全 文 ：青蒿 °wxs ¦⁄‘„基因的克隆及生物信息学分析
孔建强 o王 伟 3 o郑晓东 o朱 平 o程克棣
k中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所 卫生部天然药物生物合成重点实验室 o北京 tsssxsl
≈摘要   目的 }对青蒿 °wxs ¦⁄‘„基因进行克隆和生物信息学分析 ∀方法 }通过 • ×2°≤• o从青蒿 ¦⁄‘„中克
隆了 t个 °wxs基因 ~通过生物信息学方法 o对其结构特点进行分析 ∀结果 }该 °wxs ¦⁄‘„基因 ’• ƒ为 t wyw ¥³o编
码 w{{个氨基酸 o该序列在 Š ±¨…¤±®上的登录号为 ⁄±yyztzt∀编码蛋白是一个中等大小的 „型 °wxso相对分子质
量 xw1||u ®⁄¤~等电点 {1{vo定位于线粒体 o和 ≤≠ °zt„∂ t具有很高的同源性 ∀结论 }该青蒿 °wxs和 ≤≠ °zt„∂ t在
进化和性质上很接近 o可能在青蒿中执行类似功能 ∀
≈关键词   青蒿 ~°wxs~生物信息学分析 ~≤≠ °zt„∂ t
≈中图分类号   ≥ xyz ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszlut2uuuz2sx
≈收稿日期   ussz2sw2tt
≈基金项目   北京市自然科学基金项目 kxszusv{l
≈通讯作者   3 王伟 oר¯}kstslyvtyxt|yo∞2°¤¬¯}ºº¤±ªƒ ¬°°q¤¦q
¦±
青蒿 Αρτεµ ισια αννυα 1是菊科蒿属植物 ∀自
从中分离出创新抗疟药青蒿素后 o对青蒿的研究 o尤
其是青蒿素生物合成的分子生物学研究进入了一个
快速增长期 ∀许多和青蒿素生物合成相关的基因被
克隆出来 ≈t2w  o但其中一部分基因的确切功能未知 ∀
因此 o通过生物信息学手段 o对这些基因的结构特点
进行分析 o指导其功能鉴定具有很重要的意义 ∀作
者根据已经发表的青蒿 °wxs 序列 ⁄±uy{zyv
k≤≠ °zt„∂ tl≈w 设计引物 o以青蒿 ¦⁄‘„为模板 o通
过 • ×2°≤• 获得了和已经发表的 °wxs序列一致的
⁄‘„序列 ∀ 同时还获得了同源性很高的另一个
¦⁄‘„序列 oŠ ±¨…¤±®注册号是 ⁄±yyztzt∀利用生
物信息学手段对该 ¦⁄‘„序列的结构特点进行了分
析 o还获得了该 ¦⁄‘„序列相对应的基因组序列 ∀
结果表明 o该青蒿 ¦⁄‘„序列是一个新的 °wxs序
列 o而且和已经发表的青蒿 °wxs ≤≠°zt„∂ t有很高
的同源性 ∀
1 材料与方法
1q1 植物材料 青蒿为本试验室组培苗 ∀
1q2 菌种和试剂 宿主菌 Ε. χολι ׊t本实验室保
存 o用于质粒克隆 ∀ 克隆质粒 ³ ⁄t{2×o∞÷ פ´
⁄‘„聚合酶 o×w连接酶均购自大连宝生物工程公
司 ~⁄‘„ 胶回收试剂盒购自 ……Œ公司 ~ ׫¨ µ°²2
≥¦µ¬³·× • ×2°≤• ≥¼¶·¨°试剂盒购自 Œ±√¬·µ²ª¨ ±公司 ∀
其他生化试剂均为市售分析纯 ∀
1q3 青蒿 °wxs ¦⁄‘„基因的获得 青蒿总 • ‘„
的提取方法参考文献 ≈x ∀提取青蒿总 • ‘„后 o利
