全 文 :#研究论文 #
基于叶绿体 µ ατ基因序列探讨 ts种石杉科石杉
属植物的系统关系及分子鉴定
姬生国 tov o潘胜利 t o王 峻 t o霍克克 u3
ktq复旦大学 药学院 o上海 usssvu~ uq复旦大学 生命科学学院 o上海 usswvv~
vq郑州大学 药学院 o河南 郑州 wxssxul
≈摘要 目的 }利用叶绿体 µ ατ基因序列探讨 ts种石杉属植物的系统发育及分子鉴定 ∀方法 }分别从 |种
石杉属植物中提取总 ⁄o经扩增纯化后 o用 °≤ 产物直接测序 ∀结果 }对石杉属 Ηυπερζια
µ¨±«q |个种的叶绿体
µ ατ基因进行了测序 o序列长度为 t x{| ¥³o并对 ts个种 k亮叶石杉 Η. λυχιδυλα的 µ ατΚ基因序列从 ±¨
¤±®中下
载 l的 µ ατ序列进行比对 o其中有 vx个系统发育信息位点及 vx个变异位点 o以垂穗石松 Λψχοποδιελλα χερνυα为外
类群 o利用 ∞ v1t软件计算种与种之间的遗传距离在 t1x|h ∗ s1uxh o并构建系统树 o获得最简约树和邻接
树 ∀结论 }小杉兰组和蛇足石杉组植物分别聚成一枝 o构成姊妹群 o其靴带支持率分别为 |{h和 ||h ∀长柄石杉
与蛇足石杉分别聚在 u个不同进化枝 o二者间有 t|个碱基差异 o遗传距离为 t1uth ∀建议应将长柄石杉单独列为
一个种 ∀
≈关键词 石杉属 ~µ ατΚ基因 ~系统发育 ~分子鉴定
≈中图分类号 ≥ xyz ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukusszlt|2t|zt2sx
≈收稿日期 ussy2tt2sz
≈通讯作者 3 霍克克 oר¯}ksutlyxywvsuvo∞2°¤¬¯}®®«∏²ussu
tyvq¦²°
石杉科 ∏³¨ µ½¬¤¦¨¤¨植物为多年生小型草本植物 o
土生 !附生或生于苔藓层中 o喜阴凉潮湿环境 ∀石杉科
植物中含有多种化学成分 o其中有生物碱类 !黄酮类 !
三萜类化合物等 ≈t2v o生物碱类成分石杉碱甲 k«∏2
³¨ µ½¬±¨ o«∏³2l是其主要有效活性成分 ≈wox ∀经药理
实验证明它有强效 !高选择性的抗乙酰胆碱酯酶活性
及提高学习和改善老年人记忆功能的作用 ≈yoz ∀石杉
科植物属于蕨类植物 o生长速度缓慢 o生长周期很长 ∀
从孢子萌发到长成植株通常需 { ∗ ts年时间 ∀由于它
扎根浅表 o采集时被连根拔起后便不能再生 ∀随着以
«∏³2为主要成分的药品在临床上的广泛应用 o造成了
以提取 «∏³2为原料的石杉科植物资源的极度匮乏 ∀
不同种的石杉科植物中石杉碱甲的含量差异很大 o甚
至有的种中几乎不含该成分 ≈{2ts ∀选择石杉碱甲含量
高的植株 o进行组织培养或者利用扦插技术进行繁殖
是解决石杉科植物资源短缺的快捷途径 ∀但是 o石杉
科植物由于植株矮小 o个别种之间在形态上很难区分 o
特别是石杉属中的长柄石杉与蛇足石杉 o伏贴石杉 !东
北石杉 !小杉兰之间利用形态学的特征很难鉴定 o针对
这一状况 o作者利用分子生物学的方法 o通过种间的遗
传距离及基因序列的碱基差异对其进行鉴定 o期望为
石杉属植物的种间鉴定提供参考依据 ∀
石杉科植物分为 u属约 txs种 o广布于全世界 o
尤以热带中南美洲为最多 o我国有 u属近 xs种 o广
布全国 ≈tt ∀张丽兵 ≈tuotv 先后对我国的石杉科石杉
属 Ηυπερζια
µ¨±«q植物进行了分类 o并将其分为小
杉兰组 k≥ ¦¨·q Ηυπερζιαl和蛇足石杉组 k≥ ¦¨·q Σερρα2
ταεlu个组 o记述前者 tu个种 t个变种 o后者 tu个
