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Study on fingerprint of Cortex Fraxini with HPLC

秦皮药材HPLC指纹图谱研究



全 文 :秦皮药材 HPLC指纹图谱研究
刘丽梅1,陈 琳1,王瑞海1,杨 庆2,翁小刚2,王 丽3
(1.中国中医科学院 中医基础理论研究所,北京 100700;
2.中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;
3.哈药集团 三精制药股份有限公司,黑龙江 哈尔滨 150069)
[摘要] 目的:建立秦皮药材的指纹图谱,为科学评价秦皮质量提供参考依据。方法:采用高效液相色谱技
术,AgilentExtendC18柱(46mm×250mm,5μm),甲醇04% 醋酸水溶液梯度洗脱,检测波长0~60min,340nm;
60~74min,254nm;74~75min,340nm,柱温40℃,流速15mL·min-1。4个品种药材各测定10批,分别建立指
纹图谱。结果:指纹图谱研究的各项参数均符合有关规定,苦枥白蜡树10批药材有15个共有峰,尖叶白蜡树10
批药材有11个共有峰,白蜡树10批药材有11个共有峰,宿柱白蜡树10批药材有19个共有峰,秦皮药材40批药
材有5个共有峰,与对照图谱相比较,每个品种药材指纹图谱相似度均在096以上。40批秦皮药材指纹图谱相似
度大于090,40批药材中检测出4个有效成分(秦皮甲素,秦皮乙素,秦皮苷,秦皮素)及1个未知成分。结论:建
立了苦枥白蜡树树皮,白蜡树树皮,尖叶白蜡树树皮,宿柱白蜡树树皮指纹图谱及秦皮药材的指纹图谱,方法学考
察结果符合指纹图谱技术要求。
[关键词] 秦皮药材;HPLC;指纹图谱
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)24293204
[收稿日期] 20071030
[基金项目] 北京市自然科学基金项目(706308)
[通讯作者] 刘丽梅,Tel:(010)640144112592,Email:li
ulimeihrb@sinacom
  秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树 Fraxinusrhyn
chophylaHance,白蜡树 F.chinensisRoxb.,尖叶白
蜡树F.chinesisvar.acuminataLingelsh.,宿柱白蜡
树F.stylosaLingelsh.的干燥枝皮或干皮,苦、涩、
寒,归肝、胆、大肠经,具有清热燥湿、收涩、明目的功
能[1]。现代药理实验表明,秦皮具有抗菌、消炎、镇
静、利尿、镇咳、祛痰和平喘等作用。4个品种的秦
皮,其药材产地分布较广,采收期为春、秋二季,这使
得商品秦皮的质量往往有差异。为了系统,完整的
反映秦皮药材的内在质量,本研究根据国家药典委
员会颁布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求
(暂行)》[2],采用高效液相色谱法对不同产地、不同
品种的秦皮药材进行了指纹图谱的研究。
1 材料
Agilent1100高效液相色谱仪(包括 G1311A四
元泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B
DAD检测器、HP化学工作站,美国 Agilent公司);
Sartorius电子天平CP225D。
甲醇为 GR,其他试剂为 AR,水为纯净水。秦
皮甲素为提供(批号07409403,中国药品生物制品
检定所),其他对照品自制,进行光谱鉴定和纯度测
试,纯度>98%,秦皮药材经中国中医科学院中药研
究所胡世林研究员和陕西中医学院胡本祥、王继涛
教授鉴定为2005年版《中国药典》所收载的秦皮正
品,药材来源见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
AgilentExtendC18柱(46mm×250mm,5μm);
流动相A甲醇B04%醋酸水溶液;梯度洗脱:0~25
min(89% B),25~30min(89% ~75% B),50~65
min(75%~60% B),68~75min(60%~20% B);检
测波长340nm(0~60min),254nm(60~74min);
340nm(74~75min);柱温 40℃;流速 15mL·
