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RAPD analysis on genetic relationship among varieties of Rehmannia glutinosa

地黄不同品种遗传关系的RAPD分析



全 文 :地黄不同品种遗传关系的 RAPD分析
吴志刚1,王 敏1,黄璐琦1,刘红彦2,王 飞2,袁庆军1
(1中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;
2河南农业科学院 植物保护研究所,河南 郑州 450002)
[摘要] 目的:揭示地黄不同品种的亲缘关系和遗传特点。方法:采用RAPD技术和群体遗传学的分析方法,
对地黄16个栽培品种、2个野生居群共54个个体进行了亲缘关系、遗传多样性和遗传结构分析。结果:邻接法构
建的多数一致树将54个地黄样品划分为3个明显的类群;Popgene和AMOVA分析均显示地黄品种间的遗传分化
大于品种内;类群I所包含的各品种未表现出明显的遗传分化。结论:长期的无性繁殖为地黄积累了一定的遗传
分化,野生地黄与栽培品之间遗传距离较大,但在主要栽培品种中遗传分化不明显,显示遗传背景较为单一。野生
地黄作为地黄的育种资源应给予充分重视和研究。
[关键词] 地黄;亲缘关系;遗传多样性;遗传结构;RAPD
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2007)18186505
[收稿日期] 20070710
[通讯作者] 黄璐琦,Tel:(010)640144112955
  地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLi
bosch的新鲜或干燥块根。栽培地黄以河南、山西、
山东等省栽培的面积较大,尤其河南焦作地区为地
黄的道地产区,该地区出产的地黄被称为怀地黄,享
誉海内外。野生的地黄因不作药用,不作商品来源。
地黄是高度杂合体,自交结实率极低,杂交后代严重
分离,用种子繁殖不能保持稳定的产量和质量[1],
因此,生产上主要采用块根无性繁殖,而种子繁殖多
用于育种,而不用于生产。为得到地黄的优良性状,
人们通过长期的育种实践和留种栽培,积累了大量
的地黄农家品种。据不完全统计,地黄的品种名称
多达50多个[2],其中除了少数是科研人员潜心培育
的优良品种,大部分都是传统农家品种,称谓混杂,
来源不明。各品种间在外观形态上虽有一定区别,
但对很多品种来说,鉴别特征并不明确,有些特征在
栽培期间也并不稳定,甚至有时不同文献对同一品
种的形态描述也不十分一致,对于产量和质量的描
述更是相差甚远。因此,在名目繁多的地黄栽培品
种中,同名异物和同物异名的现象非常普遍,实际生
产中种源混杂的情况更是难以避免。
研究地黄不同栽培品种在遗传上的特点和关
系,可为澄清地黄的品种混杂问题,并进一步预见这
些地黄品种未来对环境的适应能力,以及指导其遗
传育种等提供重要的依据。为此,笔者在河南、山
西、山东的地黄主产区,收集了药农在田间实际种植
的主要栽培品种,采用 RAPD技术和群体遗传学的
分析方法,对18个地黄品种或居群进行了分析。
1 材料和方法
11 材料
自河南、山西、山东的地黄主产区大田内收集了
16个地黄主栽品种,另收集2个居群的野生地黄,
取其健康幼嫩的叶片,分个体取样,置硅胶中快速干
燥。每个品种取3个个体作为供试样品。样品编号
如表1所示。
12 仪器和试剂
ABI9700PCR扩增仪(AppliedBiosystems,美
国);MicroMB3616型高速离心机(IEC公司,美
国);GeneQuantIRNA/DNACalculator(Pharmacia
Biotech,英国);DYY-Ⅲ 5型电泳仪(北京市六一
仪器厂);GeneGenius凝胶紫外成像系统(SYNGENE
公司);TaqDNA聚合酶(华美生物工程公司);琼脂
糖(Promega);dNTPs(Pharmacia);RAPD引物由上
海生物工程有限公司合成。其他试剂均为分析纯。
13 方法
131 总DNA的提取 每个地黄样品取干燥叶片
002g,按照黄璐琦等[3]的方法提取DNA。
132 RAPD扩增 反应体系总体积50μL,其中
引物为1mmol·L-1,总DNA约150ng,Taq酶3U,
  