种 ∀但从分子水平对我国石杉属植物系统进化的研
究 o迄今未见国内有关资料发表 ∀
µ ατk²µ©l基因位于叶绿体 τρν基因的内含
子中 o长约 t yss ¥³o编码一种参与 转录体中
µ型内含子剪切的成熟酶 ≈tw o是叶绿体基因组的蛋
白编码区中进化最快的基因之一 ≈tx ∀在科 !属级水
平 oµ ατΚ序列分析为研究类群内部的系统重建提供
了较多的信息和较高的支持率 ≈ty2t| ∀在某些类群
中 oµ ατ序列的核苷酸变化也为种间 !种下的系统
进化研究提供了一定的价值 ≈us2uu ∀
本研究通过石杉属 ts个种植物 k其中 |个种为
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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作者采集的标本 o亮叶石杉 Ηυπερζια λυχιδυλα的
µ ατ基因序列从 ±¨¥¤±®中下载 l及外类群石松科
垂穗石松 Λψχοποδιελλα χερνυα的 µ ατ基因序列分
析 o构建系统树 o并在此基础上结合一些重要的形态
性状及地理分布信息探讨其种间的系统进化关系 o
以及种间的分子鉴定 ∀
1 材料与方法
1q1 材料 实验材料包括石杉属 |种植物 o为采集
的新鲜植物标本 k由复旦大学药学院潘胜利教授鉴
定 lo来源及来自 ±¨¥¤±®序列的序号见表 t∀
表 t 本实验中用于 µ ατ基因序列研究的样品信息
分类群 采集地点及日期 标本号 基因库序列号
石杉科 小杉兰组 ≥ ¦¨·q Ηυπερζια
伏贴石杉 Η. αππρεσσα 吉林安图 o长白山 oussu2s{ ssst ⁄±wyx|xy
中华石杉 Η. χηινενσισ 陕西 o太白山 ousst2sw sssu ⁄±wyx|xz
东北石杉 Η. µ ιψοσηιανα 吉林安图 o长白山 oussx2s| ≤ ssst ⁄±wyx|ys
南川石杉 Η. νανχηυανενσισ 重庆南川 o金佛山 oussw2s| ≤ssst ⁄±wyx|yt
小杉兰 Η. σελαγο 吉林安图 o长白山 oussx2s| ≤ sssu ⁄±wyx|yu
蛇足石杉组 ≥ ¦¨·q Σερραταε
皱边石杉 Η. χρισπατα 湖南怀化 o雪峰山 oussx2sx ÷ssst ⁄±wyx|x{
长柄石杉 Η. λονγιπετιολατα 湖南怀化 o雪峰山 oussx2sx ÷sssv ⁄±wyx|x|
蛇足石杉 Η. σερρατα 湖南怀化 o雪峰山 oussx2sx ÷sssw ⁄±wyx|yv
四川石杉 Η. συτχηυενιανα 湖南怀化 o雪峰山 oussx2sx ≥∞sssu ⁄±wyx|yw
亮叶石杉 Η. λυχιδυλα ≤ssy{yt
石松科 垂穗石松 Λψχοποδιελλα χερνυαk外类群 l ≠{uyv||
1q2 试剂与仪器 ⁄微量提取试剂盒 !°≤ 扩
增产物纯化试剂盒 k北京天为时代科技有限公司 l∀
×µ¬¶碱 !琼脂糖 k上海爱紫特生物科技有限公司 lo
Ταθ⁄聚合酶 ots ≅ Ταθ缓冲液 !§×° °¬¬k§×°o
§≤×°o§×°o§××°各 u1x °°²¯ # pt loΚ⁄≈⁄
¤µ®¨ µ×¤¤ ¤宝生物工程 k大连 l有限公司 o°≤
扩增引物合成 k上海博亚生物技术有限公司 lo其他
试剂均为分析纯 ∀ ⁄ p vzxus型台式离心机 k德国
∞³³¨ ±§²µ©公司 lo°×≤ ptss型 °≤ 仪 k美国 2¨
¶¨¤µ¦«公司 lo电泳仪 k⁄⁄≠ p ¶ o北京六一仪器厂 lo
凝胶成像系统 k上海复日技术公司 l∀
