全 文 ：铁皮石斛居群差异的研究Ⅱ
ＩＳＳＲ指纹标记方法的建立与优化
沈 洁，丁小余，丁 鸽，刘冬扬，唐 凤，贺 佳
（南京师范大学 生命科学学院 江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，江苏 南京 ２１００９７）
［摘要］ 目的：针对铁皮石斛ＩＳＳＲ的反应特点，建立稳定可靠的 ＩＳＳＲ分子指纹标记反应体系，为进一步研究
铁皮石斛的居群差异奠定基础。方法：通过筛选引物并设定影响铁皮石斛ＩＳＳＲ反应的诸因子的不同浓度，检测 ＩＳ
ＳＲ不同反应体系的扩增效果；通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化，建立铁皮石斛 ＩＳＳＲ稳定可靠的
反应体系。结果与结论：首次建立了可用于铁皮石斛 ＩＳＳＲＰＣＲ分析的最适宜的反应体系：２５μＬＰＣＲ反应体系中，
１０×Ｔａｑ酶配套缓冲液，１５ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶，１２～１８ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２，８０μｍｏｌ·Ｌ
－１ｄＮＴＰ，０２μｍｏｌ·Ｌ
－１引物，
ＤＮＡ模板约２０ｎｇ，退火温度５２～６０℃；实验表明：Ｔａｑ酶质量、ＤＮＡ模板品质、退火温度等对 ＩＳＳＲ反应结果具有较
大影响。所建立的铁皮石斛ＩＳＳＲ反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特
点，可以较好地应用于铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态的研究。
［关键词］ 铁皮石斛居群；ＩＳＳＲ反应体系；建立与优化
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００６）０４０２９１０４
［收稿日期］ ２００５０１２４
［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（３０３７０１４４）
［通讯作者］ 丁小余，Ｔｅｌ：（０２５）８３５９８２１５，Ｅｍａｉｌ：ｄｉｎｇｘｙｎｊ＠
２６３．ｎｅｔ
铁皮石斛为兰科石斛属植物，被列为我国珍稀
特有的名贵药用植物［１］。铁皮石斛主要分布于云
南、广西、贵州、浙江、湖南、广东等省区的悬崖峭壁，
虽然居群数量及个体数濒危稀少，但居群间却存在
着明显的差异［２，３］。在铁皮石斛人工集约化栽种
时，人们需要寻找产量高、生药性状及药效好的道地
性居群作为集约化生产的对象。因此，对铁皮石斛
各居群进行道地性及分子标记研究已成燃眉之急。
ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）是一种建立在
ＰＣＲ反应基础上的 ＤＮＡ分子标记，由 Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｅｚ等
人于１９９４年创建［４］。近年来，ＩＳＳＲ已成功用于植物
遗传多样性分析、ＤＮＡ指纹图谱绘制、分子生态学
研究等领域［５１３］。该技术无需预知受试基因组序
列，成本低，操作简单且稳定性好，被认为是非常理
想的研究居群问题的分子标记。在利用 ＩＳＳＲ方法
研究铁皮石斛居群的遗传差异时，发现改变 ＩＳＳＲ反
应的各因子会直接影响到 ＩＳＳＲ试验结果的稳定性。
为此，必须对铁皮石斛 ＩＳＳＲ的反应体系进行优化，
分析非特异性条带的产生原因，以建立铁皮石斛 ＩＳ
ＳＲＰＣＲ反应的可靠体系，为深入开展铁皮石斛种质
资源的居群差异研究奠定基础。
１ 材料
实验所用的铁皮石斛 Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｉｃｉｎａｌｅ
ＫｉｍｕｒａｅｔＭｉｇｏ居群材料采自我国铁皮石斛的主产
区：云南、广西、贵州、浙江、湖南等省的原始森林，共
计１０个居群。１～７６号 ＩＳＳＲ通用引物购自南京生
兴生物工程公司。
２ 方法
２１ ＤＮＡ提取及检测 根据 ＱＩＡＧＥＮ试剂盒的使
用指南进行实验材料总ＤＮＡ提取，采用分光光度计
法定量检测其浓度，并根据基因组 ＤＮＡ的浓度值将
样品稀释至２０ｎｇ·μＬ
－１用于 ＩＳＳＲＰＣＲ分析。
２２ ＩＳＳＲＰＣＲ初始条件及程序 根据扩增铁皮石
斛ＩＴＳ等序列的反应体系［３］，同时参考有关 ＩＳＳＲ分
析的文献［１４１７］，铁皮石斛 ＩＳＳＲＰＣＲ初始２５μＬ反应
体系包含：１０×Ｔａｑ酶配套缓冲液，２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＭｇＣｌ２，１６０μｍｏｌ·Ｌ
－１ｄＮＴＰ（ｐｒｏｍａｇａ生物公司），０４
μｍｏｌ·Ｌ
－１引物，１ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ模板约２０
ｎｇ。相应的扩增程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ，然后是
９４℃变性４５ｓ，５２℃复性４５ｓ，７２℃延伸１５ｍｉｎ，
共３８个循环后，７２℃延伸 ７ｍｉｎ补齐。反应结束
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后，产物置于４℃冰箱保存。