用 Œ±√¬·µ²ª¨ ±公司的 ׫¨ µ°²≥¦µ¬³·× • ×2°≤• ≥¼¶·¨°o
反转录成 ¦⁄‘„∀根据已经发表的青蒿 °wxs ¦⁄‘„
序列 o设 计 引 物 „• z k „• z} xχ2ŠŠŠ„×≤≤„׊2
Š≤„≤×≤×≤„≤׊„≤≤„≤ 2vχl和 „• tx k „• tx} xχ2
ŠŠ×≤Š„≤≤ׄŠ„„„≤×׊Š„„≤Š„Š×„„2vχlo以青
蒿 ¦⁄‘„为模板 o采用如下程序进行 °≤• }|x ε ox
°¬±~|x ε ovs ¶oxt ε ot1x °¬±ozu ε ot1x °¬±ovs
¦¼¦¯ ¶¨~zu ε ots °¬±o扩增得到 t条长为 t wyz ¥³的
片段 o将获得片段克隆到 ³ ⁄t{2×上 o选取多个克
隆进行测序 ∀ 测序结果表明 o除了扩增得到
≤≠°zt„∂ t序列之外 o还得到了 t个和 ≤≠°zt„∂ t
同源性很高的 °wxs序列 ∀为验证这个序列的正确
性 o根据该序列又设计了一对特异引物 } °sz•
k °sz• } xχ2„„≤„„≤×≤„Š×≤×××≤××׊„„≤ 2vχl和
°szƒ k °szƒ} xχ2׊„≤≤„≤××≤≤„×׊≤×≤×׊≤≤ 2
vχl∀采用 u种方式确证该 ¦⁄‘„序列的正确性 ∀
首先 o以青蒿 ⁄‘„为模板 o引物为 „• z和 „• txo采
用如下程序进行 °≤• }|x ε ox °¬±~|x ε ovs ¶oxt
ε ou1x °¬±ozu ε ou1x °¬±~zu ε ots °¬±o扩增得到
t条长为 u1w ®¥的片断 oׄ克隆 o选取多个克隆送
样测序 ∀然后以青蒿 ¦⁄‘„为模板 o采用如下程序
进行 °≤• }|x ε ox °¬±~|x ε ovs ¶ow{ ε ot1x °¬±o
zu ε ot1x °¬±ovs ¦¼¦¯ ¶¨~zu ε ots °¬±o引物为
„• zr°sz• 进行 °≤• 扩增 o得到 t条长约 t1x ®¥的
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第 vu卷第 ut期
ussz年 tt月
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ ut
‘²√ °¨¥¨ µo ussz
片段 ~|x ε ox °¬±~|x ε ovs ¶oxv ε ot1x °¬±ozu
ε ot1x °¬±ovs ¦¼¦¯ ¶¨~zu ε ots °¬±o引物为 „• txr
°szƒ进行 °≤• 扩增 o得到 t条长约 t1x ®¥的片段 ∀
将这 u个片段进行 ׄ克隆 o挑取多个克隆送样测
序 ∀
1q4 °wxs编码蛋白性质与功能的预测 用 ∞¬³¤¶¼
中的工具预测 °°wxs蛋白的物理性质 ∀通过 א 2
³µ¨§k«·³}rºººq¦«q °¨¥± ·¨q²µªr¶²©·º¤µ¨rא °• ∞⁄¢
©²µ°q«·° l¯预测 °°wxs蛋白的跨膜区 ∀ 通过 ≥¬ª2
±¤¯°∀通过的保守区 ∀通过 «·³}r¬«ªqª¶©q§¨ r¬«ªr
°¬·²³µ²·q«·° 进¯行亚细胞定位 ∀通过 ≤ ∏¯¶·¤¯ ÷ 和
°«¼¯¬³v1yv构建分子进化树 ∀
2 结果与讨论
