全 文 ：贵州石笔木 DNA提取与 ISSR-PCR反应体系的建立
赵杨 1 ,王秀荣1 ＊,何可权2 ,唐荣华 2　(1.贵州大学林学院 ,贵州贵阳 550225;2.贵州省独山县林场 ,贵州独山 558200)
摘要　[目的 ]利用ISSR技术对贵州石笔木的遗传多样性进行分析。 [方法 ]以贵州石笔木种子、新鲜叶片和干燥叶片为试材 ,采用改良
的CTAB法和SDS法提取贵州石笔木基因组 DNA,并对提取DNA的浓度和纯度进行测定。通过单因子梯度试验 ,筛选出优化、稳定的
ISSR-PCR反应体系。 [结果] 利用CTAB法和SDS法从石笔木叶片中提取DNA时 ,鲜叶和干燥叶片提取的DNA质量和浓度略有差别 ,
CTAB法提取的浓度稍大而蛋白残留稍多 , SDS法提取的 DNA量稍少但质量最高。而从种子中提取的DNA无论质量还是浓度均较差 ,
但尚可满足ISSR分子标记试验。贵州石笔木的适宜ISSR-PCR反应体系为 2μl的 10×Bufer,模板DNA40ng, dNTP0.25mmol/L, Taq
酶 1U,引物 0.2μmol/L,总体积为 20μl。[结论 ]该 ISSR技术体系适用于贵州石笔木遗传多样性分析。
关键词　贵州石笔木;DNA提取;ISSR反应体系
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)29-12607-04
EstablishmentofDNAExtractionandISSR-PCRReactingSystemofTutcheriakweichowensis
ZHAOYangetal　 (CollegeofForestry, GuizhouUniversity, Guiyang, Guizhou550225)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtolaythefoundationforthegeneticdiversityanalysisofTutcheriakweichowensisbyISSRtechnolo-
gy.[ Method] Thematerialsofthefreshleaves, dryleavesandseedsofTutcheriakweichowensisandtheimprovedmethodsofSDSandCTAB
wereusedfortheDNAextractionexperiment, andtheconcentrationandpurityoftheextractedDNAweredetermined.Throughsingle-factor
gradienttest, theoptimizedISSR-PCRreactionsystemwasscreenedout.[ Result] WhenextractingtheleafDNAofTutcheriakweichowensis
withthemethodsofCTABandSDS, thereweresmaldiferencesinqualityanddensitybetweenthefreshleavesanddryleaves.Therewere
higherdensityandmoreproteinresiduesbyCTABthanthosebySDS.ThequantityofDNAwithSDSwasalitlelessthanthatofCTABbut
withthehighestquality.BoththequalityanddensityofDNAextractedfromseedswereworse, butstillqualifiedforISSRmolecularmarking
experiment.TheappropriateISSR-PCRreactingconditionswereasfolows:20ulreactingsystem, 10×Bufer, 1UTaqDNAenzyme, 0.2
μmol/Lprimer, 0.25mmol/LLdNTPand40ngtemplateDNA.[Conclusion] ThisISSRreactionsystemwassuitableforthegeneticdiversity
analysisofTutcheriakweichowensis.