２３ 实验设计 本实验 Ｍｇ２＋设立以下 ６个梯度：
１０，１２，１５，１８，２０，２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１；ｄＮＴＰ设立
以下４个处理：８０，１２０，１６０，２００μｍｏｌ·Ｌ
－１；引物设
立以下 ５个处理：０２，０４，０６，０８，１０μｍｏｌ·
Ｌ－１；ＴａｑＤＮＡ聚合酶设立以下 ５个处理：１０，１５，
２０，２５，３０Ｕ；ＤＮＡ模板量有以下 ７个梯度：１０，
２０，３０，４０，５０，６０，７０ｎｇ；引物的退火温度在理论
退火温度的基础上设置，每次设置６个温度梯度；另
外，每一种组合都设立相应的阴性对照即反应体系
中不加入模板，其他组分相同。
２４ ＩＳＳＲＰＣＲ产物鉴定 反应产物在含有 ＥＢ的
１５％琼脂糖凝胶中电泳分离，用 ＤＬ２０００的 ＤＮＡ
ｍａｒｋｅｒ（１００～２０００ｂｐ）作为分子质量标记，以 ５Ｖ·
ｃｍ－１的电压电泳２５ｈ，在紫外分析仪上观察并记录
扩增条带，ＵＶＰ紫外自动成像仪拍照。
３ 结果与讨论
以云南广南居群为模板，用以上 ＩＳＳＲＰＣＲ初始
条件及程序进行引物初筛。结果显示：在引物库的
７６条引物中，有３２条引物具有扩增的多态性条带，
但ＩＳＳＲ的初始反应条件暴露出很多问题，如：条带
不够清晰、拖尾严重、负对照中出现扩增条带等不理
想结果（见图 １）。本研究通过设定影响铁皮石斛
ＩＳＳＲ反应的诸因子浓度，建立并优化了铁皮石斛ＩＳ
ＳＲ的反应体系。
图１ ＩＳＳＲＰＣＲ初始条件的反应结果
１，２组，４，５组，７，８组为３组平行管，用不同引物进行正常扩增，
３，６，９号管分别为它们的负对照
３１ Ｍｇ２＋和ｄＮＴＰ浓度的选择 ＰＣＲ反应中，Ｍｇ２＋
能影响反应的特异性和扩增片段的产率，是 ＩＳＳＲ
ＰＣＲ反应中的一个主要变化因素。但相对来说，
Ｍｇ２＋浓度是一个容易控制的参数，因为所有的浓度
变化都可以在不同的反应管中同时进行［１８，１９］。目
前所购的ＴａｑＤＮＡ聚合酶，除了附带提供标准缓冲
液外，还单独提供ＭｇＣｌ２溶液，简化了Ｍｇ２＋浓度的调
节。
本实验对每个引物都采用了典型的两步优化过
程：首先进行 Ｍｇ２＋浓度增幅为 ０５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的从
１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１到２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的一系列浓度梯度的
筛选；其次，在Ｍｇ２＋浓度范围缩小后，再作第二轮优
化，采用２～３个增幅为０３ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 Ｍｇ２＋浓度，
筛选出适宜的 Ｍｇ２＋浓度。结果表明不同的引物对
Ｍｇ２＋浓度要求不同，如５号引物反应所需的Ｍｇ２＋浓
度为 １５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，而 ３４号引物反应的最适 Ｍｇ２＋
浓度是１８ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
ｄＮＴＰ是反应中磷酸基团的主要来源，在 ＰＣＲ
反应中，ｄＮＴＰ终浓度一般为 ２０～２００μｍｏｌ·Ｌ
－１，其
浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错
误掺入率和实验成本。反之，低浓度的 ｄＮＴＰ会导
致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，
由于 ｄＮＴＰ直接螯合相应数量的 Ｍｇ２＋，它们浓度的
任何改变都会影响有效Ｍｇ２＋的浓度［１８，１９］。
本实验就Ｍｇ２＋和ｄＮＴＰ浓度设计了互作组合浓
度，希望找出一个合理的，能够扩增出清晰带型的浓
度组合。Ｍｇ２＋和 ｄＮＴＰ浓度对扩增结果（所用引物
为４４号，模板 ＤＮＡ取自云南广南居群）的影响，如
表１所示。当 Ｍｇ２＋浓度在 １５～２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，
ｄＮＴＰ浓度在 ８０～２００μｍｏｌ·Ｌ
－１时均有扩增条带，但
条带的多少、真伪有明显差异；只有当 ｄＮＴＰ的浓度
为８０μｍｏｌ·Ｌ
－１，Ｍｇ２＋浓度为 １５ｍｍｏｌ·Ｌ－１和 １８
ｍｍｏｌ·Ｌ－１时可以得到清晰的条带，且没有非特异性
扩增，Ｍｇ２＋浓度为１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１时效果最佳（Ｍｇ２＋
浓度视具体引物而定）。
表１ Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰ互作组合浓度对ＩＳＳＲＰＣＲ结果的影响
ｄＮＴＰ浓度
／μｍｏｌ·Ｌ
－１
Ｍｇ２＋浓度／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
１．０ １．２ １．５ １．８ ２０ ２．５
正常扩增 负对照 正常扩增 负对照 正常扩增 负对照 正常扩增 负对照 正常扩增 负对照 正常扩增 负对照