2q1 青蒿 °wxs ¦⁄‘„基因的克隆 将以 „• zr
„• tx为引物 o青蒿 ¦⁄‘„为模板扩增得到的条带克
隆到 ³ ⁄t{2×载体中 o⁄‘„ 序列测定发现除了
≤≠°zt„∂ t外 o还得到了一段和 ≤≠°zt„∂ t同源性
很高的 ¦⁄‘„ 序列 o … ¤¯¶·比对发现 o该序列和
≤≠°zt„∂ t有 |xh的同源性 o对获得的序列进行了
确证 ∀首先 o根据该序列合成了一对特异性引物 }
°sz• 和 °szƒo将 „• zr°sz• 和 „• txr°szƒ为引物
获得的片段分别克隆到 ³ ⁄t{2×中 o然后进行测
序 o发现 „• zr°sz• 和 „• txr°szƒ扩增得到的长为
t wyz ¥³的片段完全一样 k图 tlo初步证明了该序
列的正确性 ∀紧接着 o以 „• zr„• tx为引物 o以青
蒿 ⁄‘„为模板 o扩增得到 t条长为 u vu{ ¥³的基因
组片段 k图 ulo将测序后的序列去掉内含子 o把外显
子拼接起来 o得到的片段和先前扩增得到的 ¦⁄‘„
序列一致 o由此 o可以确认本研究扩增得到的是一个
新的青蒿 °wxs ¦⁄‘„序列 ∀该 ¦⁄‘„全长为 t wyz
¥³o编码 w{{个氨基酸 o暂定名为 °°wxsk³∏·¤·¬√¨
°wxslo提交 Š ±¨…¤±®获得序列号 ⁄±yyztzt k图
vl∀其相应的基因组序列含有 u段内含子 o大小分
别为 xt{和 vvw ¥³∀
2q2 °°wxs蛋白性质与功能的预测
2q2q1 °°wxs物理性质的预测 用 ∞¬³¤¶¼中的工
具 l预测 °°wxs蛋白的物理性质 o得到如下结果 }相
对分子质量是 xw1||u ®⁄¤~等电点是 {1{vo其中含
有 xv个带负电荷的氨基酸残基 ox|个带正电荷的
氨基酸残基 o因此 o在进行蛋白纯化时 o应该选择弱
阳离子介质进行离子交换色谱 ~不稳定指数为
wv1xso一般而言 o不稳定指数小于 ws时 o蛋白是稳

图 t 青蒿 °wxs ¦≤‘„ °≤• 结果
tq„• z r°’z• °≤• 扩增的结果 ~uq„• txr°’zƒ °≤• 扩增的结果
图 u 青蒿 °wxs基因组 ⁄‘„扩增结果
tq„• z r„• tx扩增青蒿基因组 ⁄‘„的结果 ~ q⁄txsss
定的 o超过 ws则认为该蛋白不稳定 ∀ 因此 o预测
°°wxs不稳定 o可能该蛋白是个不成熟多肽 o还需要
经过翻译后加工才能形成稳定蛋白 ∀脂肪指数 k¤¯¬2
³«¤·¬¦¬±§¨ ¬l是 ||1xx∀总平均疏水值 kªµ¤±§ ¤√ µ¨2
¤ª¨ ²©«¼§µ²³¤·«¬¦¬·¼oŠ• „∂ ≠ l为 p s1tuyo是个亲水
蛋白 o其中含有较多的亮氨酸 k¨∏l∀
2q2q2 °°wxs跨膜区的预测 通过 א ³µ¨§k«·³}r
ºººq¦«q °¨¥± ·¨q²µªr¶²©·º¤µ¨rא °• ∞⁄¢©²µ°q«·° l¯
预测 °°wxs蛋白的跨膜区 o得到如下结果 }°°wxs蛋
白有 u个跨膜螺旋 o分别是 t2t|和 wvt2wxt u个区
域 o而且 ¶¦²µ¨值很高 o因此 o是个跨膜蛋白 ∀
2q2q3 °°wxs信号肽的预测 通过 ≥¬ª±¤¯°}结果显
示 o这个蛋白和绝大多数 °wxs一样 o存在转运信号
