全 文 :地黄不同品种遗传关系的 RAPD分析
吴志刚1,王 敏1,黄璐琦1,刘红彦2,王 飞2,袁庆军1
(1中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;
2河南农业科学院 植物保护研究所,河南 郑州 450002)
[摘要] 目的:揭示地黄不同品种的亲缘关系和遗传特点。方法:采用RAPD技术和群体遗传学的分析方法,
对地黄16个栽培品种、2个野生居群共54个个体进行了亲缘关系、遗传多样性和遗传结构分析。结果:邻接法构
建的多数一致树将54个地黄样品划分为3个明显的类群;Popgene和AMOVA分析均显示地黄品种间的遗传分化
大于品种内;类群I所包含的各品种未表现出明显的遗传分化。结论:长期的无性繁殖为地黄积累了一定的遗传
分化,野生地黄与栽培品之间遗传距离较大,但在主要栽培品种中遗传分化不明显,显示遗传背景较为单一。野生
地黄作为地黄的育种资源应给予充分重视和研究。
[关键词] 地黄;亲缘关系;遗传多样性;遗传结构;RAPD
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2007)18186505
[收稿日期] 20070710
[通讯作者] 黄璐琦,Tel:(010)640144112955
地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLi
bosch的新鲜或干燥块根。栽培地黄以河南、山西、
山东等省栽培的面积较大,尤其河南焦作地区为地
黄的道地产区,该地区出产的地黄被称为怀地黄,享
誉海内外。野生的地黄因不作药用,不作商品来源。
地黄是高度杂合体,自交结实率极低,杂交后代严重
分离,用种子繁殖不能保持稳定的产量和质量[1],
因此,生产上主要采用块根无性繁殖,而种子繁殖多
用于育种,而不用于生产。为得到地黄的优良性状,
人们通过长期的育种实践和留种栽培,积累了大量
的地黄农家品种。据不完全统计,地黄的品种名称
多达50多个[2],其中除了少数是科研人员潜心培育
的优良品种,大部分都是传统农家品种,称谓混杂,
来源不明。各品种间在外观形态上虽有一定区别,
但对很多品种来说,鉴别特征并不明确,有些特征在
栽培期间也并不稳定,甚至有时不同文献对同一品
种的形态描述也不十分一致,对于产量和质量的描
述更是相差甚远。因此,在名目繁多的地黄栽培品
种中,同名异物和同物异名的现象非常普遍,实际生
产中种源混杂的情况更是难以避免。
研究地黄不同栽培品种在遗传上的特点和关
系,可为澄清地黄的品种混杂问题,并进一步预见这
些地黄品种未来对环境的适应能力,以及指导其遗
传育种等提供重要的依据。为此,笔者在河南、山
西、山东的地黄主产区,收集了药农在田间实际种植
的主要栽培品种,采用 RAPD技术和群体遗传学的
分析方法,对18个地黄品种或居群进行了分析。
1 材料和方法
11 材料
自河南、山西、山东的地黄主产区大田内收集了
16个地黄主栽品种,另收集2个居群的野生地黄,
取其健康幼嫩的叶片,分个体取样,置硅胶中快速干
燥。每个品种取3个个体作为供试样品。样品编号
如表1所示。
12 仪器和试剂
ABI9700PCR扩增仪(AppliedBiosystems,美
国);MicroMB3616型高速离心机(IEC公司,美
国);GeneQuantIRNA/DNACalculator(Pharmacia
Biotech,英国);DYY-Ⅲ 5型电泳仪(北京市六一
仪器厂);GeneGenius凝胶紫外成像系统(SYNGENE
公司);TaqDNA聚合酶(华美生物工程公司);琼脂
糖(Promega);dNTPs(Pharmacia);RAPD引物由上
海生物工程有限公司合成。其他试剂均为分析纯。
13 方法
131 总DNA的提取 每个地黄样品取干燥叶片
002g,按照黄璐琦等[3]的方法提取DNA。
132 RAPD扩增 反应体系总体积50μL,其中
引物为1mmol·L-1,总DNA约150ng,Taq酶3U,
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表1 地黄RAPD分析供试样品
No 品种名称 来源
1 邙山野生地黄 邙山河南省巩义县境内
2 麻叶 河南省温县
3 红薯王 河南省温县农科所
