全 文 ：复方水蛭注射液 ＨＰＬＣ指纹图谱研究
袁晓环，杨旭东，王春涛，祖国美
（牡丹江医学院 黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室，黑龙江 牡丹江 １５７０１１）
［摘要］ 目的：用高效液相色谱法测定复方水蛭注射液中次黄嘌呤的含量，并建立注射液指纹图谱，全面评价
其内在质量。方法：采用ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）色谱柱，流动相Ａ００１ｍｏｌ·Ｌ
－１ＫＨ２ＰＯ４，Ｂ５０％甲
醇，梯度洗脱的方式；流速０８ｍＬ·ｍｉｎ－１，检测波长２５４ｎｍ；柱温为室温。结果：以次黄嘌呤为参照物，建立了复方
水蛭注射液指纹图谱，标示出１５个共有峰，共有峰相似度大于０９７。结论：该方法准确、重复性好，可作为控制复
方水蛭注射液的质量依据。
［关键词］ 复方水蛭注射液；ＨＰＬＣ；指纹图谱
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１５１８２５０３
［收稿日期］ ２００８０１２７
［基金项目］ 黑龙江省卫生厅项目（２００６４０３）
［通讯作者］ 袁晓环，Ｔｅｌ：（０４５３）６５８２１５６３６４７，Ｅｍａｉｌ：ｙｕａｎｘｉａｏ
ｈｕａｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
地龙及水蛭为传统中药，药典记载二者均有通
经活络之功效［１］。复方水蛭注射液是中药水蛭与
地龙萃取物制备的针剂，临床疗效显著有活血化瘀，
通经活络之功效，用于瘀血阻络所致的缺血性中风
病［２］。对于糖尿病脑梗塞［３］、急性脑梗塞效果显
著［４］。本研究利用高效液相色谱，梯度洗脱测定复
方水蛭注射液中的次黄嘌呤，此方法分离效果好，精
密度高，稳定性好，可作为评价复方水蛭注射液质量
的一种手段。并采用国家药典委员会的“中药色谱
相似度评价系统”（２００４Ａ版）对１０批牡丹江友博
制药厂生产的复方水蛭注射液进行相似度分析，全
面评价注射液的内在质量。
１ 仪器与试药
Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高效液相色谱仪；紫外检测器及自
动进样系统（美国惠普公司 Ｇ１３１３Ａ）；国家药典委
员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件
（２００４）；超声振荡器（天鹏电子新技术有限公司ＴＰ
１５０）；次黄嘌呤对照品（批号 １４０６６１２００４０２，中国
药品生物制品检定所）；真空泵及过滤装置（德国
ＤＯＡＰ１８１ＢＮ）；超纯水仪（法国Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）。
甲醇（色谱纯）；磷酸二氢钾（分析纯）；复方水
蛭注射液（批号 ０７１２２３１，０７１２２３２，０７１２２４１，
０７１２２４２，０７１２２５１，０７１２２５２，０７１２２６１，０７１２２６２，
０７１２２７１，０７１２２７２）牡丹江友搏药业有限公司。
２ 方法与结果
２．１ 色谱条件
ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；
流动相 Ａ００１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氢钾溶液，Ｂ５０％
甲醇；梯度洗脱见表１；检测波长２５４ｎｍ；柱温为室
温；流速０８ｍＬ·ｍｉｎ－１。
表１ 梯度洗脱
ｔ／ｍｉｎ Ａ／％
０ １００
５ １００
１０ ９９
５０ ０
２．２ 对照品溶液制备
取次黄嘌呤对照品１０ｍｇ，精密称定，置１００ｍＬ
量瓶中，加００１ｍｏｌ·Ｌ－１ＫＨ２ＰＯ４溶液使溶解，并稀
释至刻度，摇匀，即得。
２．３ 水蛭药材供试品溶液的制备
取水蛭粗粉 １ｇ，精密称定，置离心管中，加
０９％生理盐水１０ｍＬ，室温放置１６ｈ，离心，取上清
液用微孔滤膜（０４５μｍ）过滤，即得。
２．４ 地龙药材供试品溶液的制备
取地龙１ｃｍ段１ｇ，精密称定，置离心管中，加
０９％生理盐水１０ｍＬ，室温放置１６ｈ，离心，取上清
液用微孔滤膜过滤，即得。
２．５ 复方水蛭注射液供试品溶液的制备
取牡丹江友搏药厂生产的复方水蛭注射液，微
孔滤膜过滤作为供试品溶液。
·５２８１·
第３３卷第１５期
２００８年８月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １５
Ａｕｇｕｓｔ，２００８
２．６ 测定方法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各１０μＬ，
注入液相色谱仪，运行时间５０ｍｉｎ，色谱图见图１。
Ａ．次黄嘌呤标准品（ｓ峰）；Ｂ．地龙；Ｃ．水蛭；Ｄ．复方水蛭注射液；
１～１５为共有峰
图１ 次黄嘌呤对照品及药材和复方水蛭注射液ＨＰＬＣ图
２．７ 方法学考察
２．７．１ 系统适应性试验 取对照品溶液按测定方
法进样，按次黄嘌呤计算理论板数为１１０００。
２．７．２ 精密度试验 取同一复方水蛭注射液，按上
述色谱条件连续进样５次。结果表明，各色谱峰的
保留时间和相对保留面积的ＲＳＤ均小于３０％。
２．７．３ 重复性试验 分别精密量取同一复方水蛭
注射液５份，按以上检测方法重复进样，各色谱峰的
保留时间和相对保留面积的ＲＳＤ均小于３０％。
２．７．４ 稳定性试验 取同一注射液，分别于０，２，
