全 文 ：三棱丸抑制大鼠子宫内膜异位症血管生成及
ＶＥＧＦ，ＴＮＦα表达的研究
陈 怡１，徐晓玉１，叶 兰２，祝慧凤１，陈 红３，陈 刚４
（１．西南大学 药学院 中医药学院，重庆 ４００７１６；２．贵阳医学院 药理教研室，贵州 贵阳 ５５００４；
３第三军医大学西南医院 药剂科，重庆 ４０００３８；４重庆工商大学 药物中心，重庆 ４０００６７）
［摘要］ 目的：考察三棱丸（ＳＬＷ）抑制子宫内膜异位症（ＥＭＳ）血管生成作用及机制。方法：以ＳＬＷ作用于子
宫内膜异位症大鼠模型，免疫组化方法检测异位内膜组织中微血管密度（ＭＶＤ）、血管生成因子 ＶＥＧＦ及 ＴＮＦα蛋
白的表达，ＲＴＰＣＲ方法检测异位组织中ＶＥＧＦｍＲＮＡ和ＴＮＦαｍＲＮＡ的表达。结果：ＳＬＷ能有效降低ＭＶＤ，抑制
异位内膜组织中ＶＥＧＦ，ＴＮＦα蛋白和ｍＲＮＡ的水平。结论：ＳＬＷ具有良好的抗ＥＭＳ血管生成作用，其作用机制与
抑制血管生成因子ＶＥＧＦ，ＴＮＦα的水平有关。
［关键词］ 三棱丸；子宫内膜异位症；血管生成；ＶＥＧＦ；ＴＮＦα
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０３０３０３０５
［收稿日期］ ２００７０８０２
［基金项目］ 重庆市科委项目［渝科发计字（２００２）１８号９９］
［通讯作者］ 徐晓玉，Ｔｅｌ：（０２３）６８２５６７６５，Ｅｍａｉｌ：ｘｘｙ０６１８＠
ｓｉｎａ．ｃｏｍ
子宫内膜异位症（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ，ＥＭＳ）是妇科常
见疾病之一，育龄妇女中的发病率约１０％［１］。目前
没有理想的治疗方法和可供临床使用的药物。已有
研究发现血管生成是子宫内膜异位症发生的基本条
件，通过抑制异位内膜血管生成治疗ＥＭＳ正日益受
到学术界的关注。三棱丸最早见于《经验良方》，是
由三棱、莪术两味活血化瘀中药组成。用于瘀血经
闭，行经腹痛，瘕积聚，食积腹痛。本研究拟从抑
制血管生成角度来研究三棱丸治疗子宫内膜异位症
的机制，探讨三棱丸对 ＶＥＧＦ，ＴＮＦα含量的影响，
并与孕三烯酮进行比较。
１ 材料与仪器
１．１ 试验药物与试剂
三棱（ＲｈｉｚｏｍａＳｐａｒｇａｎｉ，四川欣康中药饮片有限
公司，批号０５０１０４）。莪术（ＲｈｉｚｏｍａＣｕｒｃｕｍａｅ，四川
省中药饮片有限责任公司，批号０５０２１９）。药材经重
庆医科大药学系中药教研室刘新副教授鉴定。孕三
烯酮胶囊，北京紫竹药业有限公司，规格：２５ｍｇ，批
号：５３０５０１０４。抗鼠ＶＥＧＦ抗体、抗鼠ＴＮＦα抗体、抗
鼠Ⅷ因子抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）；免疫组化 ＳＰ试剂
盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；总ＲＮＡ提取
试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）；ＲＴＰＣＲ试剂
盒（大连宝生物工程有限公司）；ＶＥＧＦ，ＴＮＦα、内参
引物（上海英骏生物技术有限公司）。
１．２ 主要仪器
ＭＤＦ－３８２Ｅ超低温冰箱（日本三洋），５４１５Ｄ高
速冷冻离心机（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ德国），ＰＣＲ仪（美国Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａｂｉｏｔｅｃｈ公司），ＤＹＹ－３垂直板蛋白电泳槽
（北京六一仪器厂），可见紫外凝胶扫描分析系统
（美国ＵＶＰ）。
１．３ 三棱丸制备
三棱、莪术粉粹成末，过 １０～２０目筛，等量配
方，３０℃水浸泡２ｈ，煎熬２次，每次６０ｍｉｎ，合并水
煎液浓缩，醇沉（７０％乙醇）２４ｈ，３０００ｒ·ｍｉｎ－１离
心１０ｍｉｎ，上清液过滤，终浓度为生药 １６ｇ·
