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Separation and purification process of total flavones and total tannins from Apocynum venetum leaves with macroreticular resin

大孔树脂同步分离纯化罗布麻叶总黄酮和总鞣质的研究



全 文 :大孔树脂同步分离纯化罗布麻叶总黄酮
和总鞣质的研究
张素琼,侯晋军,李青山
(山西医科大学 药学院,山西 太原 030001)
[摘要] 目的:研究大孔吸附树脂同步分离纯化罗布麻叶总黄酮和总鞣质的工艺条件及参数。方法:以静态
饱和吸附量、动态比吸附量、比洗脱量为考察指标,比较不同大孔树脂富集纯化罗布麻叶总黄酮和总鞣质的性能,
并对最佳树脂纯化工艺进行筛选。结果:HPD-400型树脂综合性能最好,其吸附分离工艺条件为:上样液以1BV
·h-1吸附流速上样,纯化水冲洗2BV,60%乙醇洗脱3BV。结论:经HPD-400大孔树脂纯化后的罗布麻叶有效
部位中,总黄酮加总鞣质的质量分数达80%,说明该纯化工艺是可行的。
[关键词] 分离纯化;大孔树脂;有效部位
[中图分类号]R283 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)10114105
[收稿日期] 20070925
[基金项目] 山西省自然科学基金(20031102);山西省教育厅
攻关课题(512500012023)
[通讯作者] 李青山,Tel:(0351)4690322,Email:qingshanl
@yahoo.com
  罗布麻为夹竹桃科植物,其叶是一味传统平肝
清热的中药,用于防治高血压,是中国药典法定的中
药材,其降脂、抗氧化、保肝、抗抑郁等作用已有报
道[1]。本课题组前期研究发现:罗布麻叶总黄酮和
总鞣质部位具有良好的调节血脂的活性[2]。寻找
一种高效、实用的纯化工艺成为进一步研究开发该
有效部位的主要环节。本实验对不同型号大孔吸附
树脂富集纯化性能进行筛选,并对罗布麻叶总黄酮
和总鞣质有效部位分离、纯化工艺条件进行研究,以
确立可行的分离纯化工艺。
1 仪器与材料
UV-260紫外分光光度计(日本岛津);芦丁对
照品(含量测定用,中国药品生物制品检定所,批号
00809705);鞣酸(瓯海化工试剂厂,分析纯);罗布
麻叶药材(运城市药材公司中药饮片厂),经山西医
科大学药学院生药学教研室高建平教授鉴定为罗布
麻属罗布麻ApocynumvenetumL.;大孔吸附树脂(天
津南开大学化工厂)。
2 方法与结果
2.1 上柱液的制备
称取罗布麻叶300g,45%乙醇回流提取3次,
每次加10倍量溶剂回流05h。减压浓缩提取液至
药材量∶浓缩液体积 =1∶10,3200r·min-1离心后
取上清液,作为上柱液。经含测总黄酮质量浓度为
244mg·mL-1,总鞣质为671mg·mL-1。
2.2 含量测定
2.2.1 总鞣质[3]
标准曲线的建立:精密称取鞣酸适量,加30%
乙醇制成每1mL含1mg的溶液。精密量取该溶液
10,20,30,40,50mL,分别置于10mL棕色量
瓶中,加30%乙醇至5mL,然后加01mol·L-1醋
酸醋酸钠缓冲溶液(pH50)至刻度,摇匀。分别精
密量取10mL,分别置于10mL棕色量瓶中,加Fo
lin试剂05mL,混匀,再加15%碳酸钠溶液至刻
度,摇匀。室温放置15min后,以纯化水为空白,在
波长720nm处测定吸光度值(A),计算得回归方程
A=294×10-3C-47×10-3,r=09997,线性范
围1016~5080μg·mL-1。
样品含量测定:取上柱液2mL,定容至适当体
积,过滤,精密量取续滤液2mL,置100mL量瓶中,
加40mL01mol·L-1醋酸醋酸钠缓冲溶液(pH
50),然后加30%乙醇至刻度,摇匀得溶液Ⅰ。精
密量取溶液Ⅰ 10mL置于盛有600mg干酪素的50
mL量瓶中,振荡1h,滤过,滤液摇匀得溶液Ⅱ。分
别精密量取溶液Ⅰ和Ⅱ各1mL,置于10mL棕色量
瓶中,各加 Folin试剂05mL,混匀,再加15%碳酸
钠溶液至刻度,摇匀。室温放置15min后,以纯化
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水为空白,在波长720nm处分别测定 A1和 A2。计