min-1。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取秦皮药材(过4号筛)约20g,加入
甲醇30mL,加热回流1h,用甲醇补足失重,微孔滤
膜(045μm)过滤,取续滤液,即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取秦皮甲素对照品适量,加甲醇制成含
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    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
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 December,2008
   表1 秦皮药材来源及及鉴定结果
No. 购买地或采集地 植物来源
1 辽宁沈阳    Fraxinusrhynchophyla
3 黑龙江齐齐哈尔  
4 黑龙江齐齐哈尔  
5 黑龙江齐齐哈尔  
7 黑龙江绥化    
8 辽宁阜新     
9 山东潍坊     
10 山东潍坊     
11 山东潍坊     
18 广东广州     
2 黑龙江齐齐哈尔 F.szaboana
13 山东潍坊     
14 广东广州     
21 山西大同     
23 陕西西安     
27 广东深圳     
28 上海       
39 四川成都     
40 四川成都     
41 陕西澄城     
17 广东广州    F.chinensis
29 四川峨眉东岳村  
30 四川峨眉高河村  
31 四川峨眉赵河村  
32 四川峨眉兴荣村  
33 四川峨眉梧桐村  
34 四川峨眉顺河村  
35 四川峨眉兴荣村  
36 四川峨眉顺河村  
38 山西大同     
25 陕西洛南    F.styLosa
26 陕西洛南     
45 陕西商南杨家沟  
46 陕西商南二道河  
47 陕西商南二道河  
48 陕西山阳潘家沟  
49 陕西山阳潘家沟  
50 陕西山阳子房沟  
51 陕西山阳子房沟  
52 陕西山阳李家坪  
02837g·L-1秦皮甲素对照品溶液,过微孔滤膜
(045μm),取续滤液备用。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 精密取同一供试品溶液,按
2.1项下色谱条件,连续进样6次,记录色谱图,计
算各主要色谱相对峰面积的 RSD为 007% ~
29%,相对保留时间RSD为007%~026%,符合
指纹图谱的技术要求。
2.4.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液,分别在
0,3,6,9,12,18,21和24h进样,记录色谱图,结果
各主要色谱相对峰面积的 RSD为089% ~27%,
相对保留时间 RSD为 009% ~028%,说明样品
24h内稳定。
2.4.3 重现性试验 取同一批样品6份,按着供试
品溶液制备方法制备供试品溶液,记录色谱图,结果
各主要色谱相对峰面积的 RSD为065% ~29%,
相对保留时间RSD为005%~035%,表明方法重
现性良好。
2.5 样品测定
取40批供试品,按2.2项下方法制备,分别精
密吸取供试品溶液各5μL,注入高效液相色谱仪,
记录75min色谱图,供试品色谱中,以参照物秦皮
甲素对应的色谱峰(S)的相对保留时间和峰面积为
1,计算共有指纹峰的相对保留时间及峰面积比值。
根据40批供试品的检测结果,建立苦枥白蜡树,尖
叶白蜡树,白蜡树,宿柱白蜡树及秦皮药材的高效液
相指纹图谱。秦皮指纹图谱见图1。
图1 不同基原秦皮树皮指纹图谱
2.6 指纹图谱分析
以药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似
度评价系统(A版)”对上述秦皮每个品种及秦皮药
材液相指纹图谱进行分析,根据匹配结果确定以下
数据。
苦枥白蜡树指纹图谱有 15个共有峰,1
(6972),2(11699),3(19172),4(24721),5
(33055),6(33719),7(37384),8(40880),9
(46368),10(48681),11(52262),12(60756),
13(61074),14(6262),15(68917),其中3号峰
(秦皮苷)的峰面积占总峰面积大于或等于10%,其
余各共有峰均按其相对保留时间定性,各共有峰相