ｍＬ－１，真空干燥，干燥粉末临用时按需配制药液。
１．４ 动物
ＳＤ大鼠６０只，雌性，清洁级，体重（２００±２０）
ｇ，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物生产合
格证ＳＣＸＫ（渝）２００２０００３，动物使用许可证 ＳＹＸＫ
（渝）２０００２０００７。
２ 方法
２．１ 大鼠子宫内膜异位症模型的建立［３］
以阴道脱落细胞涂片检测大鼠性激素周期，在
大鼠动情期以５％的水合氯醛（０００７ｍＬ·ｇ－１）腹
腔注射麻醉，常规消毒，开腹，结扎右侧子宫两端后，
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从远端剪取长约１５ｃｍ的子宫段，剔除脂肪组织，
剪成５ｍｍ×５ｍｍ的子宫组织（包括肌层）３块。一
块送病理检验（确证为子宫组织），另外两块缝于腹
壁，以黏膜面朝向腹膜，浆膜面朝向腹腔，关腹。
２．２ 模型检测与纳入标准［４］
４周后再次开腹观察移植物生长情况，并用游
标卡尺测量移植物大小。当移植物体积增大≥８
ｍｍ３纳入观察。５２只大鼠造模成功４０只（成功率
７６９％）。造模成功大鼠并可见移植物，内出现液
体积聚，呈隆起透亮的小囊状，被结缔组织或大网膜
覆盖并有血管形成。切取移植物送检，证实移植物
中有子宫内膜上皮细胞、腺体及间质生长。
２．３ 实验分组
将符合纳入标准的大鼠随机分为模型组、三棱
丸合煎高、中、低剂量组（５０，２５，１２５ｇ·ｋｇ－１·
ｄ－１）、孕三烯酮组（０５ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）及空白组
各８只。每天灌胃给药１次，对照组和模型组给予
相同容积的生理盐水，连续给药４周。
２．４ 异位组织ＭＶＤ和ＶＥＧＦ，ＴＮＦα含量的测定
取异位内膜组织，４％多聚甲醛固定，常规脱水
包埋，４μｍ连续切片，抗ＶＩＩ因子抗体、抗ＶＥＧＦ抗
体或 ＴＮＦα为Ⅰ抗，阴性对照用磷酸盐缓冲液
（ＰＢＳ）代替Ⅰ抗。按照 ＳＰ试剂盒说明书进行免疫
组化染色，试验步骤如下：脱蜡，脱水，ＰＢＳ清洗 ５
ｍｉｎ×３次后，３％ Ｈ２Ｏ２室温孵育１０ｍｉｎ，去除内源
性过氧化物酶的活性，ＰＢＳ洗，５ｍｉｎ×３次；按不同
的抗体进行修复；用正常血清封闭液孵育１０ｍｉｎ；加
入按１∶１００稀释的Ⅰ抗，Ⅰ抗为抗 ＶＩＩ因子抗体、
ＶＥＧＦ抗体或者抗 ＴＮＦα抗体，阴性对照用磷酸盐
缓冲液（ＰＢＳ）代替Ⅰ抗，４℃孵育过夜，吸出 Ｉ抗，
ＰＢＳ洗，５ｍｉｎ×３次；加生物素标记Ⅱ抗工作液，孵
育１５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗，５ｍｉｎ×３次；加辣根过氧化物酶
标记链霉卵白素工作液，孵育 １５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗，
５ｍｉｎ×３次；ＤＡＢ显色，显色５～２０ｍｉｎ，镜下观察
显色效果；自来水终止显色反应，复染，晾干，二甲苯
透明５ｍｉｎ，中性树胶封片，显微镜下观察，并用图像
分析系统进行分析。
２．５ 异位组织ＶＥＧＦｍＲＮＡ，ＴＮＦαｍＲＮＡ的检测
２．５．１ 细胞总ＲＮＡ的提取 按试剂盒说明书提取
总ＲＮＡ。总 ＲＮＡ提取后，经检测纯度高、完整无降
解，根据Ａ２６０值计算总ＲＮＡ的浓度。
２．５．２ 引物 ＶＥＧＦ，ＴＮＦα的引物以及 βａｃｔｉｎ的
引物均由上海英骏生物技术有限公司合成，以５μＬ
ＲＮＡ作为模板进行逆转录，ＰＣＲ扩增，以 βａｃｔｉｎ作
为内参照。ＶＥＧＦ１６５引物序列：上游 ５′ＣＡＧＧＣＴ
ＧＣＴＧＴＡＡＣＧＡＴＧＡＡ３′，下游 ５′ＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＣ
ＣＧＣＴＣＴＧＡ３′，扩增产物为２８０ｂｐ；ＴＮＦα２引物序
