全 文 :不同种源肿节风反丁烯二酸和异秦皮啶
含量研究
闵 芳1,2,斯金平2,黄文华3,黄华宏2,楼少卿2,朱观泉4
(1.浙江师范大学,浙江 金华321000;2.浙江林学院 天然药物研发中心,浙江 临安 311300;
3.中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所,北京 100094;
4.浙江国镜药业有限公司,浙江 龙泉 323000)
[摘要] 目的:揭示肿节风反丁烯二酸和异秦皮啶质量分数的变异规律,为肿节风资源利用与药材质量优化
提供依据。方法:分别建立异秦皮啶与反丁烯二酸的HPLC测定方法,并测定全国21个不同种源肿节风药材中异
秦皮啶与反丁烯二酸的质量分数。结果:不同种源肿节风反丁烯二酸和异秦皮啶质量分数存在显著差异,海拔从
低到高,两者质量分数都逐渐减少;与经度、纬度关系密切,其中异秦皮啶质量分数在肿节风自然分布中心区最高;
肿节风反丁烯二酸和异秦皮啶质量分数地理变异规律不同药材部位表现不一,茎比叶密切。结论:本研究建立的
肿节风反丁烯二酸和异秦皮啶质量分数测定方法简便、准确、重现性好,可用于肿节风药材中此2种成分的质量控
制。研究结果基本代表了我国肿节风药材质量及其差异的现状,与传统观点认为“江西、福建、浙江所产肿节风药
材质量较佳”一致,建议上述区域列为今后肿节风药材良种选育与基地建设的重点。
[关键词] 肿节风;HPLC;反丁烯二酸;异秦皮啶;种源;变异规律
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)15184905
[收稿日期] 20080405
[基金项目] 浙江省重大科技专项项目(2007C12022)
[通讯作者] 斯金平,Tel:13868004019,Email:lssjp@163.com
肿节风(又名草珊瑚、九节茶、接骨木等)为常
用中药,系金粟兰科Chloranthaceae草珊瑚属植物草
珊瑚 Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai的全草[1]。
现代药理和毒理研究表明,肿节风具有抗菌消炎、抑
制流感病毒、促进骨折愈合及镇痛等多种活性,而且
肿节风及其提取物具有较好的安全性[2]。近年来
发现,肿节风用于治疗肿瘤(胰腺癌、胃癌、直肠癌、
肝癌、食道癌等)有较显著效果[34]。《中国药典》
2005年版收载其作为法定药材使用,同时以肿节风
为原料的肿节风片、血康口服液也收入2005年版药
典,肿节风注射液等被部颁中药14册收载[56]。
肿节风主要分布于江西、福建、浙江、安徽、四
川、云南等省区,长期以来其原料一直依赖野生资
源,不同种源的野生药材有效成分存在显著差异,严
重影响中成药的质量[68]。肿节风药材中反丁烯二
酸具有抗菌消炎的药理活性,异秦皮啶对肿瘤细胞
具有抑制作用[9],上述两种成分也是药典与部颁药
品的主要质量控制指标。为此,作者用高效液相色
谱(HPLC)法,以反丁烯二酸(Furmaricacid)和异秦
皮啶(Isofraxidin)为质量控制指标,采集全国主产区
21个肿节风种源药材进行质量评价,研究肿节风反
丁烯二酸与异秦皮啶的变异规律,为肿节风资源利
用与药材质量优化提供依据。
1 材料
Waters高效液相色谱仪,2487双波长紫外检测
器,Breeze33版色谱工作站。反丁烯二酸对照品
(1541200001,中国药品生物制品检定所)、异秦皮
啶对照品(110837200304,中国药品生物制品检定
所),乙腈、甲醇为色谱纯,MiliQ水,其他试剂均为
分析纯。
2006年2~3月,采集浙江缙云、江西新干、江西
遂川、江西信丰、福建长汀、福建南平、福建浦城、浙江
龙泉、浙江泰顺、浙江景宁、浙江遂昌、浙江庆元、广西
东兰、贵州台江、浙江松阳、安徽祁门、浙江开化、四川
峨嵋、广东龙门、云南勐海、浙江宁波等21个种源药
材,每个种源采集样品15株左右,每个样品间距20m
以上,自然阴干后,粉碎过100目筛备用。样品均经
浙江林学院斯金平教授鉴定,除云南勐海样品为海南
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草珊瑚S.hainannensis外,均为草珊瑚S.glabra。
2 方法
2.1 色谱条件 异秦皮啶采用 VenusilC18柱,乙
