全 文 ：·研究论文·
不同生物反应器对丹参不定根培养过程中
有效成分的影响
严硕１，高文远１，３，王娟２，黄滔１，曹宇３
（１．天津大学 药物科学与技术学院，天津 ３０００７２；
２．天津中医药大学 中药研究中心，天津 ３００１９３；
３．天津科技大学 中药生物工程研究所，天津 ３０００７４）
［摘要］ 目的：研究不同生物反应器对丹参不定根培养的影响。方法：利用组织培养技术结合高效液相色谱法，考察不
同生物反应器对丹参不定根生长以及丹参不定根有效成分丹参酮ⅡＡ（ＴＡ）及原儿茶醛（ＰＡ）含量积累的影响。结果：不同反
应器培养丹参不定根中，６０°圆锥型反应器最有利于丹参不定根有效成分的积累。测定６０°圆锥型反应器中的丹参不定根生
长曲线以及有效成分产物积累曲线形如“Ｓ”型。丹参不定根培养在第３５天达到最大生物量为１６２４ｇ·Ｌ－１（鲜重），有效成
分丹参酮ⅡＡ（ＴＡ）和原儿茶醛（ＰＡ）在第４０天达到最高，分别为０２３，０５１ｍｇ·ｇ
－１干重。结论：６０°圆锥型反应器最有利于
丹参不定根有效成分的积累，本实验对于丹参不定根大规模培养具有潜在意义。
［关键词］ 不定根；有效成分积累；生物反应器；丹参
［收稿日期］ ２００８１１１３
［基金项目］ 国家高技术研究发展计划（８６３）项目（２００３ＡＡ２Ｚ２０４０）；国
家中医药管理局中医药科学技术研究专项（０４２０５ＺＰ１０）
［通信作者］ 高文远，Ｔｅｌ／Ｆａｘ：（０２２）８７４０１８９５，Ｅｍａｉｌ：ｐｈａｒｍｇａｏ
＠ｔｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
丹参ＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａＢｕｎｇｅ以根和根茎入药，
主要含脂溶性二萜类化合物和水溶性酚酸类化合
物，是治疗心血管疾病的重要中药［１］。丹参根含有
２种主要类型化合物包括水解产物原儿茶醛（ＰＡ）
和水溶性双萜奎宁色素丹参酮ⅡＡ（ＴＡ）
［２］。国内外
学者先后开展了丹参的组织培养研究，对丹参细胞
和毛状根培养次生代谢产物的研究有一些报道［３５］，
利用反应器大规模培养丹参不定根以及合成次生代
谢产物，至今尚未见有报道［６７］。此外与毛状根培养
相比，不定根培养避免了诱导内源性基因可能导致
的对人体潜在的危害［８］。
１９９１年日本科学家 Ｋｏｉｃｈｉｒｏ等学者［９］首次报
道利用 Ｂ５液体培养基成功培养出丹参不定根，但
是此后，丹参的不定根培养报道较少，本课题组前期
工作筛选出丹参不定根培养最优培养基为 ＭＳ培养
基附加ＩＢＡ２ｍｇ·Ｌ－１和ＫＴ０７ｍｇ·Ｌ－１［１０］。本实
验首次使用反应器扩大培养丹参不定根，同时对丹
参不定根的生长和有效成分产物积累情况进行了研
究，对于丹参工业化生产奠定了一定的基础，对于丹
参这一名贵植物资源的持续开发和利用以及绿色原
料药的生产具有十分重要的意义。
１ 材料
为在附加ＩＢＡ２ｍｇ·Ｌ－１和ＫＴ０２ｍｇ·Ｌ－１的
基本ＭＳ液体培养基中继代多次的丹参不定根。丹
参酮ⅡＡ（ＴＡ）对照品（批号１１０７６６２００４１６），原儿茶
醛（ＰＡ）对照品（批号１１０８１０２００２０５），均购自中国
药品生物制品检定所。
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪（美国安捷伦公
司）；３１型鼓泡型反应器（球型反应器，６０°圆锥型
反应器，１２０°圆锥型反应器，鼓泡反应器）；７１型搅
拌型反应器（ＢＩＯＦ２００５，上海生物合作社）。
２ 方法
２．１ ４种３１鼓泡反应器扩大培养丹参不定根 将
７ｇ丹参不定根分别接种于４个内盛有１Ｌ附加ＩＢＡ
２ｍｇ·Ｌ－１和ＫＴ０２ｍｇ·Ｌ－１ＭＳ液体培养基的３１
型鼓泡型反应器（球型反应器，６０°圆锥型反应器，
１２０°圆锥型反应器，鼓泡反应器）中，通气量为０２５
（空气体积／培养体积／ｍｉｎ），培养温度２５℃。
２．２ ７１型搅拌型反应器扩大培养丹参不定根
将２２ｇ丹参不定根接入到内盛有４Ｌ附加ＩＢＡ２ｍｇ
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·Ｌ－１和ＫＴ０２ｍｇ·Ｌ－１ＭＳ液体培养基的７１型搅
拌型反应器中。培养温度２５℃，搅拌速度６０ｒ·
ｍｉｎ－１，通气量为０２５（空气体积／培养体积／ｍｉｎ）。
２．３ 丹参不定根培养过程中生物量测定 在生物
反应器培养的第１０，２０，３０，３５，４０，４５，５０天时收获
丹参不定根。用不锈钢筛网过滤并把不定根冲洗干
净，滤纸吸干表面后称其鲜重。在５０℃烘箱中烘干
２ｄ至恒重后记录下干重。根据公式不定根的生长
速度ＧＲ＝（Ｐ２－Ｐ１）／Ｐ１计算，Ｐ２表示收获时不定根
的干重，Ｐ１代表接种时不定根的干重。
２．４ ＨＰＬＣ测定丹参不定根中丹参酮ⅡＡ（ＴＡ）和原儿
茶醛（ＰＡ）的含量 丹参不定根用甲醇超声提取分离
测定丹参酮ⅡＡ（ＴＡ）的量，水提醇沉法提取分离测定
原儿茶醛（ＰＡ）的量。两者的分析均采用ＨＰＬＣ，参照