肽序列 o介于 ux ∗ uyk‘‘l或 uu ∗ uvk‹  l∀
2q2q4 °°wxs保守区的预测 通过的保守区 }„类
°wxs蛋白质一般共有 v个高度保守的区域 }k∂ rŒlŽ∞÷
krƒl• oƒ÷°≥• ƒ和 °ƒŠ ≅ Š ≅ • ≅ ≤ ≅ Šo其中 k∂ rŒl
Ž∞÷krƒl• 具有一定的可变性 o只有 ∞kŠ ∏¯l和 „µª
k• l是高度保守的 o他们与来自 ƒ÷°≥• ƒ的 • k„µªl形
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成一个 ∞• • 三联体 o通过形成盐桥锁定 ≤¼¶口袋进入
催化位置来确保血红素辅基与 °wxs蛋白的结合 o行使
正常的 °wxs功能 ∀在该蛋白中找到了 v个高度保守
的结构域 }∂ ŒŽ∞׏• oƒŒ°∞• ƒ和 °ƒŠ„Š• •  ≤°Šo这是
v个在 „类 °wxs中的特征性保守区 ≈y  ∀因此 o推断此
°wxs也属于 „类 °wxs蛋白 ∀
图 v °°wxs测序序列
2q2q5 °°wxs亚细胞定位 通过 «·³}rr¬«ªqª¶©q
§¨ r¬«ªr°¬·²³µ²·q«·° 进¯行亚细胞定位 }该蛋白定位
于线粒体的可能性较大 k可能性为 s1{|v ul∀通过
进行亚细胞定位 }结果显示 o这个蛋白更多地是在分
泌途径中 k可能性为 s1|ttlo这与其 ‘末端有转运
肽不无关系 ∀
综上所述 o°°wxs编码的蛋白具有如下性质 }≠
通过分析 o结果显示 o这是个中等相对分子质量的碱
性蛋白 k碱性氨基酸个数 酸性氨基酸个数 lo该蛋
白不稳定 o是个亲水蛋白 kŠ• „∂ ≠ € p s1tuylo其中
含有较多的亮氨酸 k¨∏l∀  通过 א ³µ¨§分析 o揭
示 °°wxs有 u个跨膜螺旋 o而且 ¶¦²µ¨值很高 o因此 o
是个跨膜蛋白 ∀蛋白质序列含有跨膜区提示它可能
作为膜受体起作用 o也可能是定位于膜的锚定蛋白
或者离子通道蛋白等 o从而 o含有跨膜区的蛋白质往
往和细胞的功能状态密切相关 o从 °wxs的功能来分
析 o作为膜的锚定蛋白的可能性较大 ∀ ≈ 利用 ≥¬ª2
±¤¯°分析 o可以看出此蛋白和绝大多数 °wxs一样 o
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存在转运信号肽序列 ∀ …通过 ≤⁄⁄k¦²±¶¨µ√ §¨ §²2
°¤¬± §¤·¤¥¤¶¨l分析 o°°wxs存在和 „型 °wxs所共
有的 v个保守结构域 o初步推断 o这是一个 „型
°wxso换句话说 o它参与的是细胞内次生代谢物的
合成反应 ∀   通过亚细胞定位 o发现该蛋白更多地
是在分泌途径中 o这与其 ‘末端有转运肽不无关
系 ∀最后定位于线粒体中 o发挥氧化合成反应 ∀
2q3 °°wxs与已经发表青蒿 °wxs性质的比较
≤≠°zt„∂ t是已经发表的青蒿 °wxso它是能连
续催化紫穗槐 2wott2二烯生成青蒿醇 o青蒿醛 o进而
生成青蒿酸的多功能酶 o参与植物次生代谢 o是个典
型的 „型 °wxs≈w  ∀用生物信息学手段对 °°wxs和
≤≠°zt„∂ t性质进行了对比 k表 tl∀可以看出 o这 u