８０ － － － － ＋ － ＋ ＋／－  ＋／－ ＋ ＋
１２０ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋  ＋  
１６０ ＋ ＋ ＋ ＋  ＋  ＋    
２００ － － － － ＋ ＋  ＋  ＋  
注：＋表示有扩增条带，表示扩增条带多，＋／－表示扩增条带不稳定，－表示无扩增条带（表２同）
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３２ ＤＮＡ模板量和引物浓度的调整 ＤＮＡ模板量
也是影响 ＩＳＳＲＰＣＲ扩增效果的主要因素之一。模
板质量浓度过低，无扩增产物或产物不稳定；模板质
量浓度过高，又会导致扩增条带模糊还会相应增加
非特异性产物的出现［１８，１９］。在其他条件不变的情
况下，对比研究 ２５μＬ反应体系中模板用量在 １０，
２０，４０，６０，７０ｎｇ时，４４号引物 ＩＳＳＲ的扩增结果，见
图２。
图２表明，２５μＬ反应体系中，模板 ＤＮＡ量在
１０～６０ｎｇ都能扩增出相同的带型，且模板量在 ２０
ｎｇ时扩增产物最为清晰稳定；当模板量大于 ７０ｎｇ
时扩增产物开始模糊。所以在铁皮石斛居群鉴别的
ＩＳＳＲＰＣＲ分析中，采用的ＤＮＡ模板量为２０ｎｇ。
引物与模板比对ＰＣＲ的特异性非常重要。ＰＣＲ
反应中引物浓度一般为０１～０５μｍｏｌ·Ｌ
－１，如果引
物、模板比太高，则倾向于产生非特异产物，而且容
易形成引物二聚体；但是如果比例太低，ＰＣＲ的效率
就会大大降低［１８，１９］。针对二者间的相关性也设计
了一些组合，结果显示：在其他因素不变而 ＤＮＡ模
板量（取自云南广南居群）为 ２０ｎｇ时，只有引物浓
度（所用引物为４４号）为０２μｍｏｌ·Ｌ
－１时，扩增效果
最佳；随着引物浓度的提高，扩增条带变得模糊，二
聚体增多，且出现一定的非特异性条带，见表２。
图２ 不同ＤＮＡ模板用量的ＩＳＳＲ扩增结果
１～５泳道ＰＣＲ反应的模板用量分别为１０，２０，４０，
６０，７０ｎｇ；ＭＤＬ２０００ＤＮＡｍａｋｅｒ
表２ 模板用量为２０ｎｇ时不同引物浓度下的扩增结果
引物浓度／μｍｏｌ·Ｌ
－１ 正常扩增 负对照
０２  －
０４  
０６  ＋
０８  ＋／－
１０  ＋／－
３３ Ｔａｑ酶的选择 在确定了 Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰ，模板
量，引物浓度之后，设置了５个 Ｔａｑ酶含量梯度。结
果表明：在２５μＬ反应体系中，加入 １～１５ＵＴａｑ酶
都可以获得重复清晰的条带，且无非特异性条带，以
１５Ｕ时条带最清晰（见图 ３）。但当 Ｔａｑ酶含量高
于或等于２Ｕ时，条带变得不清晰，背景开始模糊，
出现了非特异性条带。另外，不同厂家生产的 Ｔａｑ
酶性能上有差异，而且同一厂家不同批次的产品也
存在一定的差异［１６，１７］，所以在本实验中使用的是同
一厂家同一批次（９Ａ２００４）的Ｔａｑ酶。
图３ 不同Ｔａｑ酶用量的ＰＣＲ结果
１～５为正常扩增，Ｔａｑ酶用量分别为１，１５，２，
２５，３Ｕ；６～１０分别为１～５的负对照
３４ 退火温度的调整 在同一 ＰＣＲ反应中，因退
火温度的改变，产生错配的程度也有所不同。通常
较低的温度在保证引物与模板结合稳定性的同时，
也会使引物与模板之间未完全配对的一些位点间得
到扩增，即产生一定的错误扩增。因此，在允许的范
围内，选择较高的退火温度可减少引物与模板之间
的非特异性结合，提高反应的特异性［１８，１９］。在进行
退火温度的优化时，首先采用最简单的方法［Ｔｍ＝４
（Ｇ＋Ｃ）＋（Ａ＋Ｔ）］估算引物模板对的 Ｔｍ值，然后
以 Ｔｍ值为基准，２℃为间隔，上下浮动，从高于 Ｔｍ
值６℃直到低于 Ｔｍ值６℃的一系列反应筛选出最
佳退火温度。实验结果表明，大部分引物的最适退
火温度高于理论退火温度。
通过对上述４种条件的优化，筛选出适宜于铁
皮石斛 ＩＳＳＲＰＣＲ分析的反应体系，组成为：１０ｍｍｏｌ
·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ，１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ，８ｍｍｏｌ·Ｌ－１
（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ９０，１２～１８ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２，Ｔａｑ酶
１５Ｕ，ｄＮＴＰ８０μｍｏｌ·Ｌ
－１，引物 ０２μｍｏｌ·Ｌ
－１，ＤＮＡ
模板量约２０ｎｇ，总体积为２５μＬ。反应循环参数为：
９４℃预变性５ｍｉｎ，然后９４℃变性４５ｓ，５２～６０℃复
性４５ｓ，７２℃延伸１５ｍｉｎ，共３８个循环后，７２℃延
伸７ｍｉｎ补齐。利用此优化系统，对铁皮石斛的 １０
个居群进行了扩增，得到了背景清晰、多态性稳定丰
富的ＤＮＡ扩增片段（见图４），可用于铁皮石斛的居
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群鉴别及遗传结构分析研究。
图４ ２号引物对铁皮石斛１０个居群的扩增结果
ＭＤＬ２０００ＤＮＡｍａｋｅｒ；１～１０铁皮石斛的１０个居群