文献进行测定［１０］，ＳＵＰＥＬＣＯＩＬＴＭＬＣ１８柱（４６ｍｍ×
２５０ｍｍ，５μｍ），分析体系分别为甲醇水（８∶２）和甲
醇０５％乙酸（１５∶８５）进行等速洗脱，检测波长分别
为２７０，２８０ｎｍ，流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１。
２．５ 统计分析 数据均使用 ＳＰＳＳ１１５软件进行
统计学处理。
３ 结果
３．１ 不同反应器丹参不定根培养过程中生物量，生
长速率以及有效成分含量 测定不同反应器丹参不
定根培养过程中第３５天时丹参不定根的生物量和
生长速度以及第４０天时不同反应器中丹参不定根
有效成分ＴＡ和ＰＡ的积累结果见表１，可以看出丹
参不定根生长情况在各种反应器中是不同的，丹参
有效成分含量是由反应器类型影响的。搅拌反应器
和鼓泡反应器丹参生长速率较低，而对于球型反应
器，有效成分丹参酮ⅡＡ（ＴＡ）和原儿茶醛（ＰＡ）含量
比６０°圆锥型反应器培养低，综上考虑，选择６０°锥
形面反应器作为后期丹参不定根培养的反应器。
表１ 丹参不定根的生物量以及生长速率和有效成分含量（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
反应器类型
鲜重
／ｇ·Ｌ－１
干重
／ｇ·Ｌ－１
生长速率
丹参酮ⅡＡ（ＴＡ）
／ｍｇ·ｇ－１（干重）
原儿茶醛（ＰＡ）
／ｍｇ·ｇ－１（干重）
球型 １９２８±０３１ａ ３４９±０１１ａ １８９±００３ａ ０１２７±００５ａ ０２３±００９ａ
６０°圆锥型 １６２４±１０３ｂ ２９６±０２３ｂ １２９±０１７ｂ ０１８２±０１１ｂ ０４１±０１５ｂ
１２０°圆锥型 １４１３±０１５ｂ ２５３±０３１ｂ １１１±０１１ｂ ０１１３±００８ａ ０１８±０１１ｃ
鼓泡型 ９４８±０７７ｃ １６３±０４２ｃ ０３３±００９ｃ ００８８±０１５ｃ ０１１±００３ｄ
搅拌型 ２８３５±１１９ｄ ４９６±０１９ｄ ０２９±００５ｃ ０１０４±００７ａ ０２１±０１２ａ
注：５％显著水平，相同字母代表无显著性。
３．２ ６０°圆锥型反应器测定丹参不定根培养的动力
学生长曲线 在６０°圆锥型反应器培养丹参不定根
过程中测定不同时间段不定根的鲜重和干重，结果
显示丹参不定根生物量动力学生长曲线形如“Ｓ”
型，见图１，２。在丹参不定根培养前２０ｄ，不定根生
长缓慢，２０ｄ后，丹参不定根生长迅速并且在第３５
天达到最大生物量为 １６２４ｇ·Ｌ－１（鲜重），３５ｄ
后，生物量逐渐降低。
图１ 丹参不定根动力学生长曲线（干重）
图２ 丹参不定根动力学生长曲线（鲜重）
３．３ ６０°圆锥型反应器测定丹参不定根中丹参酮
ⅡＡ（ＴＡ）和原儿茶醛（ＰＡ）积累量 ＴＡ和 ＰＡ生物
合成曲线相似但是与不定根的生长曲线不同，见图
３，４，在第１０～３０天；有效成分积累量速度缓慢，但
是从３５ｄ后 ＴＡ，ＰＡ积累量增长迅速，在第４０天，
ＴＡ，ＰＡ积累量达到最大值，分别为０２３，０５ｍｇ·
ｇ－１，４０ｄ以后，ＴＡ，ＰＡ的生物合成积累增长缓慢。
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图３ 丹参有效成分ＴＡ生长积累过程
图４ 丹参有效成分ＰＡ生长积累过程
４ 讨论
本实验选用 ＭＳ培养基附加２，４Ｄ２ｍｇ·Ｌ－１
和ＫＴ０７ｍｇ·Ｌ－１ＭＳ固体培养基中诱导丹参愈伤
组织，前期工作表明其最有利于丹参不定根生成，最
利于次生代谢物合成，可能是该培养基高质量浓度
的矿质盐更能满足次生代谢物合成。
在丹参不定根不同反应器扩大培养中，搅拌反
应器的高切力限制了不定根的生长，由于一些不定
根在搅拌反应器中固定，不定根在搅拌反应器中的
生长曲线是不均匀的，所以丹参不定根在搅拌反应
器中的生长速度只有０２９。在鼓泡反应器中含有
大量空气，在不定根培养过程中观察到大量气泡，由
于产生较少的剪切力，所以鼓泡反应器更适用于不
定根生长。但是在鼓泡反应器中丹参不定根已基本
在反应器底部固定，反应器中营养和溶氧不均匀，导
致短小的丹参不定根停止生长，所以鼓泡反应器中
丹参不定根生物量为最低。而基于搅拌反应器和鼓
泡反应器设计的３种气泡反应器（球型反应器，６０°
圆锥型反应器，１２０°圆锥型反应器），克服了以上问
题并且不定根悬浮生长良好，球型反应器中，丹参不
定根生物量比其他反应器中高。在２种圆锥型反应
器中，丹参不定根生物量有差别，原因可能是由于气
体注入量不同以及氧气转化能力不同造成的。在
６０°锥形面反应器中由于足够的营养和氧气供给，
ＴＡ，ＰＡ的产量最高，各自达到 ０１８２，０４１０ｍｇ·
ｇ－１（干重），为各反应器中最高，前期工作摇瓶培养
丹参不定根 ＴＡ，ＰＡ各自最高达到０１３０，０２９８ｍｇ
·ｇ－１（干重），比 ６０°锥形面反应器培养最大含量
低，最后考虑丹参不定根生物量和二次代谢有效成
分合成能力，选择６０°锥形面反应器作为后期丹参
不定根培养的反应器。
在６０°圆锥型反应器培养丹参不定根过程中，
前２０ｄ不定根生长缓慢，之后不定根生长迅速并且
在第３５天达到最大量，３５ｄ后，干重逐渐降低，分析