1q3 总 ⁄制备 实验样品经乙醇消毒和蒸馏水
洗净后 o硅胶干燥 o取每一个种单株植物在液氮中研
磨成细粉 o取 s1t ªo用 ⁄提取试剂盒 o按说明书
操作提取总 ⁄∀吸取 ⁄溶液 v Λ在 t1sh琼
脂糖凝胶上用 s1t ≅ ×∞电泳缓冲液电泳仪中电
泳 o∞
染色 o∂ 灯光下照相 ∀ ⁄长度与 Κ⁄
分子标记物比较 ∀
1q4 引物设计 °≤ 引物根据 ²¬等 ≈uv 使用的
引物 o利用 °µ¨°¬¨µx1s软件设计 o由上海英俊生物
技术有限公司合成 o见表 u∀
1q5 °≤ 扩增反应和测序 取 ⁄ xs ∗ tss ±ª作
为模板 o加入 §×° s1v Λos1ux Λ°²¯ # pt引物 u
Λot Ταθ⁄聚合酶 s1x Λ及 ts ≅ Ταθ缓冲液 x
Λ使最终反应体积达到 xs Λo置于 °≤ 仪 o按下
表 u 用于石杉属植物 µ ατ基因 °≤ 扩增及测序的引物
方向 引物名称 xχ vχ xχ端
正向 µ ατΚ tƒ ××≤×≤×≤×≤××××≤×× t
正向 µ ατΚ uƒ ×≤×≤××≤ xvw
正向 µ ατΚ vƒ ××≤≤×≤≤ {sv
反向 µ ατΚ t ××≤≤×≤≤×≤≤× t sww
反向 µ ατΚ u ≤×≤××××≤×≤ t zs|
述参数进行 ∀ °≤ 反应程序为 }|w ε 预变性 w °¬±~
接下来 |w ε 变性 xs ¶oxx ε 退火 |s ¶ozu ε 延伸 ys
¶ovs个循环 ~最后 zu ε 保温 z °¬±∀取 °≤ 反应液
v Λ于 t1sh琼脂糖凝胶上电泳 o∞
染色 o∂灯光
下照相 ∀ ⁄长度与 u ®¥⁄ ¤µ®¨ µ分子标记物
比较 ∀取目标产物条带用胶回收纯化试剂盒纯化后
直接用于测序反应 ∀测序反应委托上海联众基因研
究院使用
vzz测序仪 k±√¬·µ²ª¨ ±× l测序完成 ∀
1q6 序列分析和系统树的构建 测得的 ⁄序列
经 ≤ ∏¯¶·¤¯ ÷ t1{≈uw 软件排序 o个别位点手工校对 ∀以
石松科植物垂穗石松为外类群 o使用 ∞ v1t≈ux 软
件进行系统发育分析并分别计算各个种之间的差异
性 k®¬°∏µ¤u2³¤µ¤° ·¨¨µl∀空位 k¤³l被处理为缺失
k°¬¶¶¬±ªlo以简约法 k°¤¬¬°∏° ³¤µ¶¬°²±¼o °l和邻
接法 k±¨ ¬ª«¥²µ2²¬±¬±ªol≈uy 构建系统分枝树 o利用
¥²²·¶·µ¤³kt sss次重复 l检验各分支置信度 ≈uz ∀
2 结果与分析
本试验测得 |种石杉属植物的 µ ατ基因序列
长度为 t x{| ¥³o其中发现 vx个系统发育的信息位
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点及 vx个变异位点 ∀选择与石杉科亲缘关系相近
的石松科中的垂穗石松 Λ. χερνυα为外类群 o对石杉
属 ts个种的 µ ατ基因序列进行分析 o构建最大简
约树 k °l和邻接树 klo构建出的 u种拓扑树是
一致的 o在这里仅展示简约树如图 t∀树长为 vy|
步 o一致性指数 kΧΙl为 s1{|t yo维持性指数 kΡΙl为
s1{u| w∀各种之间的 µ ατ基因序列差异性见表
uo种与种之间的遗传距离在 t1x|h ∗ s1uxh o平均
遗传距离为 s1tszh ∀
图 t ts种石杉属植物 µ ατ基因序列构建的简约树
枝上的数字为 t sss次重复的
²²·¶·µ¤³百分率 o低于 xsh的
值未标示 ∀ Χ s1{|t yoΡΙ s1{u| w
系统树显示小杉兰组和蛇足石杉组植物分别聚
于不同进化枝 o形成 u个据群 o其靴带支持率分别为
|{h和 ||h ∀在小杉兰组进化枝内部伏贴石杉 Η.