Keywords　Tutcheriakweichowensis;DNAexaction;ISSRreactingsystem
基金项目　贵州大学引进人才基金项目(X060055)。
作者简介　赵杨(1974–),男 ,河南信阳人 ,博士 , 副教授 ,从事林木种
质资源与遗传多样性研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2008-07-25
　　贵州石笔木(Tutcheriakwewhouensis)是山茶科石笔木属
植物 ,为贵州省特有 ,主要分布于贵州省赤水地区 ,具有良好
的果实和叶片系列保健食品生产开发前景 [ 1] 。贵州石笔木
分布区极狭 ,其自然繁殖率低 、生态环境脆弱 ,已经处于濒危
状态 [ 2] 。因此 ,开展贵州石笔木种质资源的考察 、收集和遗
传多样性研究 ,从而制定出种质资源的保存策略 ,是当前亟
需进行的工作 。
核酸提取是分子生物学试验的基础 ,对于其下游工作是
非常重要的。关于植物 DNA的提取方法虽有很多报道 ,但
不同植物组织的组分各异 ,提取 DNA的难易程度不同 。即
使是同一种植物 ,提取材料来源及保存方式都会影响到 DNA
提取的效果 [ 3-4] , ISSR(inter-simplesequencerepeats,简单重
复序列中间区域)扩增多态性是由 Zieticwiez等创建的一种
新型的微卫星类分子标记技术 [ 5] 。该技术具有操作简单 、快
速 、高效 、重复性好等优点 ,已广泛应用于遗传作图与基因定
位 、种质资源鉴定 、植物分类 、进化及遗传多样性研究 [ 6-8] 。
关于贵州石笔木总 DNA的提取方法及 ISSR-PCR反应体系
的研究还未见相关的报道 ,因此 ,笔者旨在通过 2种常用的
DNA提取方法:SDS(Sodiumdodecysulphate,十二烷基硫酸
钠)法和 CTAB(Cetyltriethylammoniumbromide,十六烷基三甲
基溴化铵)法的改良方法 ,以石笔木种子和叶片为材料 ,分别
进行 DNA的提取并对提取效果进行比较分析 ,以求找到一
个简便 、快捷而又经济的高质量石笔木基因组 DNA的提取
方法;探讨适合于石笔木种质资源 ISSR反应的适宜体系 ,为
该分子标记技术在石笔木种质资源研究和遗传育种中的应
用提供一些基础数据和技术 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　植物材料。试验用材料采自贵州赤水 ,采集石笔木
的新梢嫩叶 ,连同冰块一起放入冰壶带回实验室。蒸馏水冲
洗干净 、吸水纸充分吸干表面水分 ,一部分直接置于冰箱保
存备用 ,一部分采用硅胶干燥法快速干燥后备用;采集成熟
种子 ,常规处理后备用。
1.1.2　主要仪器与试剂 。主要仪器:紫外可见分光光度计
(LambdaBio10型 ,美国 PE公司);PCR扩增仪(PTC-200,美
国);DYY-Ⅲ型恒压恒流电泳仪(北京六一仪器公司)。主要
试剂:根据哥伦比亚大学(UniversityofColumbia)提供的 IS-
SR引物序列 ,由上海生工生物技术公司合成 20条引物 ,
Taqpolyerase、dNTP、200 bpladder均购自北京天根生化科技
有限公司 , CTAB、SDS、琼脂糖 、酚 、氯仿 、乙醇及其他试剂为
国产分析纯。
1.2　试验方法
1.2.1　贵州石笔木基因组 DNA的提取。CTAB法参照薛志
忠等油葵种子 DNA的提取方法 [ 9] ;SDS法参照何燕等提取
青稞叶片总 DNA的改进方法 [ 10] 。
1.2.2　DNA浓度及纯度检测。①紫外分光光度法检测。在
紫外分光光度计上测定各个样品在 260、230及 280nm波长
下的 OD值 ,根据 OD260 /OD280和 OD260 /OD230吸光值的比率计
算各样品中的 DNA的浓度并判断 DNA的纯度。 ②琼脂糖
凝胶电泳检测。在 0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳 ,电压 60
V,电泳时间 45 min, EB染色后观察。 ③限制性内切酶酶切
检测。吸取 10 μlDNA液 ,在 20 L反应体系中对各 DNA样