腈002%磷酸水溶液(30∶70)为流动相,流速05
mL·min-1,紫外检测波长344nm,柱温25℃;反丁
烯二酸采用 SymmetryC18柱,乙腈001mmol·L
-1
磷酸二氢钾(5∶95)为流动相,流速为 04mL·
min-1,紫外检测波长为223nm,柱温30℃。进样
量均为10μL。异秦皮啶对照品及样品色谱图分别
见图1,反丁烯二酸的对照品及样品色谱图分别见
图2,样品溶液的主峰保留时间与对照品一致,其他
共存组分无干扰。
A.对照品;B.供试品;1异嗪皮啶
图1 异嗪皮啶对照品和样品HPLC图
A.对照品;B.供试品;1反丁烯二酸
图2 反丁烯二酸对照品和样品HPLC图
2.2 对照品溶液的制备 精密称取异秦皮啶、反丁
烯二酸对照品适量,分别配制成含 4mg·L-1,40
mg·L-1溶液作为对照品贮备液。
2.3 供试样品溶液的制备 异秦皮啶样品溶液 称
取样品粉末02g,加40mL水,浸泡过夜(室温),
超声处理90min,补水至50mL,精密吸取25mL续
滤液减压浓缩至干,5mL水溶,氯仿萃取(10mL×
5),氯仿层合并,浓缩至干。残渣用甲醇溶解转移
至10mL量瓶,定容至刻度,过022μm的微孔滤
膜,作为样品溶液。
反丁烯二酸样品溶液 称取样品粉末01g,加3
mL水,静置30min,抽滤、用1mL水洗涤残渣后,加
无水乙醇至10mL,4℃冷藏过夜。从中精密吸取2
mL,离心5min(4000r·min-1),取上清液旋转蒸
干,残渣溶于 500μL流动相溶液,离心 5min
(12000r·min-1),上清液过微孔滤膜,待用[10]。
2.4 标准曲线及线性范围 精密称取异秦皮啶对
照品40mg于10mL量瓶中,用流动相溶解并稀释
至刻度。分别取005,01,02,025,05,10,20
mL置10mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,取 10
μL进样测定。以峰面积值(A)为纵坐标,对照品质
量浓度(C)为横坐标,得线性回归方程 A=926×
104C+72963,r=09996,线性范围为002~080
μg。
精密称取反丁烯二酸对照品40mg于10mL
量瓶中,用流动相稀释至刻度。分别取0375,05,
0625,10,20mL置10mL量瓶中,用流动相稀释
至刻度,取10μL进样测定。以峰面积值为纵坐标
(A),对照品质量浓度(C)为横坐标,得线性回归方
程A=115×108C+1010000,r=09993,线性范
围01538~080μg。
2.5 精密度试验 精密吸取异秦皮啶与反丁烯二
酸对照品溶液各10μL,连续进针,记录平均峰面积
各为 20243267和 244827000,其 RSD分别为
32%(n=6)和20%(n=5)。
2.6 稳定性试验 精密吸取异秦皮啶样品溶液10
μL,每天进样1次,共测定5次,异秦皮啶的平均峰
面积为860544,其RSD31%(n=5),表明供试样
品溶液在5d内稳定。
精密吸取反丁烯二酸样品溶液10μL,每2h进
样1次,共测定5次,反丁烯二酸的平均峰面积为
13986570,其 RSD22%(n=5),表明供试样品溶
液在8h内稳定。
2.7 重复性试验 按2.3项方法,分别制备异秦皮
啶、反丁烯二酸样品溶液各5份,按2.1项下色谱条
件测定,异秦皮啶的平均峰面积为96296,其 RSD
16%(n=5);反丁烯二酸的平均峰面积为
2244276,其RSD14%(n=5)。表明异秦皮啶和
反丁烯二酸测定方法的重复性均较好。
2.8 加样回收率试验 采用加样回收法,精密称取
已知质量分数的异秦皮啶和反丁烯二酸样品,加入
适量对照品溶液,混匀,按2.3项方法处理,在上述
色谱条件下测定反丁烯二酸的平均回收率为
9829%,其 RSD57%,异秦皮啶的回收率为
9812%,其RSD18%。
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2.9 样品的测定 21个肿节风样品,按2.3项下
方法,分别制备各种源茎、叶部位的样品溶液,进行
异秦皮啶和反丁烯二酸的 HPLC质量分数测定
见表1。
表1 不同种源肿节风异秦皮啶与反丁烯二酸含量
No 种源
海拔
/m
东经
/°
北纬
/°
异秦皮啶/%
茎 叶
