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黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠尿蛋白的影响



全 文 :杂证,虚为脾虚血亏,实为湿热留恋,肠络瘀阻。
《景岳全书·泄泻》曰:“泄泻之本,无不由于脾胃
……脾胃受伤,则水反为湿,谷反为滞,而泻痢作
矣。”脾虚失运可造成湿盛,湿盛又阻碍脾胃运化,
因此脾虚湿胜在发病及病变过程中起重要作用[4],
益气健脾利湿等治法在溃疡性结肠炎特别是恢复期
的治疗中占有重要地位。金元医家刘完素在泻痢治
疗中,先服芍药汤治疗湿热毒邪郁蒸肠道而致的下
痢,泻痢已除后服白术黄芪汤健脾利湿,益气补中,
体现了“泄泻之本,无不由脾胃”的中医理论。
TNBS所致的大鼠溃疡性结肠炎模型,其疾病
演变过程经历了从急性病变阶段逐渐向慢性病变阶
段的改变,与人类溃疡性结肠炎的病变过程有相似
之处。本实验观察白术黄芪汤有效部位组方对大鼠
溃疡性结肠炎不同病变阶段的药效,以考察其经过
药物提取并改变药物组成比例后,益气健脾的功效
和治疗泻痢恢复期的适应症有否改变。结果表明,
虽然以有效部位组方代替了原方水煎剂,但其益气
健脾的功效和主要用于治疗泻痢恢复期的性质没有
改变。本研究设计了白术黄芪汤有效部位组方对不
同造模时间大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用,实验结
果表明该药对实验早、中期的治疗作用不明显,对实
验后期的治疗效果较好,提示该药不适用于泻痢急
性期,而比较适于泻痢后期,与白术黄芪汤原方设立
的本意较相符。说明白术、黄芪、甘草经有效部位提
取后组方,其益气健脾的功效基本没有改变,其有效
部位在相当程度上可以保留原有的功效和特性。表
明益气健脾中药经过提取、筛选、组方后有科学性和
合理性。
[参考文献]
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[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20061120
[基金项目] 国家自然科学基金委青年科学基金项目(30500671)
[通讯作者] 张丽芬,Tel:13601056119,Email:lifendoc@ya
hoo.com.cn
黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠尿蛋白的影响
张丽芬,杨 敏,赵进喜,吕仁和,王硕仁
(北京中医药大学 东直门医院 肾病内分泌科/中医内科学教育部重点实验室,北京 100700)
  糖尿病肾病是糖尿病的严重微血管并发症之
一,中医药对糖尿病肾病的治疗有独特的优势和治
疗特色。作者前期的研究采用止消通脉宁等中医药
治疗方案辨证治疗糖尿病肾病,在降低糖尿病肾病
患者尿白蛋白,升高血清内生肌酐清除率,降低血清
肌酐等保护肾功能方面有明显的疗效和安全
性[1,2]。黄芪和卫矛是止消通脉宁组方内的2味主
要药物。本研究在前人丰富的文献资料[3]和长期
临床用药经验的基础上,观察黄芪卫矛合剂对糖尿
病肾病大鼠血糖、饮水量、尿量、尿蛋白和血清尿素
氮、肌酐的作用,探索黄芪卫矛合剂的作用机制。
1 材料
1.1 动物 健康SD大鼠65只,SPF/VAF清洁级,
雄性,体重180~220g,由北京维通利华实验动物公
司提供。动物合格证号SCXK(京)20020003。
1.2 药物 黄芪 Astragalusmembranaceus(Fisch.)