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2008, 36(29):12607-12610 责任编辑　李菲菲　责任校对　傅真治
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.29.045
品分别进行限制性内切酶 EcoRI和 HindII双酶切检测 ,酶
切反应体系中包括 10 μgDNA、各 2.5U酶;酶切反应条件为
37℃保温 2h。吸取 10μl酶切反应液 ,进行 1.0%琼脂糖凝
胶电泳检测。
1.3　ISSR-PCR反应体系的建立　参照赵杨等的方法采用
单因子梯度试验 ,即在其他因子不变的情况下按一定浓度梯
度改变某一因子 ,筛选出优化稳定的反应体系 [ 11] , PCR反应
在 PTC-200DNA扩增仪上进行。试验采用的反应程序如下:
94℃充分变性 5min,然后进行 40个循环:94℃变性 30s, 50
～60℃(根据引物而定)退火 45 s, 72 ℃延伸 2 min,最后 72
℃延伸 7 min, 4℃终止反应。PCR产物在 1.8%琼脂糖凝胶
上电泳分离 ,溴化乙锭染色显带 ,紫外光下凝胶成像系统观
察并成像。
2　结果与分析
2.1　DNA提取结果与分析
2.1.1　DNA的纯度和浓度检测结果。将用不同方法和不同
材料提取的石笔木总 DNA的紫外分光光度检测数据列为表
1。从表 1可以看出 ,就提取方法而言 , SDS法提取的 3种材
料的 DNA残留的 RAN平均较 CTAB法提取的要少 ,盐污染
的也少 ,说明纯度较高 ,但 DAN浓度较 CTAB法低;CTAB法
提取 DNA时蛋白残留较高 ,但 DNA得率也较高 ,说明 2种
方法在提取石笔木 DNA时各有优缺点。在这 3种提取材料
中 ,以鲜嫩叶片提取的 DNA浓度均值最大 ,种子的 DNA得
率最低。就 RNA污染程度而言 , 3种植物材料相差不大;也
基本无盐分残留。综合考虑 ,若对提取 DNA的质量要求较
高 ,则可考虑用 SDS法提取种子或者干燥叶片的 DNA;若要
求提取 DNA浓度高 ,可采用 CTAB法提取干燥叶片 DNA。
2.1.2　琼脂糖凝胶电泳检测结果。用不同方法和不同材料
提取的石笔木总 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 1。
从图 1可以看出 ,从叶片(鲜叶片和干燥叶片)中用 2种方法
得到的 DNA的电泳条带明暗度差不多 ,这说明 2种方法从
石笔木叶片中提取基因组 DNA的效果无多大差异;而 2种
方法从种子中提取的 DNA电泳条带较暗 ,说明从种子中提
取 DNA的浓度稍低 ,但质量并无多大差别。
表 1　不同方法从不同材料中提取的石笔木总 DNA的浓度和纯度
Table1　DensityandpurityofthegenomicDNAfromdiferentmate-
rialsandmethods
植物材料
Plantmaterial
OD260 /OD280
SDS CTAB
OD260 /OD230
SDS CTAB
浓度∥μg/μl
Concentration
SDS CTAB
种子 Seed 1.85 1.66 2.31 2.16 1.57 1.03
鲜嫩幼叶 Tenderand 1.75 1.73 2.42 1.69 2.24 2.46
freshyoungleaves
干燥叶片 Driedleaves 1.88 1.58 1.98 1.76 1.89 2.66
均值 Meanvalue 1.83 1.66 2.23 1.87 1.90 2.55
2.1.3　DNA的限制性内切酶酶切检测结果。用不同方法从
不同材料中提取的石笔木总 DNA的限制性内切酶酶切检测
结果见图 2。从图 2可以看出 ,经双酶切后 , 6份 DNA均成弥
散状态 ,说明用不同方法从不同石笔木材料中提取的总 DNA
都可被限制性内切酶完全切断。此结果还暗示 ,该试验用不
同方法从不同石笔木材料中提取的总 DNA,完全可以用于
　注:1, SDS+种子;2, SDS+鲜叶;3, SDS+干叶;4, CTAB+种子;
5, CTAB+鲜叶;6, CTAB+干叶。
　Note:1.SDS+seed;2.SDS+freshleaf;3.SDS+dryleaf;4.CTAB
+seed;5.CTAB+freshleaf;6.CTAB+dryleaf.