反丁烯二酸/%
茎 叶
1 浙江省缙云县 600 1206 286 00363 00142 00606 00756
2 江西省新干县 200 1155 276 00492 00101 02368 02263
3 江西省遂川县 500 1142 263 00513 00147 01073 00646
4 江西省信丰县 300 1153 254 00567 00151 01057 00849
5 福建省长汀县 250 1162 259 00531 00155 01318 01539
6 福建省南平市 600 1183 269 00372 00088 00992 01281
7 福建省浦城县 800 1184 277 00509 00108 01401 01202
8 浙江省龙泉县 400 1189 279 00478 00083 01040 00912
9 浙江省泰顺县 800 1198 276 00565 00089 00989 01114
10 浙江省景宁县 500 1197 278 00489 00102 01402 00936
11 浙江省遂昌县 600 1192 284 00516 00117 01062 01107
12 浙江省庆元县 850 1191 275 00458 00081 00839 01262
13 广西区东兰县 900 1073 245 00271 00047 00691 01832
14 贵州省台江县 900 1082 266 00489 00157 00857 01055
15 浙江省松阳县 1100 1193 284 00546 00103 00635 01190
16 四川省峨嵋山 600 1032 294 00183 00051 00398 00786
17 安徽省祁门县 450 1177 299 00432 00077 00446 00948
18 浙江省开化县 500 1181 292 00472 00146 00480 01025
19 广东省龙门县 600 1141 238 00256 00111 00780 01123
20 浙江省宁波市 300 1215 295 00342 00100 02682 03449
21 云南省勐海县1) 1300 1001 218 00046 00052 01374 01225
22 种源平均值 - - - 00423 00105 01071 01262
注:1)该样品为海南草珊瑚S.hainannensis
3 结果与分析
3.1 不同种源肿节风异秦皮啶与反丁烯二酸质量
分数差异比较 不同种源地理位置以及异秦皮啶与
反丁烯二酸的质量分数列于表1。从表1可见,云
南省勐海县巴达海南草珊瑚中异秦皮啶与反丁烯二
酸质量分数都较低,其中全草平均数和茎中的异秦
皮啶质量分数均为最低,分别为 00049%和
00046%,肿节风种内种源间异秦皮啶与反丁烯二
酸质量分数也存在极显著的差异。
肿节风种源异秦皮啶的质量分数,全草平均数
江西省信丰县古陂镇最高,达到00359%,其中茎
00567%,叶00151%;其次为福建省长汀县古城
镇00343%,其中茎00531%,叶00155%。茎
中异秦皮啶质量分数,江西省信丰县古陂镇最高,达
到00567%;其次为浙江省泰顺县乌岩岭,达到
00565%;四川省峨嵋山的最低,为00183%,与
江西省信丰县古陂镇最高值相差31倍。叶中异秦
皮啶质量分数,贵州省台江县排羊乡最高,为
00157%;广西省东兰县最低,为00047%;两者相
差33倍。
肿节风种源反丁烯二酸质量分数,全草平均数
浙江省宁波市天童林场最高,达到03066%,其中
茎02682%,叶03450%;其次为江西省新干县黎
山林场02316%,其中茎02368%,叶02263%;
四川省峨嵋山的全草平均数最低,为00592%,其
中茎00398%,叶00786%。肿节风叶片中反丁
烯二酸质量分数浙江省宁波市天童林场最高,达到
03450%;江西遂川最低,为00646%,两者相差
约5倍。肿节风茎中反丁烯二酸质量分数,浙江省
宁波市天童林场最高,为02682%,四川省峨嵋山
最低,为00398%,两者相差约6倍。
3.2 异秦皮啶与反丁烯二酸的地理变异规律 在
肿节风异秦皮啶与反丁烯二酸种源差异的基础上,
进一步了解其地理变异规律对于肿节风遗传改良与
栽培地的选择十分必要。通过异秦皮啶、反丁烯二