Bunge符合《中国药典》2000年版标准,卫矛 Euony
musalatus(Thunb.)Sieb符合北京市药品标准,均
购自北京同仁堂饮片有限责任公司,由北京同仁堂
质量管理部鉴定。黄芪卫矛合剂由本院药理基地制
备。黄芪和卫矛各取等量,黄芪用50%乙醇提取2
次,第1次8倍量、2h,第2次6倍量、2h,滤过。卫
矛提取按最优水平组合以12倍量水,提取3次,每
次15h,滤过。合并二药提取液,水浴浓缩成稠膏
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状,无菌装瓶密封备用。使用时以蒸馏水配成含生
药2g·mL-1的混悬液。
氯沙坦钾片,默沙东制药有限公司,批号
H20000371。使用时以生理盐水配成02%的溶液。
1.3 试剂和仪器 链脲佐菌素(streptozotocin,
STZ),Sigma公司,批号 B69776。PAS染色试剂盒
(PeriodicAcid-SchifReaction),北京天合力恩科
技发展中心。OLYMPUSAU640全自动生化测试
仪,日本OLYMPUS公司。LeicaRM2135病理切片
机、LeicaEG1160病理包埋机、LeicaDM4000B-
DFC300FX数据成像系统,德国Leica公司产品。
2 方法
2.1 模型复制、分组及治疗 大鼠经普通饲料适应
性饲养1周后,随机抽取10只作为假手术组,大鼠
在腹腔麻醉状态下,打开腹腔,剥离左肾脂肪包膜,
关闭腹腔,缝合切口。余55只大鼠行左肾摘除术,
术后 1周尾静脉注射 STZ35mg·kg-1(用 01
mmol·L-1枸橼酸缓冲液,pH42,4℃,配制成2%
STZ溶液 ),72h后,测空腹血糖(FPG)及尿糖,以
FPG≥1665mmol·L-1、尿糖强阳性、尿量大于假
手术组50%者为模型制备成功,按 Mogens分期法,
符合糖尿病肾病模型Ⅲ期[4]。选取造模成功大鼠
45只入选实验,随机分为模型组15只,给予蒸馏水
每日10mL·kg-1灌胃;黄芪卫矛合剂组15只,黄
芪卫矛合剂每日20mL·kg-1灌胃(按成人临床剂
量的20倍计算);氯沙坦组15只,氯沙坦16mg·
kg-1灌胃(按成人临床剂量的20倍计算)。假手术
组术后1周尾静脉注射等体积的缓冲液,给予蒸馏
水每日10mL·kg-1灌胃。均给药12周,给药期间
每组大鼠分笼饲养,随意饮水,食用标准动物饲料。
2.2 标本采集及检测 12周末测大鼠体重、饮水
量,代谢笼收集24h尿液,混匀,测其总量,取出1~
3mL备用,采用比色法测定尿蛋白含量。大鼠禁食
不禁水12h,各组随机选8只经5%戊巴比妥钠麻
醉后,心脏取血,测定大鼠空腹血糖(FBG),血清肌
酐(Cr)和尿素氮(BUN)。剖腹取出剩余右肾,自肾
门处切成两片,10%中性甲醛固定,常规脱水、透明、
石蜡包埋,连续4μm切片,固定于载玻片上,进行
PAS染色,光镜病理检测。
2.3 统计方法 实验数据以 珋x±s表示,用OneWay
ANOVA统计分析,LSD检验作各组间均数两两比较。
3 结果
实验过程中,模型组3只,黄芪卫矛组2只,氯
沙坦组1只大鼠死亡,死亡原因可能因血糖过高所
致。假手术组大鼠体重增加明显,状态良好。各造
模组表现典型的“三多一少”,可见多食、多饮、多
尿、消瘦明显,反应迟缓,毛无光泽,竖毛蜷卧。
3.1 糖尿病肾病肾小球的病理改变 肾脏外观可
见各造模组大鼠肾脏体积增大,皮质增厚而苍白,肾
乳头坏死、脱落。
PAS染色显示出糖尿病导致肾脏损伤的典型病理
改变:肾小球肥大,肾小球基底膜和肾小管基底膜增
厚;肾小球系膜基质增多;肾小球出现无细胞性结节状
硬化(KW结节形成);肾小球毛细血管袢的纤维素样
或类脂样帽状病变;肾小球毛细血管微血管瘤形成;肾
小球入球小动脉和出球小动脉玻璃样变。提示糖尿病
肾病模型成功复制。黄芪卫矛合剂治疗组和氯沙坦治
疗组肾小球损伤较模型组明显减轻。见图1。
图1 用药后各组大鼠肾脏病理改变(PAS,×400)
A.假手术大鼠见正常肾小球结构;B.模型组大鼠肾小球入球小动脉玻璃样变和结节性硬化;C.模型组肾小球结节性硬化,肾小动脉硬