个 °wxs的性质很接近 o这与它们同源性高达 |xh
是一致的 o也说明这 u个 °wxs有可能在青蒿中执行
类似的功能 ∀
表 t °°wxs和 ≤≠ °zt„∂ t性质比较
因素 等电点 不稳定指数 脂肪指数 总平均疏水值 跨膜螺旋 信号肽位置 定位到线粒体的可能性
°°wxs {1{v wv1xs ||1xx p s1tuy u ux ∗ uyk‘‘l~uu ∗ uvk‹   l s1{|v u
≤≠ °zt„∂ t |1tv wv1zv tss1y| p s1txw u t| ∗ usk‘‘o‹   l s1|v{ {
2q4 °wxs分子进化树的构建
选取 不 同 家 族 的 植 物 °wxs 蛋 白 o包 括
⁄±yyztzto通过最大简约法构建进化树 ∀这些植物
°wxs蛋白有救荒野豌豆 °wxs 序列 „ƒsvsuys
k≤≠ °|w„tlo救荒野豌豆脂肪酸羟基化酶序列
„ƒs|u|tzk≤≠°|w„ulo长春花 °wxs序列 „uv{wsu
k≤≠°|y≤tlo „≠t|uxzv k ≤≠°zt⁄tl和 „u|xzt|
k≤≠ °ztlo茄子 °wxs序列 ⁄tw||sk≤≠ °ztlo÷ztyxw
k≤≠ °zt„ulo÷zs|{tk≤≠°zt„tlo÷zs{uwk≤≠°zxl
和 ÷zs|{u k ≤≠°zt„vlo玉米 °wxs序列 ÷{t{uzo
÷{t{u{ k ≤≠°zt≤tlo ÷{t{u| k ≤≠°zt≤ulo ÷{t{vs
k≤≠ °zt≤vl和 ÷{t{vtk≤≠°zt≤wlo辣椒肉桂酸 w2
羟基化酶序列 „ƒs{{{wzk≤≠ °zv„lo甜橙肉桂酸 w2
羟基化酶序列 „ƒuxxstvk≤≠°zvlo拟南芥 °wxs序
列 „…stwwx| k ≤≠ °xt lo ˜t{|u| 和 ˜y|tvw
k≤≠°{vlo小麦 °wxs序列 ≠s|u|tk≤≠°xtlo龙胆黄
酮 vχxχ羟基化酶序列 ˜zuyxwk≤≠ °zxl~番茄阿魏酸
x2羟基化酶序列 „ƒtxs{{tk≤≠ °{wlo芸薹 °wxs序
列 „ƒutwss{k≤≠°{wlo高粱 °wxs序列 „ƒsu|{xy
k≤≠°|{„t l~以 及 青 蒿 °wxs 序 列 ⁄±uy{zyv
k≤≠ °zt„∂ tl∀其中 o„类 °wxs有 ≤≠°zto≤≠°zvo
≤≠°zxo≤≠°z|o≤≠°{vo≤≠°{w和 ≤≠°|{o而非 „类
°wxs有 ≤≠ °xto≤≠°{yo≤≠ °|w和 ≤≠ °|y∀从分子
进化树 k图 wl可以看出 o ⁄±yyztzt k °°wxsl和
⁄±uy{zyvk≤≠°zt„∂ tl进化上很接近 o有可能在青
蒿中执行类似的功能 ∀
3 讨论
抗疟药青蒿素是从青蒿中提取出来的 o由于其
优良的抗疟性质和不断扩大的适应症 o使得对青蒿
的需求持续增加 ∀而目前通过栽培青蒿来提取青蒿

图 w 植物 °wxs进化树图
素处于不稳定状态 ∀因此 o寻找一种稳定供应青蒿
素的替代方法成为了当今青蒿素研究中的一个方
向 ∀以合成生物学为代表的新兴交叉学科的兴起使
人们看到了人工合成青蒿素的希望 ∀这种方法不同
于简单的基因插入或敲除 o它是将不同来源的基因
在微生物中进行组合 o重建一条青蒿素代谢途径 ∀
这样可以通过 /微生物工厂 0稳定地生产青蒿素 o而
