全 文 :防己诺林碱调控紫杉醇在 9I>49I
细胞
模型中的跨膜转运研究
何丽! 杨俊毅*! 胡丽娜!
g四川大学 华西第二医院! 四川 成都 #$$&% *g四川大学 华西药学院! 四川 成都 #$$
$摘要%!目的&研究防己诺林碱对紫杉醇在9I>49I
细胞跨膜转运的调控作用) 方法#以外排转运蛋白E4DA底物
紫杉醇为模型药物$盐酸维拉帕米为对照$考察防己诺林碱调控紫杉醇在 9I>49I
细胞模型的跨膜转运作用) 采用
>E4YE`<检测紫杉醇在转运介质中的药物浓度$计算其表观渗透系数) 结果#紫杉醇在E4DA高表达的9I>49I
细胞模
型中外排的速率明显快于吸收的速率) 与紫杉醇单用相比$紫杉醇分别联用盐酸维拉帕米及防己诺林碱后$紫杉醇吸收速率
均显著增加$而外排速率均显著降低$相同浓度的防己诺林碱抑制转运作用强于对照盐酸维拉帕米) 结论#防己诺林碱能够
明显降低紫杉醇在9I>49I
细胞的外排作用$抑制由E4DA介导的多药耐药)
$关键词%!紫杉醇*防己诺林碱*9I>49I
细胞*E4糖蛋白
$稿件编号%!*$$$($$
$通信作者%!!胡丽娜$博士生导师$教授$RMS#!$*(($)**$ U4
/BNS#-b?TSN1B2*#g-./
$作者简介%!何丽$硕士研究生$RMS#!$*(($)**$U4/BNS#?MSNO-
2#)g-./
!!防己诺林碱!PB1D-?N1.SN1M$HB1是防己科植物
粉防己的干燥根中所含的主要生物碱活性成分之
一$其毒性较低$具有镇痛&抗风湿&利尿消肿之功
效) 同时它也是一种双苄基异喹啉生物碱$近年来
研究发现该类生物碱中的某些单体成分具有抗肿瘤
增敏作用$在对抗肿瘤化疗过程中产生的多药耐药
具有潜在活性+, ) E4糖蛋白!E4DA是目前已知的外
排转运蛋白介导的多药耐药的主要原因$它是
9I> 基因表达的产物$紫杉醇! AB-SN@B6MS$EB-在
化疗过程中存在多药耐药的现象+*, $研究发现 EB-
是E4DA的外排底物+), $本研究采用9I> 特异性转
染的犬肾近曲小管上皮细胞9I>49I
细胞模
型$研究HB1调控EB-由E4DA介导的跨膜转运作用
的影响+&, )
!材料
U!仪器! B`\ 3SNB1-M高效液相色谱仪!9.QMS
$$ ][=[NO检测器$8MCNMO
2
泵*31BO@BC色谱工作
站*
!:J3$德国*RF`4#<台式高速离心机!上海市安
亭科技仪器厂*倒置相差显微镜!LS5/ATO$日本*
9NSN-MS4U>8 电位仪 !9NSNA.CM$美国*RCB1O+MS#
孔板系统!<.O@BC$美国*二氧化碳孵箱!YMCBMTO$德
国*超净工作台!苏州净化设备总厂*隔水式电热
恒温培养箱!上海跃进医疗器械厂)
U!试药!9I>49I
细胞!荷兰肿瘤研究
所*EB-对照品!中国药品生物制品检定所*EB-
!
77j$成都科杰高新技术发展有限公司*地西
泮对照品!中国药品生物制品检定所*HB1!成都曼
思特生物科技有限公司*盐酸维拉帕米!dMCBAB/NS
?5QC.-?S.CNQM$[MC$上海禾丰制药有限公司*I9U9
!FN\-.4G>` $美国*HG8 !Y5-S.1M$美国*青霉素
!华北制药股份有限公司*链霉素!大连美罗大药
厂*I98L$胰蛋白酶$UIR3!8ND/B)
!方法与结果
U!9I>49I
单层细胞的培养及评价!
