类和鉴定较少, 尽管已经
取得一定程度的进展, 如齿瓣石斛 [6 ] , 枫斗类石
斛[7 ] , F 型、H 型石斛, 束花石斛, 曲茎石斛[8 ] , 铁皮
石斛, 黄草石斛[9 ]等的 IT S 的 DNA 序列特异性方
面取得了较好的效果, 以及利用DNA 的 IT S 的特
异性做成的基因芯片[10 ] , 在石斛属的鉴别方面也取
得了一定程度的进展, 但还只是处在起步阶段, 运用
于普通实验室更加困难, 真正应用于市场还有待进
一步开发。目前, 霍山石斛仅得到了 IT S 序列, 就其
DNA 分子特异性鉴别还未有人涉及过。
对于石斛属植物来说, 选择哪段DNA 区域进
行测序继而进行鉴别性引物的设计非常重要, 实验
和文献检索表明, rDNA IT S 区域较为合适。近年来
植物体内归属于核基因组的 rDNA 基因被广泛运
用于植物系统发育研究, 与 cpDNA 相比 rDNA 的
进化速率较快, 且不存在 cpDNA 的母系单项遗传,
更能反映种间差别和物种进化。 IT S 是由被 518 S
rRNA 分割的 IT S1、IT S2 两个片段组成, 其转录产
物在 rRNA 加工过程中被切掉, 它在 rRNA 成熟过
程中具有重要作用, IT S 片段进化速率较快, 可以用
于研究高等植物广泛存在的杂交和多倍化现象。
IT S 是高度重复的串联序列单位, 具位点内或位点
间的协同进化。被子植物的 IT S 区长度较为稳定,
总长度约为 600～ 700 bp , 易于测序。IT S 序列有一
定程度的变异。因此 IT S 适用于科以下, 特别是属、
组、种的亲缘关系与分类鉴别研究。运用 IT S 序列
大多数进行分子系统学的研究, 很少涉及到石斛属
植物的鉴定。文献资料证明石斛属植物的 rDNA
IT S 序列长度为 635～ 638 bp , IT S1 为 228～ 233
bp , IT S2 为 240～ 247 bp , 518 S 长度为 163 bp , 种
间的差异百分率 (碱基替换率) IT S1 为 11179%～
31158% , 平 均 为 20147% ; IT S2 为 10129%～
25130% , 平均为 17167% , 说明石斛属种间 IT S 存
在极其显著的差异[4, 9 ]。rDNA IT S 序列可以用于石
斛种间的鉴别, 仅以石斛中 IT S 为例, 利用它进行
种群的分类、鉴定等就有大量的报道[6, 9 ]。
因此笔者认为当石斛属植物或药材的形态特征
难以鉴别时, rDNA IT S 区间碱基序列特征是可靠
的分子鉴别标记。本研究首次运用位点特异性鉴别
引物成功地对霍山石斛进行了 PCR 鉴别, 在选择
霍山石斛位点特异性 PCR 引物的设计中, 用
C lu sta l X 及M EGA 软件进行对位排列比较, 结合
V ecto r Ê 软件, 比较了市场上常见的霍山石斛 12
种伪品的 rDNA IT S 序列, 采用了石斛属种间差异
明显又稳定的 IT S1 和 IT S2 区域设计了 1 对特异
性鉴别引物, 实验证明只须进行 PCR 实验即可完
成对霍山石斛的鉴别。
笔者在对霍山石斛的位点特异性 PCR 鉴别中
发现在较低的退火温度下 (58 ℃) , 部分非霍山石斛
样品也能扩增出相应的 432 bp 条带, 主要是同源性
比较高的细茎石斛、河南石斛, 但随着退火温度的升
高 (60 ℃ 甚至 62 ℃) , 只有霍山石斛能扩增出相应
条带, 其他石斛均为阴性。重复实验得到相同的实验
结果, 说明该鉴别引物已具有较强的特异性, 且鉴别
效果稳定。由于特异性扩增出的片段仅为 432 bp ,
同时 IT S 区域又为多拷贝重复区域, 因此位点特异
性 PCR 鉴别在药材DNA 降解非常严重的情况下,
实验证明还能达到非常好的鉴别效果, 能有效地将
霍山石斛从其他石斛属植物中鉴别出来。该鉴别方
法具有成本小、时间短、效率高等特点, 避免了贵重
植物用品的损耗。即使从植物标本上直接取样也不会
造成标本的整体破坏, 所需模板DNA 的量较少, 且
在有外源DNA 污染的情况下也不会影响检测结果。
传统中药鉴别一般根据药材形态、组织、粉末特
征、理化性质等进行鉴别, 本研究则首次直接根据药
材的遗传本质 rDNA IT S 的多态特征, 根据霍山石
斛特有的 rDNA 片段设计引物进行 PCR 鉴别, 因
而是一种准确、迅速、简捷的霍山石斛鉴别方法。
References:
[ 1 ]　Ch P (中国药典) [S ]1 V o l É . 20001
[ 2 ]　Bao S X, Shun Q S, Zhou G Y, et a l. A F am ous M ed icina l
P lan t H oushan S h ihu (D. huoshanense) in Ch ina (中华仙草