原因是由于营养物质的消耗，使不定根的生长受到
抑制。ＴＡ，ＰＡ生物合成曲线相似但是与不定根的
生长曲线不同，在第３５天后ＴＡ，ＰＡ含量增长迅速，
在４０天达到最大值，此时 ＴＡ，ＰＡ含量是０２３，０５
ｍｇ·ｇ－１，这很大可能是由于根的快速增长增加了
有效成分积累，４０ｄ以后，由于营养消耗，ＴＡ，ＰＡ的
生物合成量增长缓慢。
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Ａｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｉｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆ
Ｓａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅ
ＹＡＮＳｈｕｏ１，ＧＡＯＷｅｎｙｕａｎ１，ＷＡＮＧＪｕａｎ２，ＨＵＡＮＧＴａｏ１，ＣＡＯＹｕ３
（１．ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００１９３，Ｃｈｉｎａ；
３．ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７４，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅａｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｏｎｔｈｅＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｍｅｔｈｏｄ：ＡｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｓｏｆＳ．ｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ．Ｔｈｅｔｙｐｅｏｆｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ａｎｄｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｒｏｏｔｇｒｏｗｔｈ，ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙＨＰＬＣ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｉｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ３ｌ
ｃｏｎｉｃａｌｂｕｂｂｌｅｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＣＮＢＢ）ｗｉｔｈ６０°ｔａｐｅｒｆａｖｏｒｓａｃｈｉｅｖｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｓ．Ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｌｏｏｋｓｌｉｋｅ“Ｓ”ｉｎＣＮＢＢｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｓｂｉｏ
ｍａｓｓｏｆ１６．２４ｇ·Ｌ－１（ｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ）ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄａｔ３５ｄａｙ．ＴｈｅｈｉｇｈｅｓｔｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔａｎｓｈｉｎｏｎｅⅡＡ（ＴＡ）ａｎｄｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃａｌｄｅ
ｈｙｄｅ（ＰＡ）ｒｅａｃｈｅｄ０．２３ｍｇ·ｇ－１ＤＷａｎｄ０．５１ｍｇ·ｇ－１ＤＷａｔ４０ｄａｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ３ｌｃｏｎｉｃａｌｂｕｂｂｌｅｂｉｏｒｅａｃ
ｔｏｒ（ＣＮＢＢ）ｗｉｔｈ６０°ｔａｐｅｒｆａｖｏｒｓｗａｓｔｈｅｂｅｓｔｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｓ；ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ；ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ；Ｓａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａ
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