4 9302 河南省温县农科所
5 嵩县野生地黄 河南省嵩县大章乡
6 855 河南省温县农科所
7 狮子头 河南省温县
8 北京1号 河南省温县
9 北京2号 河南省温县
10 北京3号 山西省稷山县杨赵下庄村
11 大红袍 河南省温县
12 金状元 河南省温县
13 金白 河南省温县农科所
14 三块 山西省襄汾县荀董村
15 小黑英 河南省中药研究所
16 抗育831 山东省荷泽市马岭岗乡
17 郭礼茂 山西省绛县南樊镇
18 9104 河南省温县农科所
dNTPs各 005mmol·L-1。扩增程序为预变性 5
min,94℃40s,37℃ 45s,72℃45s,40个循环,后
延伸72℃5min。取10μL扩增产物于10%琼脂
糖凝胶上用1×TAE电泳缓冲液电泳,紫外检测拍
照。
133 数据分析 电泳图谱中的每一条带(DNA
片段)均为一个分子标记,并代表一个引物结合点。
根据各分子标记的有无及其迁移率统计得到所有位
点的二元数据,无带(隐性)计为0,有带(显性)计
为1(强带和弱带的赋值均为1)。对于多态位点,
仅在重复实验中能清晰、稳定出现的差异带用于数
据分析。
将54个供试品记录各多态位点的1/0数据输
入 计 算 机, 应 用 phyltools 132 (htp://
wwwdpwwaunl/pv/PUB/pt/)软件将此二元数据
进行 100次靴带抽样检验(bootstrapping),并采用
Nei系数转换成相应的 phylip格式的距离矩阵,对
此距离矩阵使用 Phylip366软件中的 Neighbor程
序,采用公认较好的邻接法重建系统树,然后用
Consense程序得到多数一致树。另外,应用Popgene
132软件对上述样品所表现出的地黄种内遗传多
样性进行了分析。并应用 Arlequin2000软件进行
上述18个品种或居群的AMOVA分析。
2 结果
21 引物筛选和扩增结果
从300多个 RAPD引物中用单个模板筛出70
多个引物,再用9个来自不同品种的地黄总DNA模
板筛选出19个扩增条带清晰、呈现多态性的引物。
用这些引物对54个样品进行扩增,其中7个引物得
到较好的扩增结果,共得到77条清晰、稳定、可重复
的条带,其中48条具有明显的多态性,如表2所示。
表2 RAPD扩增所用引物及结果
引物 扩增条带总数 多态性条带数 多态条带百分率
s70 14 12 8571
s31 21 21 10000
s40 6 2 3333
s50 13 7 5385
s72 6 2 3333
s463 7 2 2857
s2083 10 2 2000
总体 77 48 6234
22 由54个地黄样品构建的系统树
将Phyltools和Phylip软件联用,计算出54个地
黄个体之间的 Nei’s遗传距离,并采用邻接法构建
系统树。经100次靴带检验所得到的多数一致树
(majorityruleconsensustree)如图 1所示。各品种
内的不同个体大部分可聚在一起,显示了品种间具
有一定的遗传分化。总体来看,54个样品明显形成
3个类群。类群I是采自邙山的野生地黄,3个样品
成阶梯状位于系统树的最外侧,表现出该类群与其
他所有样品具有较大的区别,并且类群内的分化也
较明显。类群II由来源于麻叶和91042个品种的
6个样品组成,形成一个置信度较高的单系类群,与
其他品种形成明显的分化,而麻叶和9104之间的分
化则并不明显(只有47%的靴带支持率)。其他所
有的样品汇聚成一个大类群 I。类群 I中的45个
样品之间未表现出明显的差异和分化,除一些品种
内部个体之间以较高的靴带支持率聚到一起以外,
各品种之间的连接均未得到较高的靴带检验支持,
甚至来源于同一品种的个体也分散到不同的分支
中,表现出类群I中的品种之间未形成明显的遗传
分化。
采用Jaccard系数计算相应的遗传距离并构建
NJ树,也得到类似的结果。
23 遗传多样性和遗传结构
RAPD扩增结果在总体水平上和各品种水平上
所呈现的多态位点百分率分别如表 3所示。应用
Popgene软件在总体水平上和品种水平上进行遗传
多样性分析的结果如表4所示,Nei’s多样性分析
结果见表5。
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图1 引物S70对54个地黄样品的扩增图谱