４，６，１２ｈ检测，结果表明各色谱峰的相对保留时间
和相对保留面积的ＲＳＤ均小于３０％。
２．８ 样品测定
２．８．１ 指纹图谱分析 取１０批复方水蛭注射液，
按２．６测定方法，在上述色谱条件下进行操作，结果
显示水蛭注射液有１５个共有峰，以次黄嘌呤峰为参
比峰（ｓ），将其保留时间（１２８７３ｍｉｎ）和峰面积
（２５５１２０３）定为１０，计算其他各峰的相对保留时
间和相对峰面积的比值，结果见表２。
表２结果显示水蛭注射液有１５个共有峰，各色
谱峰与主峰的相对保留时间的 ＲＳＤ在 ０２３％ ～
１６５％，结果 ＜３％；单峰相对峰面积的 ＲＳＤ大于
３％的有 １２号（６２５）、１４号 （４７６）、１５号峰
（３８５），但它们占总面积的比值分别为０７３％，
表２ １０批复方水蛭注射液各色谱峰保留情况（ｎ＝１０）
峰号 ｔ ｔＲ ＲＳＤ／％ 峰面积 相对峰面积 ＲＳＤ／％ 总面积 占总面积比／％
１ ４３６２ ０３３９±０００３ ０８８ １９８９９４±００３９８ ００７８±０００２ ２５６ ５５６６７２３ ３５７
２ ６２１４ ０４８３±０００８ １６５ １６５８２８±００１６６ ００６５±０００１ １５４ ２９８
３ ７０４２ ０５４７±０００７ １２８ ７０４１３２±０１４０８ ０２７６±０００２ ０７２ １２６５
５ ９４７２ ０７３６±０００６ ０８２ １１７３５５±００１１７ ００４６±０００１ ２１７ ２１１
Ｓ １２８７３ １０００±０００６ ０６０ ２５５１２０３±０１５８０ １０００±０００１ ０１０ ４５８３
６ １５４６４ １２０１±０００５ ０４２ ２９３３８８±００８８０ ０１１５±０００３ ２６１ ５２７
７ １７７９７ １３８３±０００６ ０４３ ２８５７３５±００５７１ ０１１２±０００２ １７９ ５１３
８ １９５０９ １５１５±０００９ ０５９ １１２２５３±００１１２ ００４４±０００１ ２２７ ２０２
９ ２２２１９ １７２６±０００７ ０４１ ２７８０８１±００８３４ ０１０９±０００３ ２７５ ５００
１０ ２２８８０ １７７７±０００６ ０３４ ３０６１４４±００３０６ ０１２０±０００１ ０８３ ５５０
１１ ２７１３０ ２１０７±０００９ ０４３ ２３２１５９±００２３２ ００９１±０００１ １１０ ４１７
１２ ２７８４０ ２１６３±０００５ ０２３ ４０８１９±０００４１ ００１６±０００１ ６２５ ０７３
１３ ３０５６０ ２３７４±０００６ ０２５ １６０７２６±００１６１ ００６３±０００１ １５９ ２８９
１４ ３３２７５ ２５８５±０００９ ０３５ ５３５７５±０００５４ ００２１±０００１ ４７６ ０９６
１５ ３５４８９ ２７５７±２００９ ０３３ ６６３３１±０００６６ ００２６±０００１ ３８５ １１９
０９６％，１１９％均小于 ５％。其余各峰相对面积的
ＲＳＤ在０１０％～２７５％，结果＜３％，符合要求。
２．８．２ 指纹图谱相似度分析 取１０批注射液图
谱，以０７１２２６２谱图为标准，通过“中药色谱相似度
评价系统”（２００４Ａ版）［５］，经计算机评价注射液，匹
配图见图２，相似度结果见表３。结果显示相似度在
０９７０～１０００，均大于０９５，作者建立的指纹图谱
方法可以用来评价注射液的质量。
·６２８１·
第３３卷第１５期
２００８年８月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １５
Ａｕｇｕｓｔ，２００８
图２ 复方水蛭注射液指纹图谱匹配图
表３ 复方注射液不同批次间的相似度（Ｒ＝１０００）
批号 相似度 批号 相似度
０７１２２３１ ０９７６ ０７１２２５２ ０９８１
０７１２２３２ ０９７９ ０７１２２６１ ０９８２
０７１２２４１ ０９７８ ０７１２２６２ １０００
０７１２２４２ ０９８０ ０７１２２７１ ０９７０
０７１２２５１ ０９８２ ０７１２２７２ ０９７０
２．９ 药材与注射液的相关性
分别取水蛭药材供试品溶液和地龙药材供试品
溶液按２．６测定方法，在上述色谱条件下进行操作，
得到各药材ＨＰＬＣ指纹图谱（图１，ＢＣ），与复方水蛭
注射液指纹图谱（Ｄ）相比较，在注射液指纹图谱中，
１，２，８，１１，１３，１４，１５号峰为水蛭药材特有峰，９，１０号
峰为地龙药材特有峰，３，５，ｓ，６，７，１２号峰为水蛭、地
龙药材共有峰。由此可见复方水蛭注射液与水蛭药
材和地龙药材指纹图谱之间具有较好的相关性。
３ 讨论
考察了多种流动相系统（纯水，甲醇水，甲醇
冰醋酸水溶液，乙腈冰醋酸水溶液，甲醇磷酸盐溶
液）对分离的影响，发现以甲醇磷酸盐溶液为流动
相分离效果较好，各峰分离度较大，基线平稳，保留
时间适中，方法的稳定性、精密度、重现性较好。
考察了多种色谱柱，注射液按上述方法分别用
ｚｏｒｂａｘＣ８，ＺｏｒｂａｘＸＤＢ－Ｃ１８，ＡｇｉｌｅｎｔＥｘｔｅｎｄ－Ｃ１８，
ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱进行洗脱，结果表明ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱洗
脱出的色谱峰多，分离度好。
用移液管移取复方水蛭注射液２ｍＬ于１００ｍＬ
量瓶中，加蒸馏水至刻度，同时做空白实验。用紫外
分光光度计进行扫描，注射液在波长２５４ｎｍ处有最
大吸收，考察了２３０，２４０，２５４，２８０ｎｍ等波长下的检