αππρεσσα和南川石杉 Η. νανχηυανενσισ聚为一支具有
|uh的内部支持率 ~东北石杉 Η. µ ιψοσηιανα和小杉
兰 Η. σελαγο聚为一支 o支持率为 |zh o中华石杉 Η.
χηινενσισ单独为一支 ∀而蛇足石杉组进化枝内部蛇
足石杉 Η. σερρατα和亮叶石杉 Ηυπερζια λυχιδυλα聚为
一小支 o内部支持率为 |th o长柄石杉 Η. λονγιπετιο2
λατα!四川石杉 Η. συτχηυενιανα和皱边石杉 Η. χρισπ2
ατα聚为一小枝 o支持强度为 y|h ∀
3 讨论
基于 °¤·基因序列构建的系统树 k图 tl可以
看出 o小杉兰组和蛇足石杉组植物分别聚成一支 o并
构成姊妹群 o这一结果与张丽兵等 ≈tuotv 从形态学上
对石杉属的属下分组结果一致 ∀但是 o对于长柄石
杉的分类存在着不同的观点 o在形态学分类上张丽
兵等 ≈tu 认为其为蛇足石杉的一个变种 o并认为对于
象蛇足石杉这样世界广布的种要用大一些的分类概
表 u 石杉属植物种与种二者之间 °¤·基因序列间差异
序号 种名 t u v w x y z { | ts
t Η. αππρεσσα p ty tt | ts us us ut uw us
u Η. χηινενσισ s1sts t p tv tx ty uw uu tv us ty
v Η. µ ιψοσηιανα s1ssz s s1ss{ u p tw tt ut ux uu ux ut
w Η. νανχηυανενσισ s1ssx z s1ss| x s1ss{ | p tt tx t| uu ut ut
x Η. σελαγο s1ssy v s1sts t s1ssz s s1ssz s p us us tz uu tw
y Η. χρισπατα s1stu z s1stx v s1stv w s1ss| x s1stu z p ty ut tu tw
z Η. λονγιπετιολατα s1stu z s1stw s s1stx | s1stu t s1stu z s1ssy v p t| w tu
{ Η. σερρατα s1stv v s1ss{ u s1stw s s1stw s s1sts { s1stv w s1stu t p t| |
| Η. συτχηυενιανα s1stx v s1stu z s1stx | s1stv v s1stw s s1ssz y s1ssu x s1stu t p tw
ts Η. λυχιδυλα s1stu z s1sts t s1stv w s1stv w s1ss{ | s1ss{ | s1ssz y s1ssx z s1ss{ | p
注 }左下角为种与种之间的遗传距离 o右上角为种与种序列之间的碱基差异 o加粗部分为遗传距离大于 th
念 o将蛇足石杉的变种和变型予以归并 o而杨纯
瑜 ≈u{ 则鉴于长柄石杉在外形上 /粗枝大叶 0和化学
成分石杉碱甲的含量明显高出原变种 o将其单独划
分为一个种 ∀从分子系统学的研究结果看 o在严格
一致树中长柄石杉和蛇足石杉分别聚在不同的进化
枝 o而通过基因序列比较发现 o二者之间存在有 t|
个碱基差异 o遗传距离为 t1uth o该结果是对将长
柄石杉单独列为一个种的支持 ∀在分子鉴定上 o以
上 u个种与四川石杉均采集地相同 o生长环境相同 o
有的地方几个种生长在一起 o形态上也难以区分 o严
格一致树中四川石杉和长柄石杉聚为一枝 o支持率
为 |th o而蛇足石杉聚于其姊妹枝 o通过序列比对 o
四川石杉与长柄石杉和蛇足石杉之间均有 t|个碱
基差异 o遗传距离分别为 s1uxh和 t1uth o该基因