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    中 国 中 药 杂 志
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表1 地黄RAPD分析供试样品
No 品种名称 来源
1 邙山野生地黄 邙山河南省巩义县境内
2 麻叶 河南省温县
3 红薯王 河南省温县农科所
4 9302 河南省温县农科所
5 嵩县野生地黄 河南省嵩县大章乡
6 855 河南省温县农科所
7 狮子头 河南省温县
8 北京1号 河南省温县
9 北京2号 河南省温县
10 北京3号 山西省稷山县杨赵下庄村
11 大红袍 河南省温县
12 金状元 河南省温县
13 金白 河南省温县农科所
14 三块 山西省襄汾县荀董村
15 小黑英 河南省中药研究所
16 抗育831 山东省荷泽市马岭岗乡
17 郭礼茂 山西省绛县南樊镇
18 9104 河南省温县农科所
dNTPs各 005mmol·L-1。扩增程序为预变性 5
min,94℃40s,37℃ 45s,72℃45s,40个循环,后
延伸72℃5min。取10μL扩增产物于10%琼脂
糖凝胶上用1×TAE电泳缓冲液电泳,紫外检测拍
照。
133 数据分析 电泳图谱中的每一条带(DNA
片段)均为一个分子标记,并代表一个引物结合点。
根据各分子标记的有无及其迁移率统计得到所有位
点的二元数据,无带(隐性)计为0,有带(显性)计
为1(强带和弱带的赋值均为1)。对于多态位点,
仅在重复实验中能清晰、稳定出现的差异带用于数
据分析。
将54个供试品记录各多态位点的1/0数据输
入 计 算 机, 应 用 phyltools 132 (htp://
wwwdpwwaunl/pv/PUB/pt/)软件将此二元数据
进行 100次靴带抽样检验(bootstrapping),并采用
Nei系数转换成相应的 phylip格式的距离矩阵,对
此距离矩阵使用 Phylip366软件中的 Neighbor程
序,采用公认较好的邻接法重建系统树,然后用
Consense程序得到多数一致树。另外,应用Popgene
132软件对上述样品所表现出的地黄种内遗传多
样性进行了分析。并应用 Arlequin2000软件进行
上述18个品种或居群的AMOVA分析。
2 结果
21 引物筛选和扩增结果
从300多个 RAPD引物中用单个模板筛出70
多个引物,再用9个来自不同品种的地黄总DNA模
板筛选出19个扩增条带清晰、呈现多态性的引物。
用这些引物对54个样品进行扩增,其中7个引物得
到较好的扩增结果,共得到77条清晰、稳定、可重复
的条带,其中48条具有明显的多态性,如表2所示。
表2 RAPD扩增所用引物及结果
引物 扩增条带总数 多态性条带数 多态条带百分率
s70 14 12 8571
s31 21 21 10000
s40 6 2 3333
s50 13 7 5385
s72 6 2 3333
s463 7 2 2857
s2083 10 2 2000
总体 77 48 6234
22 由54个地黄样品构建的系统树
将Phyltools和Phylip软件联用,计算出54个地
黄个体之间的 Nei’s遗传距离,并采用邻接法构建
系统树。经100次靴带检验所得到的多数一致树
(majorityruleconsensustree)如图 1所示。各品种
内的不同个体大部分可聚在一起,显示了品种间具
有一定的遗传分化。总体来看,54个样品明显形成
3个类群。类群I是采自邙山的野生地黄,3个样品
成阶梯状位于系统树的最外侧,表现出该类群与其
他所有样品具有较大的区别,并且类群内的分化也
较明显。类群II由来源于麻叶和91042个品种的
6个样品组成,形成一个置信度较高的单系类群,与
其他品种形成明显的分化,而麻叶和9104之间的分
化则并不明显(只有47%的靴带支持率)。其他所
有的样品汇聚成一个大类群 I。类群 I中的45个
样品之间未表现出明显的差异和分化,除一些品种
内部个体之间以较高的靴带支持率聚到一起以外,
各品种之间的连接均未得到较高的靴带检验支持,
甚至来源于同一品种的个体也分散到不同的分支
中,表现出类群I中的品种之间未形成明显的遗传
分化。
采用Jaccard系数计算相应的遗传距离并构建
NJ树,也得到类似的结果。
23 遗传多样性和遗传结构
RAPD扩增结果在总体水平上和各品种水平上
所呈现的多态位点百分率分别如表 3所示。应用