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不用考虑天气 !温度等环境因素对栽培青蒿的影响 ∀
青蒿素代谢工程近几年取得了很大的进展 ∀美国
Ž¨¤¶¯¬±ª实验室经过几年的努力 o分别构建了能产
生青蒿素中间体紫穗槐 2wott2二烯和青蒿酸的大肠
杆菌工程菌和酵母工程菌 ≈wozo{  ∀在这种方法中 o克
隆青蒿素生物合成途径相关酶基因并对其进行功能
鉴定是基础 ∀而通过生物信息学技术对获得的基因
进行结构和功能预测是实现基因功能鉴定的第一
步 ∀本研究克隆得到了一个新的 °wxs酶基因 o通过
生物信息学手段对其进行了结构性质的预测 o获得
了一些有价值的信息 }该基因全长 t wyw ¥³o编码
w{{个氨基酸 o相对分子质量是 xw1||u ®⁄¤~等电点
是 {1{voŠ ±¨…¤±®注册号是 ⁄±yyztzt∀
此外 o通过和已经发表的青蒿 °wxs 基因
≤≠°zt„∂ t进行性质比对 o发现 ⁄±yyztzt和已经
发表的青蒿 °wxs基因的同源性很高 k|xh lo而且
基本能肯定这是一个 „型 °wxso即在细胞中执行的
是生物合成的功能 o从进化树分析的结果来看 o该
°wxs酶有可能在青蒿中执行和 ≤≠°zt„∂ t类似的
功能 o因此 o通过对 ⁄±yyztzt进行生物信息学分析
无疑为后续的功能鉴定起到了指导作用 ∀这样 o在
下面的实验中就可以紫穗槐 2wott2二烯为底物 o检
测该基因编码产物是否能作用于紫穗槐 2wott2二
烯 ∀如果确实能将紫穗槐 2wott2二烯催化形成青蒿
酸 o那么就比较它和 ≤≠ °zt„∂ t的作用效果 o择优
构建高效稳定的青蒿酸酵母工程菌 ∀如果不能形成
青蒿酸 o就引出了这么一个问题 }是什么原因导致了
两个性质如此接近的 °wxs在功能上有差异 ∀这将
都是十分有意义的工作 ∀
≈参考文献  
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°¤¯¤µ¬¤¯ §µ∏ª³µ¨¦∏µ¶²µ¤µ·¨°¬¶¬±¬¦¤¦¬§¬± ±¨ª¬±¨¨ µ¨§ ¼¨ ¤¶·≈ q
‘¤·∏µ¨o ussyowws}|wsq
≈x  ²ª¨ °¤±± o ≥¦«¨ ¯¯ o • ¬¯¯°¬·½¨ µ1Œ°³µ²√ §¨° ·¨«²§©²µ·«¨ ¬¶²2
¤¯·¬²± ²©• ‘„ ©µ²° ³¯¤±··¬¶¶∏¨ ¶≈ q „±¤¯ …¬²¦«¨ °o t|{zotyv}
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≈y  °¤´ ∏¨ ·¨ ≥  o …¤® ≥o ƒ ¼¨¨ µ¨¬¶¨± • qŒ±·µ²±2¨ ¬²± ²µª¤±¬½¤·¬²± ¤±§
³«¼¯ ²ª¨ ±¼ ¬± ¤ ¤¯µª¨ ¶∏³¨ µ©¤°¬¯¼o ·«¨ ³¤µ¤¯²ª²∏¶¦¼·²¦«µ²°¨°wxs
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²¯±¤·¨ ³¤·«º¤¼ ¬± Εσχηεριχη χολι ©²µ³µ²§∏¦·¬²± ²©·¨µ³¨ ±²¬§¶≈ q