酸与各个种源采样点的海拔高度、经度、纬度的相关
关系研究,结果表明不同种源肿节风中异秦皮啶与
反丁烯二酸质量分数随着海拔的降低而增加,反丁
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烯二酸质量分数较高的浙江省宁波市天童林场、江
西省新干县黎山林场分别达到 03066%,0231
6%,其采样点的海拔均小于300m;异秦皮啶质量
分数较高的是江西省信丰县古陂镇、福建省长汀县
古城镇、江西省遂川县大汾镇分别达到00359%,
00343%,00330%,其采样点的海拔均小于500
m。肿节风中反丁烯二酸质量分数与经度、纬度成
正相关,从南到北、从西到东,反丁烯二酸质量分数
逐渐增加;不同种源肿节风异秦皮啶质量分数与经
度、纬度均存在密切相关,在肿节风自然分布中心区
域内最高,见图3,4。异秦皮啶与反丁烯二酸质量
分数与地理位置的关系,不同药材部位表现不一,茎
比叶密切,可能与茎中有关成分长期积累有关,而叶
片因自然更新周期短有关成分积累期短。
图3 肿节风茎中异秦皮啶质量分数与经度的关系
图4 肿节风茎中异秦皮啶质量分数与纬度的关系
3.3 肿节风药材异秦皮啶与反丁烯二酸质量分数
的相关关系 肿节风制剂质量控制,目前主要有异
秦皮啶、反丁烯二酸两个指标,其中肿节风药材中反
丁烯二酸具有抗菌消炎的药理活性,异秦皮啶对肿
瘤细胞具有抑制作用。但目前不同的肿节风制剂有
着不同的测定指标,有时对于某一制剂,其原料和产
品的测定指标也不尽相同。因此研究肿节风异秦皮
啶与反丁烯二酸之间的关系,对于肿节风药材良种
选育及制品质量控制十分必要。通过对21个种源
肿节风异秦皮啶与反丁烯二酸之间的关系的研究,
茎部位相关系数为 00604,叶部位相关系数为 -
01719,全草中相关系数为 -00460,结果表明不
同种源肿节风茎、叶、全草中异秦皮啶与反丁烯二酸
均不存在明显的相关性。
4 结论与讨论
本研究结果基本代表了我国肿节风药材质量及
其差异的现状,进一步证明江西、福建、浙江等肿节
风自然分布中心区质量较佳。同时研究结果也为肿
节风遗传改良给出了有益的提示:一是肿节风药材
良种选育应以自然分布中心区为重点,二是以茎中
的次生代谢产物为主要依据,三是以变异系数大活
性强的成分为改良对象,提高选择效果。但由于所
采样品多数为野生药材,生长年限、生长条件均存在
差异,影响地理变异规律的显示度,如果通过种源试
验,采用栽培年限、栽培条件一致的样品将更加充分
揭示地理变异规律。
关于肿节风制剂质量控制,目前不同的品种有
着不同的测定指标,药典和部颁的肿节风药材和制
剂质量分数测定就有异秦皮啶、反丁烯二酸和总黄
酮等3个指标,显然不利于保证产品质量的稳定。
本研究结果表明不同种源肿节风茎、叶、全草中异秦
皮啶与反丁烯二酸均不存在显著的相关性。而且仅
通过对某一成分的定量考察,不能反映药材或制剂
质量的整体水平。建议从药材源头入手,建立肿节
风药材、中间体及制剂主要活性成分定量与指纹图
谱定性相结合的肿节风种质、药材和产品等多指标
质量综合评价体系,全面、有效控制肿节风及制剂的
质量。
[参考文献 ]
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StudiesonfurmaridacidandisofraxidincontentinSarcandraglabraof
diferentprovenances
MINFang1,2,SIJinping2,HUANGWenhua3,HUANGHuahong2,LOUShaoqing2,ZHUGuanquan4
(1.ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321000,China;
2.CentreforResearchandDevelopmentofNaturalMedicines,ZhejiangFoestryUniversityLin'an311300,China;
3.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalColege,
Beijing100094,China;4.ZhejiangGuojingMedicineLtd.,Longquan323000,China)