测情况，结果证实在２５４ｎｍ下色谱峰较多，对应色
谱峰的信噪比较大，基线平稳，确定２５４ｎｍ为最佳
检测波长。
结果显示复方水蛭注射液与地龙药材、水蛭药
材有较好的相关性，不同批次注射液的色谱图谱的
相似度均大于０９７，共有峰面积比值及其差值，非
共有峰总面积百分比均符合《中药注射剂指纹图谱
的技术要求（暂时）》的有关规定，表明本方法可以
作为该注射液的质量评价方法。
［参考文献］
［１］ 中国药典．一部［Ｓ］．２００５：５７，９２．
［２］ 刘玉娟，杨茂林，连淑芬，等．疏血通治疗缺血性中风１０８例观
查［Ｊ］．实用中医学杂志，１９９９，１５（１２）：３．
［３］ 张 立．疏血通治疗糖尿病脑梗塞４０例［Ｊ］．辽宁中医杂志，
２００４，３１（２）：１１９．
［４］ 刘宪平，常建军．疏血通治疗急性脑梗死的临床研究［Ｊ］．临床
荟萃，２００３，１８（４）：２１４．
［５］ 国家药品监督管理局．中药注射液指纹图谱研究的技术要求
（暂时）［Ｊ］．中成药，２０００，２０（１０）：３９１．
ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｏｆｃｏｈｉｒｕｄｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
ＹＵＡＮＸｉａｏｈｕａｎ，ＹＡＮＧＸｕｄｏｎｇ，ＷＡＮＧＣｈｕｎｔａｏ，ＺＵＧｕｏｍｅｉ
（ＨｅｉＬｏｎｇｊｉａｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｔｉＦｉｂｒｏｓｉｓＢｉｏｔｈｅｒａｐｙ，ＭｕｄａｎｊｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ１５７０１１，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＵｓｉｎｇＨＰＬＣＴｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｉｎｃｏｈｉｒｕｄｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎｆｏｒｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｉｔｓＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ，
ａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｎｇｉｔｓｉｎｔｅｒｎａｌｑｕａｌｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｅｐａｒａｔｉｏｎｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（４６ｍｍ×２５０
ｍｍ，５μｍ）．ＡｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈＡ（００１ｍｏｌ·Ｌ－１·ＫＨ２ＰＯ４）ａｎｄＢ（５０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ）ｗａｓｕｓｅｄ，ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ０８
ｍＬ·ｍｉｎ－１，ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓｓｅｔａｔ２５４ｎｍ，ａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓａｔｎｏｒｍａｌ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｗａｓｕｓｅｄ
ａｓｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｉｎｔｈｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｏｆｃｏｈｉｒｕｄｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｉｔｓｈｏｗｅｄ１５ｃｏｍｍｏｎｐｅａｋｓａｎｄｔｈｅｉｒｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｔｈｒｅｓｈｏｄｗａｓ０９７．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓａｃｃｕｒａｔｅ，ｒｅｐｅａｔａｂｌｅａｎｄｕｓｅｆｕｌｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃｏｈｉｒｕｄｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃｏｈｉｒｕｄｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ＨＰＬＣ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
［责任编辑 鲍 雷］
·７２８１·
第３３卷第１５期
２００８年８月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １５
Ａｕｇｕｓｔ，２００８