‘¤·…¬²·¨¦«±²¯o ussvout}z|yq
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¤°²µ³«¤2wo tt2§¬¨±¨ ¬± ¤ ·º²2³«¤¶¨ ³¤µ·¬·¬²±¬±ª ¥¬²µ¨¤¦·²µ²©
° ·¨¤¥²¯¬¦¤¯ ¼¯ ±¨ª¬±¨¨ µ¨§ Εσχηεριχηια χολι≈ 1…¬²·¨¦«±²¯ …¬²¨ ±ªo
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Χλονινγ ανδ βιοινφορµ ατιχσαναλψσισ οφΠwxs χ∆ΝΑ ιν Αρτεµ ισια αννυα
Ž’‘Š ¬¤±2´ ¬¤±ªo • „‘Š • ¬¨o ‹∞‘Š ÷¬¤²2§²±ªo ‹ ˜ °¬±ªo ≤‹∞‘Š Ž¨ 2§¬
(Ινστιτυτε οφΜατερια Μεδιχα, Χηινεσε Αχαδεµ ψ οφΜεδιχαλΣχιενχεσ& Πεκινγ Υνιον ΜεδιχαλΧολλεγε, Βειϕινγ tsssxs, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ≤ ²¯±¬±ª¤±§¥¬²¬±©²µ°¤·¬¦¶¤±¤¯¼¶¬¶²©°wxs ¦⁄‘„ ¬± Αρτεµ ισια αννυαq Μετηοδ : „ °wxs ¦⁄‘„ ª¨ ±¨
º¤¶¦¯²± §¨©µ²° Α. αννυα ¥¼ • ×2°≤• q ׫¨ ¥¬²¬±©²µ°¤·¬¦¶¤±¤¯¼¶¬¶²©·«¨ °wxs ª¨ ±¨º¤¶³¨ µ©²µ° §¨q Ρ εσυλτ: ׫¨ ¦²°³¯ ·¨¨ ’ • ƒ ²©
·«¬¶°wxs ¦⁄‘„ ¬¶t wyw ¥³¤±§ ±¨¦²§¨ ¶w{{ ¤¤q ׫¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ º¤¶µ¨³²µ·¨§·²Š ±¨…¤±® ¤±§¦²§¨ §¤¶⁄±yyztztq …¬²¬±©²µ°¤·¬¦¶¤2
±¤¯¼¶¬¶²©·«¨ °wxs ¦⁄‘„ ¶«²º §¨¬·¨±¦²§¨ §¤± „ 2·¼³¨ °wxs ³µ²·¨¬± º¬·«xw1||u ®⁄¤o ¬·j¶¬¶²¨ ¯¨ ¦·µ¬¦³²¬±·º¤¶{1{v ¤±§·«¨ ³²¶¶¬¥¬¯¬2
·¼ ²© ¬¨³²µ··²°¬·²¦«²±§µ¬¤º¤¶s1{|v uq Χονχλυσιον: ׫¨ ¦²°³¤µ¤¥¯¨¤±¤¯¼¶¬¶²©·«¨ °wxs º¬·«≤≠ °zt„∂ t µ¨√ ¤¨¯ §¨·«¤··«¨ ·º²³µ²2
·¨¬±¶³µ²¥¤¥¯¼ ³¨ µ©²µ° §¨·«¨ ¶¤°¨©∏±¦·¬²± ¥¨ ¦¤∏¶¨ ²©·«¨ ¶¬°¬¯¤µ¦«¤µ¤¦·¨µq
[ Κεψ ωορδσ] Αρτεµ ισια αννυα~ °wxs~ ¥¬²¬±©²µ°¤·¬¦¶¤±¤¯¼¶¬¶~ ≤≠ °zt„∂ t ≈责任编辑 张宁宁  
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