Popgene软件在总体水平上和品种水平上进行遗传
多样性分析的结果如表4所示,Nei’s多样性分析
结果见表5。
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图1 引物S70对54个地黄样品的扩增图谱
M100bpDNAladder
  应用Arlequin软件,根据系统树所形成的3个类
群分为3个组,分别从组间、组内/品种间、品种内3
个水平对全部样品的RAPD结果进行分子方差分析
(AMOVA),表6结果表明组内/品种间和品种内2
个水平上对地黄的遗传变异都有极显著影响,组间
水平有显著影响。各水平对地黄遗传变异的贡献率
依次为组内/品种间(5456%)、品种内(2679%)、
   表3 地黄各品种的多态位点百分率
No 品种名称 样本数 多态位点数 多态位点百分率PPB
1 邙山野生地黄 3 11 22.92
2 麻叶 3 1 2.08
3 红薯王 3 7 14.58
4 9302 3 9 18.75
5 嵩县野生地黄 3 9 18.75
6 855 3 8 16.67
7 狮子头 3 5 10.42
8 北京1号 3 8 16.67
9 北京2号 3 1 2.08
10 北京3号 3 7 14.58
11 大红袍 3 9 18.75
12 金状元 3 21 43.75
13 金白 3 10 20.83
14 三块 3 12 25.00
15 小黑英 3 6 12.50
16 抗育831 3 1 2.08
17 郭礼茂 3 11 22.92
18 9104 3 3 6.25
平均 7.72 16.09
总体水平 54 48 62.34
组间(1865%),其中群体间的分化约为群体内的2
倍。另将类群I作为一个组单独进行AMOVA分析,
结果表明,群体间的遗传变异(4823%)与群体内
(5177%)基本相同,与全部样品的分析结果有明显不
同。
3 讨论
31 地黄各品种间的亲缘关系 聚类分析的结果
将各样品大致分为3个类群。这3个类群的分化获
得了80%以上的靴带检验支持率,在 AMOVA分析
中也获得了一定的支持。
采自邙山的野生地黄与栽培品种间出现较大的
遗传分化,且野生地黄居群内的遗传分化也较大。
这是由野生地黄与栽培地黄不同的繁殖方式决定
的。提示野生地黄虽然不能入药,但是蕴含了丰富
的遗传多样性,是地黄优良品种选育的重要资源。
野生地黄分布很广,其遗传多样性和遗传结构究竟
如何,也是值得研究的课题。本试验中另一个野生
地黄居群采自嵩县大章乡,RAPD分析的结果显示
该居群聚在类群 I中,且未表现出明显的遗传分
化,怀疑可能为田间栽培地黄的逸生。
麻叶和91042个品种显示出与其他栽培品种
较为明显的区别,而二者之间则未表现出明显的分
化。这与形态特征的表现是一致的,这2个品种形
态相近,而与其他品种相比都具有较明显的绒毛,叶
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   表4 地黄各品种的遗传多样性
No 品种名称 等位基因观察值Na 有效等位基因数Ne Nei’s基因多样性H Shannon’s指数I
1 邙山野生地黄 1.2292±0.4247 1.1833±0.3398 0.1019±0.1888 0.1459±0.2704
2 麻叶 1.0208±0.1443 1.0167±0.1155 0.0093±0.0642 0.0133±0.0919
3 红薯王 1.1458±0.3567 1.1167±0.2853 0.0648±0.1585 0.0928±0.2270
4 9302 1.1875±0.3944 1.1500±0.3156 0.0833±0.1753 0.1193±0.2511
5 嵩县野生地黄 1.1875±0.3944 1.1500±0.3156 0.0833±0.1753 0.1193±0.2511
6 85-5 1.1667±0.3766 1.1333±0.3013 0.0741±0.1674 0.1061±0.2397
7 狮子头 1.1042±0.3087 1.0833±0.2470 0.0463±0.1372 0.0663±0.1965
8 北京1号 1.1667±0.3766 1.1333±0.3013 0.0741±0.1674 0.1061±0.2397
9 北京2号 1.0208±0.1443 1.0167±0.1155 0.0093±0.0642 0.0133±0.0919