可以将形态上难以区分的种进行鉴定 ∀
伏贴石杉与小杉兰在形态上相似 o对于伏贴石
杉的归属 o张丽兵等 ≈| 从形态学上先将其单独列为
一个种 o后来又主张并入小杉兰 ≈u| ∀本研究结果显
示伏贴石杉和小杉兰分别聚于不同的进化枝 o二者
之间的遗传距离为 s1yvh o虽然低于种间平均遗传
距离 o但在 µ ατ基因序列之间有 ts个碱基差别 o
显示出二者的不同 o提示应为 u个独立的种 ∀
东北石杉和伏贴石杉均属于小杉兰组 ≈tu o形态
相似 o且生长环境相同 o同时采集于东北长白山地
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区 o但在严格一致树中分别聚在 u个树枝 o通过
µ ατ基因序列比对 o二者间有 tt个碱基差异 o遗传
距离为 s1zh ∀显示出二者在分子鉴定中的差别 ∀
本研究首次利用叶绿体 µ ατ基因序列对 ts
种石杉属植物分子系统关系及分子鉴定进行了研
究 o确立了石杉属植物之间的系统关系 o并且为该属
植物种间的分子鉴定提供了可靠的依据 o为石杉科
植物的资源开发和利用提供了可靠的信息 ∀
≈参考文献
≈t 鲁翠涛 o梅兴国 o钟 凡 q千层塔植物茎叶中黄酮类物质的研
究 ≈ q天然产物研究与开发 oussuotwkvl}uzq
≈u 裴 刚 o周朴华 o何桂霞 o等 q皱边石杉脂溶性化学成分的研
究 ≈ q天然产物研究与开发 ousswotykvl}utvq
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≈z ¬∏≥o «∏≠ o ≠∏≤ o ·¨¤¯q ׫¨ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ²©∏³ ¤±§
o ·º²± º¨ ¤¯®¤¯²¬§¶ ¬¨«¬¥¬·¬±ª°¤µ®¨ §¤±·¬¦«²¯¬± ¶¨·¨µ¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼
≈ q ≤¤± ≤«¨ °o t|{yoyw}{vzq
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杉碱甲的含量 ≈ q中草药 oussvovwkzl}yszq
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≈tu 张丽兵 o孔宪需 q中国石杉属 k狭义 l小杉兰组的分类学研究
≈ q植物分类学报 ot||{ovykyl}xutq
≈tv 张丽兵 o孔宪需 q中国石杉属 k狭义 l蛇足石杉组的分类研究
≈ q植物分类学报 ousssov{ktl}tvq
≈tw ¨ ∏«¤∏¶ o ¬±® q ׫¨ ¦«¯²µ²³¯¤¶·· ¼¶kl ª¨ ±¨©µ²°
°∏¶·¤µ§kΣιναπσισαλβαl ¦²±·¤¬±¶¤¦¯¤¶¶¬±·µ²± ³²·¨±·¬¤¯ ¼¯ ¦²§2
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¶¬±ª·«¨ ¥²²·¶·µ¤³≈ q ∞√²¯∏·¬²±o t|{xov|}z{vq
≈u{ 杨纯瑜 q中国石松目植物的修订 ≈ q军事医学科学院院刊 o
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≈u| 张宪春 o张丽兵 q中国植物志 ≈ q第 y卷 q第 v分册 q北京 }科
学出版社 oussw}tq
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ t|