9I>49I
细胞培养于 I9U9完全培养基中$
含I9U9培养基&$j胎牛血清&$$ ]./` e青霉
素&$$ /D.`e链霉素双抗液$于 )% h$j
培
养箱中培养) 隔天更换 次细胞培养基$每次换液
将细胞稀释约 倍) 连续稳定传代 ) 代细胞后$取
对数生长期细胞$用空白培养基将其制成每毫升约
含 * m$个细胞的混悬液) 接种于 RCB1O+MS# 孔
板$置 )% h$j
培养箱静置培养$每天更换
次培养基$直至细胞形成完全致密的单层膜) 分别
于第 *$)$&$ 天测定 * 种细胞的跨膜电阻值$电阻
.(%&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
值r$$
>
.-/
e*并保持稳定符合要求)
U!色谱条件!3N-?C./G.1Q43^ <
(
色谱柱!&g#
//m*$ //$
/*流动相甲醇4$ //.SJY
*
EL
&
缓冲液!AY)g$ !%i**流速 g$ /` ./N1e*柱
温 )$ h*检测波长 **% 1/*进样量 *$
)`
U&!样品处理方法!精密吸取样品 *$$
$`加入
g$ /D.`
e内标地西泮溶液 *$
&`乙酸乙酯 *
/` $旋涡混合 ) /N1$ 万 C./N1e离心 /N1$分离
有机层$于 &$ h干浴氮气挥干$残渣用 $$
流`动
相溶解$进样 *$
$`在选定色谱条件下分离测定$
记录EB-峰面积!4&及内标峰面积!4%$内标法计
算血浆中的EB-浓度)
U_!方法专属性考察!用所选定的色谱条件对
EB-在样品中的测定进行专属性考察$考察了空白
培养基中的物质及调控药物对模型EB-及内标的测
定是否存在干扰$结果见图 $可见 EB-及内标峰保
留时间分别为 7g*$(g /N1$分离度Grg$样品体
系中的物质对 EB-的测定无干扰$所选定的色谱条
件专属性较好)
3g空白介质*Gg空白介质中加入EB-及内标对照溶液*
U$!标准曲线的制备!精密称定 EB-工作对照品
约 $g$ /D$用甲醇稀释为质量浓度分别为 $$
)$)$$$$g$)$g)$$g$g$$g$ /D.`
e的
EB-标准工作液) 取空白培养基!含 $gjI98L
*$$
$`加入内标 *$
及`系列工作溶液 *$
$`照
标准样品处理方法处理后$于拟定的色谱条件下进
样分析$以EB-峰面积与内标峰面积之比 9对药物
浓度 进行线性回归) 得到标准曲线方程 9f
g*)$ #l$g$(7 #$0f$g777 %$样品在 $g$ k
$g /D.`
e线性关系良好)
U)!准确度试验!取空白培养基!含 $gjI98L
*$$
$`不同浓度EB-工作溶液 *$
$`得到 $g$$
)g$)$)$g) /D.`
e的EB-含药标准样品$每个浓度
份样品$照标准样品处理方法处理后$于拟定的色
谱条件下进样分析$记录EB-和内标峰面积$代入标
准曲线计算浓度$并求算回收率$低&中&高回收率分
别为!)g) p(g#j$!$&g$ pg)j$!$#g7 p
(g%j$方法准确度良好)
U%!精密度试验!按准确度试验项下配制浓度分
别为 $g$$)g$)$)$g) /D.`e的 EB-含药标准样
品$每个浓度 份样品$连续测定 ) 个分析批) 照样
品处理方法处理后$于拟定的色谱条件下进样分析$
记录EB-和内标峰面积$代入标准曲线计算浓度$计
算批内与批间>8I) 批内>8I
%gj$批间>8I
g*j$方法精密度良好)
U`!稳定性考察!配制EB-标准样品$分别于室温
放置&冰冻及冻融条件下$进行考察样品稳定性$结
果表明样品于室温下放置至少 *& ? 内可保持稳定$
于e*$ h冰冻条件下放置至少 ( 周内可保持稳定$
样品经过 ) 次冻融后可保持稳定)
U#!EB-单用及联用HB1在9I>49I
细胞模
型中的跨膜转运试验!EB-单用组$取已接种
9I>49I
细胞的且符合转运条件的 RCB1O+MS
# 孔板$于 3室 !顶侧室中分别加入 $$*$$&$
/.S.`
e的 EB-含药供试液$G室!基底侧室中
加入空白转运介质!)f)$每隔 )$ /N1从G室精确
取样 *$$
$`并补加相同体积空白转运介质于 G
室$*$ /N1后中止试验$依法测定 G侧室样品中的
EB-浓度$计算转运药量*同法于3室中加入空白转
运介质$G室中分别加入系列浓度的含EB-供试液$
每隔 )$ /N1从3室精确取样 *$$
$`并补加相同体
积空白转运介质于3室$*$ /N1 后中止试验$依法
测定3侧室样品中的EB-浓度$计算转运药量)
EB-联用HB1组$取已接种9I>49I
细胞
的且符合转运条件的 RCB1O+MS# 孔板$3室!供给
室加入中浓度!*$
/.S.`
e
EB-含药供试液$G
.7%&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
室!接收室加入空白转运介质!)f)$同时于3$G
室分别加入低&中&高不同浓度的 HB1$使 HB1 终浓
度分别为 *$$$*$
/.S.`
e
$阳性对照则加入低&
中&高不同浓度的 [MC$使 [MC终浓度分别为 *$$$
*$
/.S.`
e
*同法于3室!接收室加入空白转运
介质$G室!供给室加入系列浓度的含EB-供试液$
同时于 3$G室分别加入使其终浓度一致的 HB1 或
阳性对照[MC$以加入空白转运介质为阴性对照$每
隔 )$ /N1从接收室精确取样 *$$
$`并补加相同体
积空白转运介质$*$ /N1 后中止试验$依法测定接
收室样品中的EB-浓度$计算转运药量)
根据试验结果按下式计算表观渗透系数
>
BAA
+,
$其中 ,T
,!