图 1　基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1　ElectrophoresispaternsofgenomicDNA
PCR扩增的模板 ,以进行石笔木基因组 ISSR的分析。
注:1, SDS+种子;2, SDS+鲜叶;3, SDS+干叶;4, Marker;5, CTAB
+种子;6, CTAB+鲜叶;7, CTAB+干叶。
Note:1.SDS+seed;2.SDS+freshleaf;3.SDS+dryleaf;4.Marker;
5.CTAB+seed;6.CTAB+freshleaf;7.CTAB+dryleaf.
图 2　石笔木基因组DNA的EcoRI和HindⅢ 酶切电泳图谱
Fig.2　ElectrophoresispaternofthegenomicDNAdigestedwith
EcoRIandHindⅢ
2.2　石笔木 ISSR-PCR反应体系建立的结果与分析
2.2.1　提取材料对 ISSR-PCR扩增的影响。该试验用干种
子 ,鲜嫩叶和干燥叶片均提取到了 DNA,但 3种材料 DNA获
得率及质量稍有不同。干种子 DNA得率低 ,蛋白含量也稍
高;鲜嫩叶片提取 DNA得率最高 ,质量也最好。ISSR扩增结
果表明:用石笔木的 3种的材料提取 DNA均可扩增出清晰
稳定的谱带(图 3),进行 ISSR试验都是可行的。其他植物
上也发现这种情况 [ 11] 。以上试验结果表明 ,可以结合物种
本身特点和各实验室的具体条件来确定提取 DNA所用的植
物材料 。
2.2.2　DAN模板质量浓度对 ISSR-PCR扩增的影响。 DNA
模板的质量浓度是影响 ISSR-PCR扩增效果的一个重要的因
子。在一定范围内 , PCR产量随模板浓度的升高而显著升
高 ,但模板质量浓度过高 ,又会相应增加非特异性产物的出
现。该试验在 5 ～ 200 ng/20μl之间设置了 10个模板质量浓
度梯度参加 PCR反应。根据预试验结果 ,在 20 μl的反应体
系中 ,其他成分的含量为:10×TaqBufer2 μl[ 200 mmol/L
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注:1, SDS+种子;2, SDS+鲜叶;3, SDS+干叶;4, CTAB+种子;5,
CTAB+鲜叶;6, CTAB+干叶;7, Marker。
Note:1.SDS+seed;2.SDS+freshleaf;3.SDS+dryleaf;4.CTAB+
seed;5.CTAB+freshleaf;6.CTAB+dryleaf;7.Marker.
图 3　不同DNA的 ISSR扩增结果电泳图谱
Fig.3　ElectrophoresispaternoftheISSRamplificationproduct
ofdifferentDNA
Tris-HCl;200 mmol/LKCl;100 mmol/L(NH4 )2 SO4;15
mmol/LMgCl2 ] , Taq1 U, dNTP0.20 mmol/L,引物 0.22
μmol/L,退火温度 53 ℃,结果发现 ,石笔木 ISSR对模板浓度
的许可范围较大。 5 ng/20 μl的模板浓度几乎无扩增产物 ,
10～ 60 ng/20 μl的模板浓度扩增出了较清晰 、带型基本相同
的谱带 , 100 ng/20 μl以上的模板浓度扩出的带型不很稳定。
因此 ,在以下试验中 ,模板 DNA含量选择 40ng/20μl(图 4)。
注:1～ 10分别为模板 DNA5、10、15、20、 25、 40、 60、 80、 100、200
ng/20μl。
Note:1-10areDNA5, 10, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100and200ng/20
μl, respectively.