M100bpDNAladder
应用Arlequin软件,根据系统树所形成的3个类
群分为3个组,分别从组间、组内/品种间、品种内3
个水平对全部样品的RAPD结果进行分子方差分析
(AMOVA),表6结果表明组内/品种间和品种内2
个水平上对地黄的遗传变异都有极显著影响,组间
水平有显著影响。各水平对地黄遗传变异的贡献率
依次为组内/品种间(5456%)、品种内(2679%)、
表3 地黄各品种的多态位点百分率
No 品种名称 样本数 多态位点数 多态位点百分率PPB
1 邙山野生地黄 3 11 22.92
2 麻叶 3 1 2.08
3 红薯王 3 7 14.58
4 9302 3 9 18.75
5 嵩县野生地黄 3 9 18.75
6 855 3 8 16.67
7 狮子头 3 5 10.42
8 北京1号 3 8 16.67
9 北京2号 3 1 2.08
10 北京3号 3 7 14.58
11 大红袍 3 9 18.75
12 金状元 3 21 43.75
13 金白 3 10 20.83
14 三块 3 12 25.00
15 小黑英 3 6 12.50
16 抗育831 3 1 2.08
17 郭礼茂 3 11 22.92
18 9104 3 3 6.25
平均 7.72 16.09
总体水平 54 48 62.34
组间(1865%),其中群体间的分化约为群体内的2
倍。另将类群I作为一个组单独进行AMOVA分析,
结果表明,群体间的遗传变异(4823%)与群体内
(5177%)基本相同,与全部样品的分析结果有明显不
同。
3 讨论
31 地黄各品种间的亲缘关系 聚类分析的结果
将各样品大致分为3个类群。这3个类群的分化获
得了80%以上的靴带检验支持率,在 AMOVA分析
中也获得了一定的支持。
采自邙山的野生地黄与栽培品种间出现较大的
遗传分化,且野生地黄居群内的遗传分化也较大。
这是由野生地黄与栽培地黄不同的繁殖方式决定
的。提示野生地黄虽然不能入药,但是蕴含了丰富
的遗传多样性,是地黄优良品种选育的重要资源。
野生地黄分布很广,其遗传多样性和遗传结构究竟
如何,也是值得研究的课题。本试验中另一个野生
地黄居群采自嵩县大章乡,RAPD分析的结果显示
该居群聚在类群 I中,且未表现出明显的遗传分
化,怀疑可能为田间栽培地黄的逸生。
麻叶和91042个品种显示出与其他栽培品种
较为明显的区别,而二者之间则未表现出明显的分
化。这与形态特征的表现是一致的,这2个品种形
态相近,而与其他品种相比都具有较明显的绒毛,叶
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表4 地黄各品种的遗传多样性
No 品种名称 等位基因观察值Na 有效等位基因数Ne Nei’s基因多样性H Shannon’s指数I
1 邙山野生地黄 1.2292±0.4247 1.1833±0.3398 0.1019±0.1888 0.1459±0.2704
2 麻叶 1.0208±0.1443 1.0167±0.1155 0.0093±0.0642 0.0133±0.0919
3 红薯王 1.1458±0.3567 1.1167±0.2853 0.0648±0.1585 0.0928±0.2270
4 9302 1.1875±0.3944 1.1500±0.3156 0.0833±0.1753 0.1193±0.2511
5 嵩县野生地黄 1.1875±0.3944 1.1500±0.3156 0.0833±0.1753 0.1193±0.2511
6 85-5 1.1667±0.3766 1.1333±0.3013 0.0741±0.1674 0.1061±0.2397
7 狮子头 1.1042±0.3087 1.0833±0.2470 0.0463±0.1372 0.0663±0.1965
8 北京1号 1.1667±0.3766 1.1333±0.3013 0.0741±0.1674 0.1061±0.2397
9 北京2号 1.0208±0.1443 1.0167±0.1155 0.0093±0.0642 0.0133±0.0919
10 北京3号 1.1458±0.3567 1.1167±0.2853 0.0648±0.1585 0.0928±0.2270