10 北京3号 1.1458±0.3567 1.1167±0.2853 0.0648±0.1585 0.0928±0.2270
11 大红袍 1.1875±0.3944 1.1500±0.3156 0.0833±0.1753 0.1193±0.2511
12 金状元 1.4375±0.5013 1.3500±0.4011 0.1944±0.2228 0.2785±0.3191
13 金白 1.2083±0.4104 1.1667±0.3283 0.0926±0.1824 0.1326±0.2612
14 三块 1.2500±0.4376 1.2000±0.3501 0.1111±0.1945 0.1591±0.2785
15 小黑英 1.1250±0.3342 1.1000±0.2674 0.0556±0.1485 0.0796±0.2127
16 抗育831 1.0208±0.1443 1.0167±0.1155 0.0093±0.0642 0.0133±0.0919
17 郭礼茂 1.2292±0.4247 1.1833±0.3398 0.1019±0.1888 0.1459±0.2704
18 9104 1.0625±0.2446 1.0500±0.1957 0.0278±0.1087 0.0398±0.1557
平均 1.1609±0.1005 1.1287±0.0804 0.0715±0.0446 0.1024±0.0640
总体水平 2.0000±0.0000 1.5586±0.2997 0.3332±0.1364 0.5033±0.1685
表5 地黄各品种的Nei’s变异分析
因素 总基因多样性Ht 品种内基因多样性Hs 基因分化系数Gst 基因流Nm
平均值 03332 00715 07854 01366
标准差 00186 00029
表6 地黄各品种的AMOVA分析
方差来源 自由度 方差总和 方差组分 方差百分比 P
全部样品 组间 2 64.663 1.79154 18.65 0.00489
     组内/群体间 15 274.467 5.24123 54.56 <0.001
     群体内 36 92.667 2.57407 26.79 <0.001
类群Ⅱ  群体间 14 247.590 3.84320 48.23 <0.001
     群体内 38 156.750 4.12500 51.77
  注:P值表示1023次随机排列改变计算得到的比观察值的变异大的概率值
片有明显泡状突起等特征。
而包含大多数栽培品种尤其是主流品种的类群
I中未能表现出令人信服的遗传分化。AMOVA分
析也显示类群 I中的群体间遗传分化与群体内遗
传分化几乎相等,甚至略小于群体内的遗传分化。
这可以有两种解释。一种解释是这些品种本身亲缘
关系很近;另一种解释是田间的品种混杂程度较高,
不仅存在种源不纯的情况,甚至有可能有品种名称
的误用、混用现象存在。从试验中所呈现出的地黄
遗传多样性程度,以及地黄的生产实际来看,这两种
情况具有同时存在的可能性。
32 地黄的遗传结构和遗传多样性 Popgene软件
计算所得的Nei’s多样性分析结果、Shannon’s指数
表现出的分化系数以及AMOVA在群体水平上的分
析结果一致表明,从总体上来看,地黄的品种间的遗
传分化大于品种内的遗传分化。这与地黄以无性繁
殖方式进行栽培的特点是相应的。无性繁殖由于繁
衍能力强,加之以人为的选择和放大效果,能够在一
定范围内积累和保留较为丰富的遗传变异。
但对类群I单独进行AMOVA分析发现该类群
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内部的品种间遗传分化较低,与品种内的遗传分化
几乎相同,说明地黄种内较大的品种间的遗传分化
主要体现在类群 I和 II所包含的3个品种之间及
其与类群I之间有较大的遗传距离上。类群 I内
各品种遗传分化的真实情况如何,还有待于进一步
的研究和证实。
RAPD灵敏度较高,是比较适用于分析种下水
平遗传多样性的一种技术手段。但本试验筛选了
300条RAPD引物,最后仅得到48条多态性条带,
且各品种间扩增的带型基本一致,总体水平上的多
态位点百分率为6234,相比其他物种来说是偏低
的。这可能与地黄生产上长期的人为选择,许多种
质资源丢失,目前主栽品种遗传背景较为单一等有
关。本试验还表明野生地黄中可能蕴藏着丰富的种