为接受室药物转运量变化的表观线
性速率*
$
为药物在给予端的初始浓度*4为聚碳酯
膜的表面积) 采用 !检验进行统计学分析$数据均
以
#
?p&表示)
>
.$$
f
,T
,!
m
4m
$
由表 可见$单用 EB-$在 E4DA 高表达的
9I>49I
细胞模型中外排的速率明显快于
吸收的速率!>o$g$ $EB-在 9I>49I
EB-单用相比$EB-分别联用 HB1 及 [MC后$在
9I>49I
细胞模型中$34G吸收转运速率
均显著增加!>o$g$ $G43外排转运速率均显
著降低!>o$g$ $二者的比值升高$表明 HB1
及 [MC均可显著抑制 EB-在 9I>49I
细胞
中的外排)
表 !EB-单用及联用HB1在9I>49I
细胞模型中的表观渗透系数!
#
?p&$)f)
组别=
/.S.`
e
>
BAA!34G
=m$
e%
-/.O
e
>
BAA!G43
=m$
e%
-/.O
e
>
BAA!34G
=>
BAA!G43
EB-$ ,*( p$, %,)( p$,)& $,%
EB-*$ ,*7 p$,( (,#% p$,&$ $,
EB-&$ ,$ p$,# %,$# p$, $,
EB-*$ lHB1 * ), p$,)* #,#* p$,) $,*
EB-*$ lHB1 $ &,*) p$,%* *,7 p$,) ,&)
EB-*$ lHB1 *$ ,*# p$,(( *,% p$,) ,7&
EB-*$ l[MC* ),# p$,$ &, p$,% $,%#
EB-*$ l[MC$ *,7 p$,) ), p$,& $,()
EB-*$ l[MC*$ *,7 p$,(7 ),( p$,( $,(*
&!讨论
9I
单层膜结构) 经人 9I> 基因转染 9I
后得
9I>49I
细胞$具有高度特异性表达人9I>
基因编码的E4DA的特性$该细胞在聚碳酯膜上培养
为单层膜细胞后$细胞膜亦具有小肠上皮细胞的结
构特征$其顶侧膜高度表达外排转运蛋白 E4DA$而
几乎没有其他类似外排型转运体的表达$因此
9I>49I
细胞是一种很好的人小肠上皮细胞
的模型$可用于 E4DA 底物与 E4DA 抑制剂活性的筛
选$及可能存在的E4DA介导的药物相互作用评价)
[MC为经典的 E4DA 抑制剂+#, $试验发现$中&高
浓度的 HB1 逆转 EB-外排作用强于对照 [MC!>o
$g$) HB1浓度与药物从 34G转运速率呈明显正
相关$而与 G43转运速率呈负相关$浓度增加$其抑
制外排的作用显著增强$且呈浓度依赖性) 提示
EB-临床化疗过程中$联合使用 HB1 可能降低外排
转运蛋白介导的多药耐药的发生几率及其程度$研
究结果将为临床药物合理应用提供依据)
$参考文献%
+,!HT `X$IM1D_3$EB1 ^<$M@BSg8-CMM1N1DB1Q QNO-.dMC5.P1.4
dMS9I>/.QNPNMCOPC./1B@TCBS5.--TCN1D\NO\M1W5SNO.bTN1.SN1M
BSZBS.NQO+V,g31@N-B1-MC>MO$ *$$$*!&3#**%)g
+*,! N`^ $^
@CMB@MQ +N@? AB-SN@B6MS+V,g
@?M@N-BANDM1N1 ?./.QN/MCOSN1ZMQ +N@? QMPN1MQ4SM1D@? A.S5!M@?5S4
M1MDS5-.S OAB-MCON1-CMBOMQCTDCM@M1@N.1 B1Q M1?B1-M-?M/.OM14
ON@NdN@5N1 CMONO@B1@-B1-MC-MSO+V,gV9MQ #%&*g
+&,!刘瑶$曾苏g9I
进展+V,g药学学报$*$$($&)!##7g
+,!马莲$杨秀伟g利用人源
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B-NQ N1QT-MOQ.+14CMDTSB@N.1 .PE4DS5-.AC.@MN1 M6ACMOON.1 B1Q
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$责任编辑!张宁宁%
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