11 大红袍 1.1875±0.3944 1.1500±0.3156 0.0833±0.1753 0.1193±0.2511
12 金状元 1.4375±0.5013 1.3500±0.4011 0.1944±0.2228 0.2785±0.3191
13 金白 1.2083±0.4104 1.1667±0.3283 0.0926±0.1824 0.1326±0.2612
14 三块 1.2500±0.4376 1.2000±0.3501 0.1111±0.1945 0.1591±0.2785
15 小黑英 1.1250±0.3342 1.1000±0.2674 0.0556±0.1485 0.0796±0.2127
16 抗育831 1.0208±0.1443 1.0167±0.1155 0.0093±0.0642 0.0133±0.0919
17 郭礼茂 1.2292±0.4247 1.1833±0.3398 0.1019±0.1888 0.1459±0.2704
18 9104 1.0625±0.2446 1.0500±0.1957 0.0278±0.1087 0.0398±0.1557
平均 1.1609±0.1005 1.1287±0.0804 0.0715±0.0446 0.1024±0.0640
总体水平 2.0000±0.0000 1.5586±0.2997 0.3332±0.1364 0.5033±0.1685
表5 地黄各品种的Nei’s变异分析
因素 总基因多样性Ht 品种内基因多样性Hs 基因分化系数Gst 基因流Nm
平均值 03332 00715 07854 01366
标准差 00186 00029
表6 地黄各品种的AMOVA分析
方差来源 自由度 方差总和 方差组分 方差百分比 P
全部样品 组间 2 64.663 1.79154 18.65 0.00489
组内/群体间 15 274.467 5.24123 54.56 <0.001
群体内 36 92.667 2.57407 26.79 <0.001
类群Ⅱ 群体间 14 247.590 3.84320 48.23 <0.001
群体内 38 156.750 4.12500 51.77
注:P值表示1023次随机排列改变计算得到的比观察值的变异大的概率值
片有明显泡状突起等特征。
而包含大多数栽培品种尤其是主流品种的类群
I中未能表现出令人信服的遗传分化。AMOVA分
析也显示类群 I中的群体间遗传分化与群体内遗
传分化几乎相等,甚至略小于群体内的遗传分化。
这可以有两种解释。一种解释是这些品种本身亲缘
关系很近;另一种解释是田间的品种混杂程度较高,
不仅存在种源不纯的情况,甚至有可能有品种名称
的误用、混用现象存在。从试验中所呈现出的地黄
遗传多样性程度,以及地黄的生产实际来看,这两种
情况具有同时存在的可能性。
32 地黄的遗传结构和遗传多样性 Popgene软件
计算所得的Nei’s多样性分析结果、Shannon’s指数
表现出的分化系数以及AMOVA在群体水平上的分
析结果一致表明,从总体上来看,地黄的品种间的遗
传分化大于品种内的遗传分化。这与地黄以无性繁
殖方式进行栽培的特点是相应的。无性繁殖由于繁
衍能力强,加之以人为的选择和放大效果,能够在一
定范围内积累和保留较为丰富的遗传变异。
但对类群I单独进行AMOVA分析发现该类群
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内部的品种间遗传分化较低,与品种内的遗传分化
几乎相同,说明地黄种内较大的品种间的遗传分化
主要体现在类群 I和 II所包含的3个品种之间及
其与类群I之间有较大的遗传距离上。类群 I内
各品种遗传分化的真实情况如何,还有待于进一步
的研究和证实。
RAPD灵敏度较高,是比较适用于分析种下水
平遗传多样性的一种技术手段。但本试验筛选了
300条RAPD引物,最后仅得到48条多态性条带,
且各品种间扩增的带型基本一致,总体水平上的多
态位点百分率为6234,相比其他物种来说是偏低
的。这可能与地黄生产上长期的人为选择,许多种
质资源丢失,目前主栽品种遗传背景较为单一等有
关。本试验还表明野生地黄中可能蕴藏着丰富的种
质资源,因此很有必要充分挖掘地黄的野生资源,加
强对地黄的育种研究,丰富地黄栽培品种的遗传多
样性。
4 结论