质资源,因此很有必要充分挖掘地黄的野生资源,加
强对地黄的育种研究,丰富地黄栽培品种的遗传多
样性。
4 结论
地黄的无性繁殖方式和外观特征区别不明显等
特点,造成了地黄的栽培品种非常混乱。本试验初
步阐明了这些品种在遗传上表现出的一些特点,认
为目前地黄主流品种的遗传背景比较单一,面临突
然的环境变化或灾害时适应性不强,加强地黄的育
种工作是非常必要的。而野生地黄和少数不常见的
品种如麻叶和9104等,与主流品种相比则显示出较
大的遗传分化,提示未来的地黄育种工作应在遗传
变异较大的品种或野生地黄之间进行。
由于RAPD的共显性特点,加之能够分析的样
品数量有限,其图谱的识别也比较困难,难以更深入
地揭示各品种间的遗传关系。究竟有哪些栽培品种
能够被确立为独立的无性系,哪些品种在遗传上没
有明显的区别可以合并,都还有待于寻找更好的方
法进一步地深入研究和验证。
[参考文献]
[1] 冉懋雄,周厚琼现代中药栽培养殖与加工手册[M]北京:
中国中医药出版社,1999
[2] 雷福成,刘晓娜,王学增防止地黄品种退化的技术措施[J]
中药材,1995,18(11):545
[3] 黄璐琦,王 敏,周长征,等,RAPD方法在细辛类药材鉴别
研究中的问题及其对策[J]药学学报,1998,33(10):778
RAPDanalysisongeneticrelationshipamongvarietiesof
Rehmanniaglutinosa
WUZhigang1,WANGMin1,HUANGLuqi1,LIUHongyan2,WANGFei2,YUANQingjun1
(1InstituteofChineseMateriaMedica,AcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2InstituteofPlantProtection,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450002,China)
[Abstract] Objective:TodefinethegeneticrelationshipandothergeneticcharactersofdiferentvarietiesofRehmanniagluti
nosaMethod:RAPDreactionswereconductedontotal54samplesfrom16varietiesand2populationsofRglutinosaThedatawere
analyzedbyPhylips,PopgeneandArlequinsoftwareResult:Themajorityruleconsensustreedefinedthe54samplesto3groups
PopulationgeneticsanalysisandAMOVAshowedthatthegeneticdiversityamongvarieties/populationsmuchgreaterthanthatwithin
varieties/populations,butwithingroupIthegeneticdiversityamongvarietieswassimilartothatwithinvarietiesConclusion:Dueto
thelongtimeasexualpropagationofRglutinosa,somegeneticdiferentiationhasbeenaccumulatedandfixedwithinthespeciesIt
wasshownthatthegeneticdistancebetweenwildpopulationandcultivatedvarietieswasgreaterthanthegeneticdistanceamongculti
vatedvarietiesThewildresourceoftheplantshouldbepaidmoreatentionandstudies
[Keywords] Rehmanniaglutinosa;geneticrelationship,geneticdiversity;geneticstructure;RAPD
[责任编辑 张宁宁]
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