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ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｉｆｅｒｅｎｃｅｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｏｆｉｃｉｎａｌｅⅡ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆＩＳＳＲｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｍａｒｋｅｒ
ＳＨＥＮＪｉｅ，ＤＩＮＧＸｉａｏｙｕ，ＤＩＮＧＧｅ，ＬＩＵＤｏｎｇｙａｎｇ，ＴＡＮＧＦｅｎｇ，ＨＥＪｉａ
（ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９７，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅＩＳＳＲＰＣＲｓｙｓｔｅｍｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｏｆｉｃｉｎａｌｅａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅＩＳＳＲＰＣＲｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆ
Ｄ．ｏｆｉｃｉｎａｌｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆＩＳＳＲＰＣＲｓｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｓｅｌｅｃｔｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｄｅｓｉｇｎｉｎｇｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｉｎ
ｔｈｅＩＳＳＲＰＣＲｓ，ｔｈｅｒｅｌｉａｂｌｅＩＳＳＲＰＣＲｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒＤ．ｏｆｉｃｉｎａｌｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｒｅａｓｏｎｓｆｏｒｏｃｃｕｒ
ｒｅｎｃｅｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｂａｎｄｓａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＲｅｓｕｌｔａｎｄＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌＩＳＳＲＰＣＲｓｙｓｔｅｍｉｎＤ．ｏｆｉｃｉｎａｌｅｗａｓｒｅ
ｐｏｒｔｅｄｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅ，ａｎｄ２５μＬＩＳＳＲＰＣＲｓｙｓｔｅｍｃｏｎｔａｉｎｅｄ１０×Ｔａｑｂｕｆｅｒ，１５ＵＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１２１８ｍｍｏｌ·Ｌ
－１ＭｇＣｌ２，８０
μｍｏｌ·Ｌ
－１ｄＮＴＰ，０２μｍｏｌ·Ｌ
－１ｐｒｉｍｅｒａｎｄ２０ｎｇｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ．Ｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓａｍｏｎｇ５２６０℃．ＩＳＳＲＰＣＲｓ
ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡｑｕａｎｔｉｔｙａｎｄａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｅｔｃ．ＴｈｅＩＳＳＲＰＣＲｓｙｓｔｅｍｓ，ｗｈｉｃｈ
ｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇＤ．ｏｆｉｃｉｎａｌｅ，ｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｃｌｅａｒｒｅｌｉａｂｌｅａｂｕｎｄａｎｔｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓａｎｄｗｅｒｅ
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｏｆｉｃｉｎａｌｅ；ＩＳＳＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ；ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
［责任编辑 张宁宁］
·４９２·
第３１卷第４期
２００６年２月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ３１，Ｉｓｓｕｅ ４
Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２００６