地黄的无性繁殖方式和外观特征区别不明显等
特点,造成了地黄的栽培品种非常混乱。本试验初
步阐明了这些品种在遗传上表现出的一些特点,认
为目前地黄主流品种的遗传背景比较单一,面临突
然的环境变化或灾害时适应性不强,加强地黄的育
种工作是非常必要的。而野生地黄和少数不常见的
品种如麻叶和9104等,与主流品种相比则显示出较
大的遗传分化,提示未来的地黄育种工作应在遗传
变异较大的品种或野生地黄之间进行。
由于RAPD的共显性特点,加之能够分析的样
品数量有限,其图谱的识别也比较困难,难以更深入
地揭示各品种间的遗传关系。究竟有哪些栽培品种
能够被确立为独立的无性系,哪些品种在遗传上没
有明显的区别可以合并,都还有待于寻找更好的方
法进一步地深入研究和验证。
[参考文献]
[1] 冉懋雄,周厚琼现代中药栽培养殖与加工手册[M]北京:
中国中医药出版社,1999
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中药材,1995,18(11):545
[3] 黄璐琦,王 敏,周长征,等,RAPD方法在细辛类药材鉴别
研究中的问题及其对策[J]药学学报,1998,33(10):778
RAPDanalysisongeneticrelationshipamongvarietiesof
Rehmanniaglutinosa
WUZhigang1,WANGMin1,HUANGLuqi1,LIUHongyan2,WANGFei2,YUANQingjun1
(1InstituteofChineseMateriaMedica,AcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2InstituteofPlantProtection,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450002,China)
[Abstract] Objective:TodefinethegeneticrelationshipandothergeneticcharactersofdiferentvarietiesofRehmanniagluti
nosaMethod:RAPDreactionswereconductedontotal54samplesfrom16varietiesand2populationsofRglutinosaThedatawere
analyzedbyPhylips,PopgeneandArlequinsoftwareResult:Themajorityruleconsensustreedefinedthe54samplesto3groups
PopulationgeneticsanalysisandAMOVAshowedthatthegeneticdiversityamongvarieties/populationsmuchgreaterthanthatwithin
varieties/populations,butwithingroupIthegeneticdiversityamongvarietieswassimilartothatwithinvarietiesConclusion:Dueto
thelongtimeasexualpropagationofRglutinosa,somegeneticdiferentiationhasbeenaccumulatedandfixedwithinthespeciesIt
wasshownthatthegeneticdistancebetweenwildpopulationandcultivatedvarietieswasgreaterthanthegeneticdistanceamongculti
vatedvarietiesThewildresourceoftheplantshouldbepaidmoreatentionandstudies
[Keywords] Rehmanniaglutinosa;geneticrelationship,geneticdiversity;geneticstructure;RAPD
[责任编辑 张宁宁]
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