化;D黄芪卫矛合剂组;E氯沙坦组
3.2 对大鼠空腹血糖、饮水量、体重、尿量、24h尿
蛋白定量的影响 糖尿病肾病模型组大鼠空腹血糖
持续升高,日饮水量增多,尿量增多,体重减少,与假
手术组比较均有非常显著性差异(P<001);黄芪
卫矛合剂组空腹血糖和24h尿蛋白明显下降,饮水
量和尿量显著减少,与模型组比较均有非常显著性
差异(P<001);氯沙坦治疗组饮水量和尿蛋白显
著减少,与模型组比较均有非常显著性差异(P<
001),血糖和尿量没有明显变化。黄芪卫矛合剂
组与氯沙坦组比较尿量显著减少(P<001)。提示
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黄芪卫矛合剂有降低糖尿病肾病血糖、减少尿蛋白、
减少饮水量和尿量的作用。氯沙坦有减少糖尿病肾
病饮水量和尿白蛋白的作用,没有降低血糖和减少
尿量的作用。见表1,2。
表1 各组大鼠空腹血糖、体重、饮水量的比较(珋x±s)
组别 n 剂量/mg·kg-1 血糖/mmol·L-1 体重/g 饮水量/mL
假手术  10 - 766±124 52689±3356 3852±667
模型   15 - 2591±4511) 39973±56461) 33871±13761)
黄芪卫矛 15 40 1453±6592) 40430±73251) 28030±11731,2)
氯沙坦  15 16 1939±706 43270±79931) 29667±14911,2)
  注:与假手术组比较1)P<001;与模型组比较2)P<001
表2 各组大鼠24h尿量、尿蛋白定量的比较(珋x±s,n=8)
组别
剂量
/mg·kg-1
尿量
/mL
24h尿蛋白
/mg
假手术  - 1419±398 1135±370
模型   - 15350±31721) 13368±42211)
黄芪卫矛 40 6100±28152,3) 5554±30672)
氯沙坦  16 12480±4824 5257±26142)
  注:与假手术组比较1)P<001;与模型组比较2)P<001;与氯
沙坦组比较3)P<001
3.3 对大鼠血尿素氮和血肌酐的影响 糖尿病肾
病各造模组大鼠血尿素氮显著升高(与假手术组比
较P<001),造模组和假手术组比较血肌酐无明显
变化;黄芪卫矛合剂组和氯沙坦组血肌酐、尿素氮和
模型组比较没有显著差异。见表3。
表3 各组大鼠肾功能的比较(珋x±s,n=8)
组别
剂量
/mg·kg-1
血尿素氮
/mmol·L-1
血肌酐
/μmol·L-1
假手术  - 554±076 4601±632
模型   - 1219±2571) 4277±437
黄芪卫矛 40 1429±3672) 3835±745
氯沙坦  16 1479±5792) 4794±836
  注:与假手术组比较1)P<005,2)P<001
4 讨论
尿蛋白是各种肾脏疾病进展为终末期肾病的危
险因素,糖尿病肾病是引起慢性进展性肾病最重要
的原因[5]。尿蛋白的增多与糖尿病肾病的进程密
切相关,其机制主要与肾小球上皮细胞受损和数量
减少有关[6,7]。
糖尿病肾病的基本病机为气虚血瘀,并且贯穿
于疾病的全病程。黄芪卫矛合剂由黄芪和卫矛2味
药物组成,主要功效为化瘀散结,益气扶正。方中卫
矛入血破血、活血通络,善逐陈瘀败血,并可散结、
清热解毒、祛风、利湿;黄芪针对糖尿病肾病“虚”证
病机,益气扶正祛邪,助卫矛活血逐瘀,祛邪利湿,两
药合用,切合糖尿病肾病的病机,在临床应用上已取
得良好的疗效。
氯沙坦钾片是口服非肽类 AT1受体拮抗剂,大
量临床和实验证实它具有独立于降压效应的多重肾
脏保护作用,所以选择氯沙坦为对照药来研究黄芪
卫矛合剂对糖尿病肾病肾脏的保护作用。
本研究结果表明,糖尿病肾病动物模型的血糖
持续升高,日饮水量增多为正常鼠的8~9倍;尿量
增多约为正常鼠的10~11倍,体重减少,符合糖尿
病的“三多一少”特型特征;同时尿白蛋白显著增
多,表现为糖尿病肾损伤的症状。各造模组大鼠血
尿素氮升高,病理检测呈现弥漫性糖尿病肾小球硬
化症和结节性糖尿病肾小球硬化症。黄芪卫矛合剂
治疗后模型大鼠空腹血糖和24h尿蛋白明显下降,