图 4　模板浓度对 ISSR反应的影响
Fig.4　EffectsofDNAconcentrationonISSRamplification
2.2.3　dNTP浓度对 ISSR-PCR的影响。dNTP是 PCR的原
料 ,其浓度取决于扩增片段的长度 ,常用的浓度范围为 50 ～
200μmol/L,浓度过高会产生错误掺入 ,浓度太低导致产率
太低 ,甚至会因 dNTP过早的消耗而使产物单链化 。从图 5
可以看出 , dNTPs浓度在 0.04mmol/L时扩增量不足 ,条带不
甚清晰 , 0.15 ～ 0.25 mmol/L时条带基本相同 ,浓度高于 0.35
mmol/L基本无扩增产物。因此 , 0.25 mmol/L扩增产物清晰
且条带多 ,是较为理想的浓度。
2.2.4　TaqDNA聚合酶的用量对 ISSR-PCR扩增的影响 。
酶的用量是影响 PCR的一个重要因素 ,浓度过低不能扩增 ,
浓度太高产生非特异性扩增 ,且成本提高 ,造成浪费。 20 μl
注:1～ 11分别为 0.04、0.08、0.12、0.15、0.18、0.20、0.25、0.30、
0.35、0.40、0.50mmol/LdNTPs。
Note:1-11 are0.04, 0.08, 0.12, 0.15, 0.18, 0.20, 0.25, 0.30,
0.35, 0.40, 0.50mmol/LdNTPs.
图 5　dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响
Fig.5　EfectsofdNTPsconcentrationonISSR-PCRamplifica-
tion
反应体系中从 0.25 ～2.00 U设置了 8个梯度进行了扩增试
验 ,结果见图 6。由图 6可知 , 0.25～ 0.75 U时扩增谱带较少
而不清晰;0.90 ～ 1.00 U时结果稳定一致 ,重复性好;1.25 U
时带型发生变化;1.50 ～ 2.00 U时无扩增产物。由于 Taq
DNA聚合酶的成本较高 ,所以在确保试验结果稳定的前提
下 ,可采用浓度 1.00 U/20μl。
注:1～ 8分别为 0.25、0.50、0.70、0.90、1.00、1.25、1.50、2.00U
TaqDNA聚合酶。
Note:1-8are0.25, 0.50, 0.70, 0.90, 1.00, 1.25, 1.50, 2.00UTaq
DNApolymerase.
图 6　TaqDNA聚合酶对 ISSR-PCR反应的影响
Fig.6　EffectsofTaqDNApolymeraseonISSR-PCRamplifica-
tion
2.2.5　引物浓度对 ISSR-PCR扩增的影响。引物浓度会对
PCR的带型产生明显的影响 ,浓度过低不能扩增 ,浓度太高
会引起模板与引物的错配 , PCR反应特异性下降 ,且形成引
物二聚体的几率增大 [ 12] 。引物浓度一般为 0.10 ～ 0.50
μmol/L, 10个浓度梯度的试验结果表明 , 0.02 μmol/L浓度
几乎没有扩增;0.05 ～0.10μmol/L浓度下 ,产物量少 , 1.2 kb
以上片段缺失 ,稳定性差;超过 0.40 μmol/L时弥散;0.20 ～
0.40 μmol/L时条带清晰稳定(图 7)。为了减少非特异性扩
增 ,加强重复性 ,该试验在确保产量的前提下 ,采用了较低的
引物浓度 ,为 0.20 μmol/L,其结果稳定 ,重复性较好 。
2.2.6　Mg2+浓度和反应程序对 ISSR-PCR扩增的影响。该
12609　36卷 29期　　　　　　　　　　　　　　　赵杨等　贵州石笔木DNA提取与 ISSR-PCR反应体系的建立
注:1～ 10分别为 0.02、0.05、0.08、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、
0.50、0.60μmol/L引物浓度。
Note:1-10are0.02, 0.05, 0.08, 0.10, 0.15, 0.20, 0.30, 0.40,
0.50, 0.60μmol/Lprimerconcentration.