[Abstract] Objective:TostudythecontentvariationoffurmaridacidandisofraxidininSarcandraglabrafrom21diferent
provenancesandprovidethebasisforresourceutilizationandqualityoptimizationofS.glabra.Method:HPLCmethodwasdeveloped
todeterminethecontentsoffurmaridacidandisofraxidinin330samplesofS.glabrawhichwerecolectedrespectivelyfrom21difer
entprovenances.Result:ThereweresignificantdiferencesinthecontentsofisofraxidinandfurmaridacidinS.glabrafromdiferent
provenances.Thecontentsofisofraxidinandfurmaridaciddroppedoffromlowaltitudetohighaltitude,whichwerealsoclosewith
longitudeandlatitude.ThecontentofisofraxidininS.glabraatcentralareaofnaturaldistributionwasthehighest.Thediferentparts
oftheplanthaddiferentresults,theinfluenceonthecontentsoftheacitivecomponentsinstemweremoreobviousthantheleaf.Con
clusion:Thissimple,accurateandreproduciblemethodcouldbeusetodeterminethecontentsoffurmaridacidandisofraxidininS.
glabra.TheresultsrepresentedthestatusofmedicinesqualityanddiferenceofChineseS.glabra.Theseagreedwiththetraditional
viewsthatthemedicinesqualityofSarcandraglabrainJiangxi,Fujian,Zhejiangwasbeter.Theseprovenanceswereconsideredas
importantareasofmedicinesbreedingandbasesbuildingonS.glabrainfuture.
[Keywords] Sarcanbdraglabra;HPLC;furmaridacid;isofraxidin;provenance;variation
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20070829
[基金项目] 西安理工大学校基金(108210717)
[通讯作者] 赵洁,Tel:(029)82066360,Email:redflyingbird@yahoo.com.cn
离子交换色谱荧光检测法快速测定枸杞子
中噻菌灵残留量
赵 洁1,何 强2,孔祥虹2,李建华2
(1.西安理工大学 理学院,陕西 西安 710048;
2.陕西出入境检验检疫局,陕西 西安 710068)
[摘要] 目的:建立离子交换色谱荧光检测法快速测定枸杞子中噻菌灵残留量。方法:样品用01%磷酸溶
液提取,采用LCSCX离子交换色谱柱(46mm×25cm,5μm)分离,以01mol·L-1磷酸二氢钾溶液(pH30)乙
腈(70∶30)为流动相,流速10mL·min-1,荧光激发波长307nm,发射波长359nm。结果:样品中噻菌灵能得到良
好的分离,在00005~002mg·L-1峰面积与质量浓度呈良好的线性相关(r=09999),回收率及重复性良好。
结论:该法可用于枸杞子中噻菌灵残留的检测。
[关键词] 噻菌灵;离子交换色谱;荧光检测;枸杞子
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