饮水量和尿量显著减少;氯沙坦治疗组饮水量和尿
蛋白显著减少,血糖和尿量没有明显变化;黄芪卫矛
合剂和氯沙坦对糖尿病肾病模型大鼠升高的血尿素
氮无明显作用。提示黄芪卫矛合剂有降低血糖、减
少尿蛋白、减少糖尿病肾病大鼠饮水量和尿量的作
用;氯沙坦有减少尿蛋白和饮水量的作用,没有降低
血糖和减少尿量作用,说明黄芪卫矛合剂和氯沙坦
都有保护糖尿病肾病肾脏的作用,黄芪卫矛合剂在
减少尿量方面优于氯沙坦。
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[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20070616
[基金项目] 浙江省科技厅项目(2004C30057);浙江省中医
药管理局项目(B2005C183)
[通讯作者]  曹越兰,Tel:(0571)87783743,Email:
CYL123321@sohucom
槌果藤对硬皮病小鼠模型皮肤硬化抑制作用的实验研究
曹越兰,李 欣,王 群
(浙江大学 医学院 附属第二医院,浙江 杭州 310009)
  系统性硬化症(PSS)是以真皮层胶原过度沉积
为特征的结缔组织病,至今病因未明,治疗困难。
Yamamoto等用博莱霉素皮下注射的方法成功诱导
出C3H小鼠的硬皮病样改变,该小鼠模型在组织
学、生物化学、细胞因子表达等方面与硬皮病十分相
似[1],因此,研究者常以此为模型进行硬皮病病理、
治疗方面的研究。
槌果藤CapparisspinosaL为白花菜科山柑种
属植物,又称刺山柑、野西瓜,是一种生长在炎热干
旱气候条件下的半灌木,药用部位为叶、果、根、皮,
国外主要分布于地中海流域,我国主要产于新疆天
山南北,性苦温,具祛风除湿、止痛活血、止瘀消肿等
功效,在西亚作为一种传统草药用于抗炎、降压、降
脂、降糖、化痰、驱虫等[2]在新疆省内作为维吾尔族
药有广泛应用,鲜果捣碎外敷常用于治疗风湿性关
节炎、痛风等。李凡等曾报道用槌果藤外敷治疗局
限性硬皮病有明显疗效,为了进一步从组织学方面
证实其效果,寻找有效部位,以 C3H小鼠为模型,探
讨槌果藤对硬皮病小鼠模型皮肤纤维化的阻断、抑
制作用,为今后该药的开发应用提供实验依据。
1 材料与方法
11 动物
健康C3H小鼠24只,雌性,6周龄,体重16~
20g,清洁级,购自中科院上海实验动物中心,饲养
于浙江大学医学院实验动物中心清洁级饲养室。
12 药品制备
新鲜槌果藤果子2005年8月采自新疆克拉玛
依戈壁滩,经浙江大学药学院陈柳蓉副教授鉴定。
250g用粉碎机捣碎加75%乙醇25mL搅拌均匀成
绿色糊膏,4℃冰箱密封保存。槌果藤流浸膏(氯仿
提取):将10kg槌果藤果子自然晾干,粉碎,以氯仿
回流提取2次,用旋转蒸发以浓缩回收氯仿至尽,得
流浸膏200mL。
13 试剂和仪器
盐酸博莱霉素(日本化学株式会社)用 pH74
的磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶解成250μg·mL-1的
溶液,用022μm滤膜过滤、灭菌;Masson三色染色
试剂盒(上海虹桥医用研究所);羟脯氨酸检测试剂
盒(南京建成生物工程研究所);DMS100紫外可见
分光光度仪(澳大利亚 Varian公司);NikonNISBR
23彩色病理图象分析系统(日本Nikon公司)。
14 方法
141 硬皮病小鼠模型建立及药物处理 将 C3H
小鼠随机分成4组,每组6只,均剃去背部中央区被
毛。博莱霉素组:背部皮下注射250μg·mL-1博莱
霉素200μL,每日1次,共3周。槌果藤糊膏组:同
上方法注射博莱霉素并于注射第1天即在注射部位
外敷糊膏5g,保鲜膜封包,30min后擦去糊膏,每日
1次,共3周。槌果藤流浸膏(氯仿提取)组:同上方
法注射博莱霉素并于注射第1天即在注射部位均匀
外涂流浸膏01mL,相当于5g生药,每日1次,共
3周。PBS组:同一部位注射 PBS200μL,每日 1
次,共3周。
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