列：上游５′ＧＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣ３′，下游５′
ＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧ３′，扩增产物为 ２７２
ｂｐ；βａｃｔｉｎ引物序列：上游５′ＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＧＡＧＣ
ＣＡＴＣＣ３′，下游５′ＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ３′，
扩增产物为２０８ｂｐ。
２．５．３ ＲＴＰＣＲＰＣＲ反应条件 ９４℃预变性２ｍｉｎ，
９４℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，持续
３５个循环。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳后进行吸光
度扫描，将ＶＥＧＦｍＲＮＡ和ＴＮＦαｍＲＮＡ扩增条带的
吸光度值与βａｃｔｉｎ的吸光度值之比作为衡量参数，
分析ＶＥＧＦｍＲＮＡ和ＴＮＦαｍＲＮＡ的表达。
３ 统计学分析
计量资料数据分析以 珋ｘ±ｓ表示，进行单因素方
差分析，组间均值两两比较用 ＳＨＫ法，以上结果均
由统计软件包ＳＰＳＳ１００完成。
４ 结果
４．１ 三棱丸对异位组织微血管密度（ＭＶＤ）值的影响
Ⅷ因子阳性细胞染色为棕黄色，阳性染色细胞
主要是血管内皮细胞。空白组取正常在位子宫内膜
组织，其他组取异位子宫内膜组织。ＳＬＷ高、中剂
量组阳性染色细胞数量与模型组比较显著减少
（Ｐ＜００５），孕三烯酮组阳性染色细胞数量较模型
组显著减少（Ｐ＜００５）（表１，图１，２）。
表１ ＳＬＷ对ＥＭＳ大鼠异位组织表达ＭＶＤ的影响
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别 剂量／ｇ·ｋｇ－１ ＭＶＤ
空白 － ２０９±２６２）
模型 － ３１０１±５１
孕三烯酮 ００００５ ２４７５±４０１）
三棱丸 ５ ２２９９±３４２）
２５ ２５００±４０１）
１２５ ２８４６±４７
注：与模型组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２，３同）
４．２ 三棱丸对异位组织ＶＥＧＦ，ＴＮＦα表达的影响
用图像分析系统进行分析发现，ＳＬＷ高、中剂
量组、孕三烯酮组 ＶＥＧＦ阳性染色细胞数量和平均
吸光度较模型组有显著性减少（Ｐ＜００５），ＳＬＷ高
剂量组、孕三烯酮组 ＴＮＦα阳性染色细胞数量和平
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图１ 模型组，ＶＩＩ因子染色显示血管丰富（×２００）
均吸光度较模型组有显著性减少（Ｐ＜００５）（表２，
图２ 高剂量ＳＬＷ组，ＶＩＩ因子染色显示血管少（×２００）
图３～６）。
表２ ＳＬＷ对ＥＭＳ大鼠异位组织ＶＥＧＦ，ＴＮＦα表达的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别 剂量／ｇ·ｋｇ－１
ＶＥＧＦ
阳性细胞数／％ Ａ
ＴＮＦα
阳性细胞数／％ Ａ
空白 － ２９７３±５２２） １５０７４±７２３２） １８２３±５２２） １４６４０±６２０２）
模型 － ５５８３±５３ １３９２４±３３ ４８３３±４９ １２８３８±４７
孕三烯酮 ００００５ ４６０４±８３５１） １４５９９±５９１） ３４７９±６９７２） １３７５３±４４１）
ＳＬＷ ５ ４３０９±７６１１） １４６６８±４２１） ３５８３±５３２） １３７６７±３７１）
２５ ４５９５±６１５１） １４５５３±５０１） ３９３４±７６７ １３６４１±７４４
１２５ ５６３８±４４ １４１２３±５５ ５２６３±４３ １３４６０±１０６３
图３ 模型组，异位组织ＶＥＧＦ阳性