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对保留时间 RSD为008% ~031%。10批供试品
色谱图与对照指纹图谱相似度均大于096,表明相
似度较好。
尖叶白蜡树指纹图谱有 11个共有峰,1
(6762),2(11351),3(18383),4(23816),5
(33317),6(45804),7(62369),8(68658),9
(71076),10(71784),11(728),除内标(S)外,
各单峰面积占总峰面积均小于10%,各共有峰均按
其相对保留时间定性,各共有峰相对保留时间 RSD
为011%~029%。10批供试品色谱图与对照指
纹图谱相似度均大于094,表明相似度较好。
白蜡树指纹图谱有 13个共有峰,1(6958),2
(1168),3(12081),4(19077),5(24624),6
(3304),7(40882),8(46299),9(52193),10
(56619),11(57089),12(62599),13(6877),其
中4号峰(秦皮苷),12号峰(未知成分)的峰面积
占总峰面积大于或等于10%,其余各共有峰均按其
相对留时间定性,各共有峰相对保留时间 RSD为
007% ~011%。10批供试品色谱图与对照指纹
图谱相似度均大于096,表明相似度较好。
宿柱白蜡树指纹图谱有 19个共有峰,1
(6794)(S),2(11366),3(12254),4(16078),5
(18543),6(23935),7(26068),8(31192),9
(3291),10(33316),11(40611),12(45919),13
(53131),14(68007),15(68301),16(68637),
17(70914),18(72221),19(72722),其中2号峰
(秦皮乙素)的峰面积占总峰面积大于或等于20%,
其余各共有峰均按其相对保留时间定性,各共有峰
相对保留时间 RSD为006% ~020%。10批供试
品色谱图与对照指纹图谱相似度均大于098,表明
相似度较好。
秦皮药材指纹图谱有 5个共有峰,6866min
(秦皮甲素),11513min(秦皮乙素),18773min
(秦皮苷),24247min(秦皮素),46084min(未
知),经计算40批供试品色谱图相似度大于090,
表明相似度较好。
3 讨论
本研究对不同产地,不同品种秦皮药材采用高
效液相色谱法进行了系统考察,药材中秦皮甲素峰
面积较大,且较稳定,因此选取内标物秦皮甲素为指
纹图谱研究的参照物。
采用 DAD对指纹图谱的检测波长 210,254,
280,340nm进行选择,结果表明选择单一波长不能
完全反应药材的特征峰,340nm在60min以前色谱
图包含的信息量大,各色谱峰分离较好,60min以后
基本无色谱峰,而254nm在60min以后色谱图包
含的信息量大,各色谱峰分离较好,因此本研究采用
两个检测波长进行指纹图谱的研究。
本研究中考虑到苦枥白蜡树,尖叶白蜡树,白蜡
树,宿柱白蜡树的树皮均为秦皮药材,所以以苦枥白
蜡树皮作为秦皮的代表进行方法学考察。
秦皮为多基源药材,从图1中可以看出,秦皮药
材指纹图谱的共有峰有 5个,为秦皮甲素(6866
min),秦皮乙素(11513min),秦皮苷(18773
min),秦皮素(24247min),还有 1个未知成分
(46084min)。秦皮药材指纹图谱有比较明显的品
种特征,5个共有峰是4个品种秦皮药材相同的物
质基础,它们在秦皮药材中含量较高,是4个品种产
生相同活性的原因,可作为秦皮药材与其他药材鉴
别的依据。
另外,通过4种秦皮指纹图谱相关参数对比分
析可以看出,每个品种指纹图谱又有不同点,4种秦
皮所含有的共有成分不完全相同,各品种所含主要
成分含量也不完全相同。因此本研究针对4个不同
品种建立了相应的指纹图谱,通过对比发现各品种
除共有峰之外,每个品种都有其与其他品种不同的
特有峰,这些峰可以作为个品种间的鉴别,它们分别
是苦枥白蜡树的 33719,37384,60756,61074
min峰,尖叶白蜡树的7107,71784,728min峰,
白蜡树的 56619,57089min峰,宿柱白蜡树的
16078,26068,31192,32910,68007,68301,
72221min峰。
本研究采用高效液相色谱法,在2个波长下进
行梯度洗脱,尽可能到更多的信息,并使各色谱峰得
到了较好的分离,建立了药材的指纹图谱分析方法,
结果表明方法稳定,可靠,重现性好。
[参考文献]
[1] 中国药典.一部[S].2005:191.