图 7　引物量对ISSR-PCR反应的影响
Fig.7　EfectsofprimerconcentrationonISSR-PCRamplifica-
tion
试验用的 Taq酶所带的 10 ×Bufer有 2种:一种含有 Mg2+
(15mmol/L),随 Bufer一起加入;另一种不含 Mg2+ ,需另加 。
试验发现 , 20μl反应体系加入 2 μl含 Mg2+的 10×Bufer即
可满足 Mg2+的需要 ,无需另加 Mg2+,这样可简化试验操作 。
另外 ,在延伸时间和循环数上借鉴了另一种山茶科植物金花
茶的 ISSR-PCR反应程序 [ 13] ,延伸时间 2.0 min, 40个循环 ,
效果良好 ,故未作进一步优化。
3　讨论
贵州石笔木 DNA提取方法的研究尚未见报道 ,从该试
验结果看出 , SDS法略优越于 CTAB法 ,虽然提取 DNA的量
稍少 ,但质量更高些 ,在材料来源没有什么限制的情况下不
失是一种高效 、快速 、经济的石笔木基因组 DNA提取法;而
CTAB法提取 DNA时得率较高 ,虽然质量不如 SDS法好 ,但
也可满足一般的分子标记的需要 ,若对于 DNA质量要求不
高 ,也可利用此法进行提取。从石笔木种子中提取到的 DNA
的浓度和纯度不如叶片中提取的高 ,但还是能满足后续的各
种分子生物学操作的要求。以石笔木种子为材料提取基因
组 DNA时 ,可以避免以叶片为材料受季节 、培育石笔木幼苗
消耗时间和物力及提取过程中需要液氮研磨等弊端 ,也是可
以考虑使用的提取 DNA的植物材料。在提取过程中 ,种皮
要去除干净 ,以减少种皮中杂质的污染并利于研磨 ,尽量在
冰上研磨 ,加入样品的量不要太多 ,以防止蛋白和 RNA去除
不彻底而导致污染 ,影响 DNA的纯度 。叶片尽量采用新鲜
幼嫩的部位。分离缓冲液的 pH值应调到 8.0,因为 DNA在
偏碱的条件下比较稳定 , RNA不稳定 。抽提时先用酚∶氯仿
(1∶1),再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提 ,以求最大限度地去除酚
和蛋白;另外 ,在叶片 DNA提取的缓冲液中要加入 2%的
3%β-巯基乙醇和 2%的 PVP,这样可以防止提出来的 DNA
显现褐色 ,而在种子的提取缓冲液中无须加入那么高浓度的
β-巯基乙醇 。该研究已经用 SDS法以石笔木种子为材料进
行了 10多份 DNA的提取 ,结果可靠。
ISSR技术是基于 PCR的一种标记 ,所以其反应条件易
受许多因素的干扰 ,如模板 DNA、TaqDNA聚合酶 、Mg2+、
dNTP、引物等浓度都能影响 ISSR-PCR扩增的结果 ,因此需
要优化固定 PCR反应的各种条件 ,以期试验得到较好的重
复。试验发现 ,石笔木 ISSR-PCR对 DNA模板的质量与浓度
要求不甚严格 ,同时用含 Mg2+的 10×Bufer即可满足体系对
Mg2+的需要 ,因而在具体的试验中 ,模板 DNA浓度和 Mg2+
可以不作为重点优化的对象。而 Taq酶的质量以及使用量
则直接影响扩增反应的成功与否 ,而且同一厂家不同批次的
产品也有可能存在一定的差异 ,因此 ,为了减少试验误差 ,应
尽量使用同一厂家同一批次生产的产品。需要指出的是 ,采
用单因子试验可以较为直观快速地得出该因子对试验结果
的影响 ,但其忽视了各因子间的互作效应 ,这样很难得到最
佳的反应体系。因此 ,在具体的试验中 ,还可做进一步的优
化 ,以期得到最佳试验结果。
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