之最——霍山石斛) [M ]1 Shanghai: Shanghai Scien tific and
T echn ical Pub lishers, 20031
[ 3 ]　Peng R , Song H Y, L iQ S, et a l. Ex traction and characteri2
zation of to tal DNA from D end robium [J ]1 Ch ina J Ch in
M ater M ed (中国中药杂志) , 2003, 28 (12) : 1129211311
[ 4 ]　Douzery E J P, P ridgeon A M , Ko res P, et a l. M o lecu lar
phytogen tics of disease (O rch idaceae) : a con tribu tion from
nucler ribo som al IT S sequence [J ]1 A m J B ot, 1999, 86:
88728991
[ 5 ]　D eSalle R , B ristein V J1 PCR Iden tification of the b lack
cav ia r [J ]1 N atu re, 1996, 381: 19721981
[ 6 ]　D ing X Y, Xu L S, W ang Z T , et a l. A llele2specific ding2
no stic PCR authen tication of D. d evon ianum from o ther D en2
d robium species [J ]1 A cta P harm S in (药学学报) , 2002, 37
(2) : 89729011
[ 7 ]　D ing X Y, W ang Z T , Xu H , et a l. D atabase estab lishm ent
of the w ho le rDNA IT S region of D end robium species of
·411· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
“FEN GDOU ”and au then tication of D end robium f lex icau le
from IT S allied species of D end robium Sw. [J ]1 A cta P ha rm
S in (药学学报) , 2002, 37 (7) : 56725731
[ 8 ]　D ing X Y, Xu L S, Xu H , et a l. M o rpho logical and DNA
mo lecu lar evidence fo r au then tication of D end robium f lex i2
cau le from IT S allied of D end robium Sw. [J ]1 A cta P ha rm
S in (药学学报) , 2001, 36 (11) : 86828731 [ 9 ]　Xu H , L i X B, D ing X Y, et a l. rDNA IT S sequence of H erbD end robii (HUAN GCAO ) [J ]1 A cta P harm S in (药学学报) , 2001, 36 (10) : 77727831[ 10 ]　Zhang Y B, W ang J , W ang Z T , et a l. DNA M icroarray fo riden tification of the herb of dendrob ium species from Ch inesem edicinal fo rm ulations [J ]1 P lan ta M ed , 2003, 69 ( 12 ) :1172211741
不同薯蓣皂苷元的盾叶薯蓣遗传关系的 RAPD 分析
薛　焱, 秦天才Ξ , 张友德
(华中农业大学生命科学与技术学院, 湖北 武汉　430070)
摘　要: 目的　从DNA 水平分析鉴定不同薯蓣皂苷元盾叶薯蓣的遗传关系。方法　从 40 个 10 bp 随机引物中筛
选出 12 个引物, 进行 RA PD 分析, 应用 PO PGEN E 1131 软件对扩增结果进行聚类分析。结果　共扩增出 73 条
DNA 片段, 其中多态性片段 64 条, 占 87167% , 盾叶薯蓣类型间具有明显的多态性差异。结论　DNA 分子多样性
差异与薯蓣皂苷元量差异具有相关性, 说明盾叶薯蓣的遗传基础可能对薯蓣皂苷元的形成和积累有显著的影响。
关键词: 盾叶薯蓣; 遗传关系; RA PD