细胞数量多，染色呈棕黄色（×２００）
图４ 高剂量ＳＬＷ组，异位组织ＶＥＧＦ
阳性细胞数量少，染色浅（×２００）
４．３ 三棱丸对异位组织表达 ＶＥＧＦＭｒｎａ，ＴＮＦα
ｍＲＮＡ的影响
ＲＴＰＣＲ半定量分析显示，三棱丸高、中、低剂
量组均能抑制 ＶＥＧＦｍＲＮＡ，ＴＮＦαｍＲＮＡ的表达，
三棱丸高剂量组最为明显，孕三烯酮能抑制 ＶＥＧＦ
ｍＲＮＡ的表达（表３，图７，８）。
图５ 模型组，异位组织ＴＮＦα阳性细胞
数量多，染色呈棕黄色（×２００）
图６ 高剂量ＳＬＷ组，异位组织ＴＮＦα
阳性细胞数量少，染色浅（×２００）
５ 讨论
子宫内膜异位症（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ，ＥＭＳ）是妇科最
常见的疾病之一。当脱落的子宫内膜附着在腹膜或
其他着床部位时，其生长和发展需要大量的新生血
管。因此血管生成是子宫内膜异位种植存活和
ＥＭＳ发生的基本条件［５］，通过抑制异位内膜血管生
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表３ ＳＬＷ对异位组织表达ＶＥＧＦｍＲＮＡ，
ＴＮＦαｍＲＮＡ的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
组别 剂量／ｇ·ｋｇ－１ ＶＥＧＦ ＴＮＦα
空白 － １２８±０１５１） １１４±００６１）
模型 － ２４０±０１０ ２１８±０２７
孕三烯酮 ００００５ １５９±０１１１） ２２７±０１４
ＳＬＷ ５ １０８±００５２） １２２±００８１）
２５ １３３±０１６１） １３２±０２２１）
１２５ １４４±０１１１） １７４±０２４１）
图７ ＳＬＷ对ＥＭＳ大鼠异位组织表达
ＶＥＧＦｍＲＮＡ的影响
图８ ＳＬＷ对ＥＭＳ大鼠异位组织表达
ＴＮＦαｍＲＮＡ的影响
成治疗 ＥＭＳ已成为此领域的研究热点。ＶＥＧＦ作
为重要的促血管生成因子，在ＥＭＳ发病机制中起重
要作用，一方面腹腔内ＶＥＧＦ增多，促血管生长利于
异位内膜的种植、存活，另一方面异位内膜的生长可
表达更多的ＶＥＧＦ，又进一步促进血管增生，形成了
一种恶性循环。有实验发现ＶＥＧＦ在异位内膜上以
及ＥＭＳ患者腹腔液中有高表达，并且ＶＥＧＦ的水平
与疾病的严重程度相关［６］。ＴＮＦα是由单核巨噬细
胞产生的细胞因子，它与 ＥＭＳ中的炎性反应、血管
生成和不孕密切相关。ＴＮＦα可引起异位细胞增
殖、盆腔粘连、促进血管生长和抑制生育，是ＥＭＳ形
成所必需的因子之一［７］。实验结果显示，模型组大
鼠异位内膜组织微血管密度、ＶＥＧＦ，ＴＮＦα的表达
较正常组显著升高，与文献报告一致。而 ＶＥＧＦ，
ＴＮＦα的表达之间是否有相关性，有待进一步研究。
三棱丸是由三棱、莪术２味活血化瘀中药组成。
现代药理学发现［８］三棱、莪术都具有抗血栓形成、升
高白细胞、抗肿瘤的作用。此外，莪术油还有抑菌抗
炎、调节免疫功能、保肝、增加动脉血流量等作用。课
题组既往研究发现三棱丸含药血清可以抑制ＶＥＧＦ
诱导的血管内皮细胞增殖［９］。本实验首次报道了三
棱丸能有效降低异位内膜组织中ＶＥＧＦ，ＴＮＦα在蛋
白和ｍＲＮＡ水平的表达，并能抑制ＥＭＳ异位组织中
血管的生成。提示，三棱丸抑制ＥＭＳ异位组织血管
生成的作用，可能是通过抑制血管生成因子 ＶＥＧＦ，
ＴＮＦα表达而实现的。研究结果为三棱丸在临床上
用于治疗子宫内膜异位症提供了科学依据，并可为进
行抗子宫内膜异位症新药开发提供借鉴。
血管生成是一个复杂的过程，参与的因子很多，
如ｂＦＧＦ，ＰＤＥＣＧＦ，ＩＬ８等。三棱丸是否对其他血
管生成因子也有作用，这些血管生成因子之间的相
互关系，有待深入研究。此外，三棱丸对于子宫内膜
异位症是否具有免疫调节、抗炎、止痛、调节内分泌
功能等作用，还有待进一步研究。
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