[2] 国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求
(暂行)[J].中成药,2000,22(10):671.
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StudyonfingerprintofCortexFraxiniwithHPLC
LIULimei1,CHENLin1,WANGRuihai1,YANGQing2,WENGXiaogang2,WANGLi3
(1.BasicTheoryResearchInstituteofChineseMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
3.SanjingPharmaceuticalCo.Ltd..HarbinPharmaceuticalGroup,Harbin150069,China)
[Abstract] Objective:ToestablishfingerprintofCortexFraxiniandprovidereferenceforqualityevaluationofCortexFraxini.
Method:ChromatographicexperimentswereperformedonAgilentExtendC18column(4.6mm×250mm,5μm),elutedwithmeth
anolandwater,containing0.4% aceticacidasthemobilephasesingradientelution.Thedetectionwavelengthwas060min,340
nm;674min,254nm;7475min,340nm,andtheflowratewas1.0mL·min-1.FortysamplesinfourvarietiesofCortexFraxini
weredetectedtoestablishfingerprints,respectively.Result:Everyparameterofthemethodvalidationcompliedwithrelatedrulesand
regulations.Therewere15commonpeaksinthefingerprintof10Fraxinusrhynchophylasamples,elevencommonpeaksinthefinger
printof10F.chinensisvar.acuminata.samples,andinthefingerprintof10F.chinensissamples.Nineteencommonpeaksinthefin
gerprintof10F.stylosasamples.Therewere5commonpeaksinthefingerprintsof40CortexFraxinisamples.Thesimilarityfactors
ofthe10samplesofeveryspecieswerealmorethan0.96comparedwiththecontrolfingerprint.Thesimilarityofthe40CortexFraxini
sampleswasmorethan0.90.Fourefectiveconstituentsandoneunknownconstituentwerefoundin40samples.Conclusion:Thefin
gerprintsofF.rhynchophylabark,F.chinensisbark,F.chinensisvar.acuminatabark,F.stylosabarkandCortexFraxiniwerees
tablished.Themethodologicalevaluationshowedthattheresultswereinaccordwiththetechnologyrequirementsofchromatographyfin
gerprint,anditlaidagoodfoundationforqualitycontrolofCortexFraxini.
[Keywords] CortexFraxini;HPLC;fingerprint
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20080521
[基金项目] 国家科技支撑计划项目(2006BAI08B0309)
[通讯作者] 王智民,Tel:(010)84014128,Email:zhmw123
@263.net
HPLC测定大枣中无刺枣苄苷Ⅱ的含量
牛继伟1,2,张启伟2,龚慕辛2,闫利华2,朱晶晶2,王智民2,李勤凡1
(1.西北农林科技大学 动物医学院,陕西 杨凌 712100;
2.中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:建立大枣中无刺枣苄苷Ⅱ的 HPLC分析方法。方法:采用 ZorbaxSBC18(46mm×250mm,5
μm)色谱柱,以甲醇水(20∶80)为流动相,流速为1mL·min-1,检测波长为210nm,柱温30℃。结果:无刺枣苄苷
Ⅱ在0046~0582μg呈良好的线性关系,r=09999。12批不同产地的大枣中无刺枣苄苷Ⅱ质量分数在
0013%~0041%。结论:该方法简单、重复性好,可用于大枣的质量控制。
[关键词] 大枣;无刺枣苄苷Ⅱ;HPLC;含量测定
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)24293503
  大枣为鼠李科Rhamnaceae枣属Ziziphus植物枣 ZiziphusjujubaMil.的干燥成熟的果实,味甘,性温,
归脾、胃经。为补中益气、养血安神、缓和药性的常用
中药,用于脾虚食少、乏力便溏、妇人脏躁等[1]。为
了寻找其有效成分,阐明药效物质基础,建立大枣的
有效成分质量控制标准,达到更有效地控制大枣质
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