中图分类号: R 282171013　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2006) 01 0115 04
RAPD Ana lysis of genetic rela tion sh ip am ong D ioscorea z ing iberens is
w ith d ifferen t d iosgen in
XU E Yan, Q IN T ian2cai, ZHAN G You2de
(Co llege of L ife Science and T echno logy, H uazhong A gricu ltu ral U niversity, W uhan 430070, Ch ina)
Abstract: Objective　To study the genet ic rela t ion sh ip among D ioscorea z ing iberensis w ith differen t
d io sgen in con ten t a t DNA level. M ethods　DNA of all types w as amp lif ied by 12 random p rim ers from 40
random p rim ers, the po lymo rph ic bands of RA PD w ere coun ted. A nd the resu lts of types w ere analysed by
PO PGEN E 1. 31 (Too l fo r Popu la t ion Genet ic A nalysis 1. 31) softw are. Results　A to ta l of 73 bands w as
ob ta ined, 64 of to ta l bands (87. 67% ) w as po lymo rph ic. T he resu lts ind ica ted that there w ere apparen t
and abundan t genet ic varia t ion s in D . z ing iberensis. Conclusion　T he fo rm at ion and accum u lat ion of d io s2
gen in cou ld be affected sign if ican t ly by the genet ic basis of D . z ing iberensis.
Key words: D ioscorea z ing iberensis C. H. W righ t; genet ic rela t ion sh ip; RA PD
　 　 盾 叶 薯 蓣 D ioscorea z ing iberensis C. H.
W righ t 俗称黄姜, 为多年生缠绕草质藤本植物, 隶
属于薯蓣科薯蓣属根状茎组, 为我国特有种。该属植
物的根状茎中含有丰富的薯蓣皂苷元 (d io sgen in) ,
是重要的甾体激素类药源植物, 盾叶薯蓣由于其含
薯蓣皂苷元量高, 为我国主要药源植物, 也是世界上
单株薯蓣皂苷元量最高的薯蓣种[1 ]。目前盾叶薯蓣
各品种薯蓣皂苷元差别很大, 各类型间除生物学特
性等差异外, 迄今在遗传背景、亲缘关系及基因组
DNA 上的差异研究报道较少。DNA 分子水平上的
多态性检测技术是进行基因组 DNA 研究的基础。
W illiam s 和W elsh 1990 年几乎同时建立的随机扩
增多态性 DNA ( random amp lif ied po lymo rph ic
DNA , RA PD ) 分析技术, 以其高效、快速、简便的
特点, 用于药用植物研究, 从方法上更显示独到的优
势, 它能够通过不同引物直接给出整个基因组的多
态性信息, 避免了生长环境和发育时期不同的影响;
并从 DNA 水平上对分类群比较分析, 确定药用植
物种、类型间的亲缘关系, 构建树状聚类图[2 ]。本研
究利用该技术对不同薯蓣皂苷元量的盾叶薯蓣类型
·511·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005204225
基金项目: 国家自然科学基金资助 (30170098)
作者简介: 薛　焱 (1974—) , 女, 内蒙人, 硕士阶段从事资源植物方面的研究, 现为内蒙古大学生命科学院 2005 级博士研究生, 研究方向为植物发育生物学。
Tel: 13704781063　E2m ail: xyxy2172@163. com3 通讯作者　秦天才　Tel: (027) 87281305　E2m ail: qtc@m ail. hzau. edu. cn