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Πηψλογενψ ρελατιονσηιπ ανδ µ ολεχυλαρ ιδεντιφιχατιον οφ τεν Ηυπερζια σπεχιεσ
(Ηυπερζιαχεαε) βασεδ ον µ ατΚ γενε σεθυενχεσ
≥«¨ ±ª2ª∏²tov o °≥«¨ ±ª2¯¬t o • ∏±t o ¨ 2®¨ u
(t. Σχηοολοφ Πηαρµ αχψ, Φυδαν Υνιϖερσιτψ, Σηανγηαι usssvu, Χηινα;
u. Σχηοολοφ Λιφε Σχιενχεσ, Φυδαν Υνιϖερσιτψ, Σηανγηαι usswvv, Χηινα;
v. ΣχηοολοφΠηαρµ αχψ, Ζηενγζηου Υνιϖερσιτψ, Ζηενγζηου wxssxu, Χηινα)
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[ Κεψ ωορδσ] Ηυπερζια
µ¨±«~ µ ατª¨ ± ~¨ ³«¼¯ ²ª¨ ±¼~ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¬§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²± ≈责任编辑 张宁宁
≈收稿日期 ussy2sx2tu
≈基金项目 重庆市科委攻关项目 ky|ytl
≈通讯作者 3 彭锐 oר¯}ksuvl{|su|t|s
补骨脂种苗质量与影响因素分析
彭 锐 3 o陈大霞 o李隆云 o钟国跃
k重庆市中药研究院 o重庆 wsssyxl
≈摘要 目的 }研究施肥 !不同育苗措施 !播种期和播种密度对补骨脂壮苗的影响 ∀方法 }田间播种和室内测
量相结合 ∀结果 }各项农艺措施对补骨脂的壮苗均有影响 ∀结论 }补骨脂的适宜播期为 v月中上旬 o适宜播种密度
txs ®ª# «° pu o播种时应采取保温保湿措施 o施肥以有机肥和化学肥料配合施用为宜 ∀
≈关键词 补骨脂 ~种苗质量 ~农艺措施
≈中图分类号 ≥ xyz ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukusszlt|2t|zx2sw
育苗是中药材规范化种植的重要环节之一 o秧苗
质量的优劣直接关系到中药材的生长发育 !品质和产
量 o对中药的现代化 !产业化和规范化起到很大的推动
作用 o关于中药材壮苗质量的秧苗形态描述较多 o但数
量指标的研究报道较少 ∀科学研究和生产实践的结果
证明 o应用不同质量的秧苗对其产量影响很大 ≈tou ∀
补骨脂 Πσοραλεα χορψλιφοια q为豆科一年生植物 o
果实入药 o以育苗移栽为主的药用植物 o具有温补肾
阳 o补精益髓 o健脾散寒等功效 o是常用中药 o补骨脂种
苗质量与环境因素的关系尚未见报道 ∀笔者于 ussv
至 ussw年在补骨脂道地产区重庆合川市对补骨脂种
苗质量与苗期施肥水平 !种类 !育苗处理方式 !播期和
密度的关系进行研究 o为补骨脂种苗质量标准和育苗
生产中运用适当的技术措施 o培育壮苗提供依据 ∀
1 材料与方法
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第 vu卷第 t|期
ussz年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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