算两者吸光度之差ΔA,由回归方程计算出样品中总
鞣质的含量。
2.2.2 总黄酮
对照品溶液的制备:精密称取芦丁对照品适量,
加60%乙醇制成01602mg·mL-1的溶液,摇匀,
即得。
供试品溶液的制备:取上柱液2mL,定容至适
当体积,过滤,取续滤液即得。
测定方法的确定:精密量取供试品溶液及对照
品溶液各3mL,60%乙醇定容至10mL。以60%乙
醇为空白,在200~380nm测定溶液的吸收曲线及
一阶和二阶导数光谱。结果显示供试品溶液和对照
品溶液在二阶光谱374nm处有共同的最大吸收峰。
故选定在380~361nm处扫描二阶光谱,以374nm
作为测定波长。
标准曲线的建立:精密量取对照品溶液 10,
20,30,40,50mL,分别置 10mL量瓶中,加
60%乙醇至刻度,摇匀。以 60%乙醇作空白,在
380~361nm处扫描二阶导数光谱,测定374nm处
的A值,得回归方程 A=924×10-4C,r=09994,
线性范围1602~8010μg·mL-1。
稳定性试验:精密量取供试品溶液3mL,置于
10mL量瓶中,加60%乙醇至刻度,摇匀。每隔10
min测定A值。结果显示,样品在2h内A值的RSD
为19%,表明稳定性良好。
精密度试验:精密量取对照品溶液2mL,共6
份,分别置于10mL量瓶中,加60%乙醇至刻度,摇
匀。测定 A值。结果吸光度值 RSD15%,表明该
方法精密度高。
加样回收率试验:精密量取供试品溶液2mL,
共6份,分别加入01602mg·mL-1芦丁对照品溶
液1mL,置于10mL量瓶中,加60%乙醇至刻度,
摇匀。测定A值,并计算回收率。结果平均回收率
1012%,RSD37%,表明方法回收率较好。
样品含量测定:精密量取供试品溶液3mL,置
于10mL量瓶中,加60%乙醇至刻度,摇匀。测定A
值,由回归方程计算出样品中总黄酮的含量。
2.3 不同型号树脂筛选研究
2.3.1 树脂预处理[4]
为除去树脂中未聚合单体、致孔剂、分散剂、防
腐剂等有机残留物,需对树脂进行预处理。市售大
孔树脂加入95%乙醇回流洗脱,至洗脱液蒸干后无
残留,洗净的树脂以95%乙醇湿法装柱,用95%乙
醇冲洗至流出液与水混合(1∶5)不呈白色混浊后,
用大量纯化水冲洗至无醇味,备用。
2.3.2 静态吸附试验
取处理好的树脂水溶液,将树脂取出,用吸水纸
吸去表面水分后,称取2g置于干燥的250mL三角
瓶中,精确加入125mL上柱液,振摇,吸附20h,充
分吸附后,滤过,取续滤液。分别按2.1.1和2.2.2
项样品含量方法测定吸附前后总黄酮和总鞣质的浓
度,按下式计算各树脂室温下的静态饱和吸附量
(Q)[5]。
吸附量Q=(C0-Cr)V/W
式中Q为吸附量(mg· g-1),C0为起始质量浓
度(mg·mL-1),Cr为吸附后质量浓度(mg·
mL-1),V为溶液体积(mL),W为树脂质量(g),结
果见表1。
表1 树脂静态吸附考察 mg·g-1 
树脂种类
静态饱和吸附量
总黄酮 总鞣质
AB-8 425 764
S-8 512 1271
HPD-100 557 1248
HPD-100A 384 514
HPD-400 554 972
HPD-450 413 646
HPD-600 285 677
HPD-700 471 925
  试验结果表明,树脂 S-8,HPD-100,HPD-
400对总黄酮和总鞣质静态饱和吸附量均较大,其
余树脂吸附对两种成分的吸附能力较小,故进一步
对S-8,HPD-100,HPD-4003种大孔吸附树脂进
行动态吸附考察。
2.3.3 树脂动态吸附考察
比吸附量是评价树脂真实吸附能力的指标,是
选择树脂种类的参数;比洗脱量是评价树脂解吸能
力与洗脱溶剂的洗脱能力的指标,也是选择树脂种
类及洗脱剂的参数。本实验以比吸附量及比洗脱量
为指标,对上述3种树脂进行筛选。将经预处理的
树脂30mL,湿法装柱 (15cm×15cm),上柱液
以1BV·h-1流速上样,随时采用 FeCl3溶液检测
流出液,以反应变绿为泄漏,停止上样,收集过柱
液;纯化水洗脱至无明显颜色,然后用70%乙醇
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洗脱,流速 1BV·h-1,洗至无明显 AlCl3反应。
分别收集各段洗脱液,定溶至适当体积,按211
和212项样品含量测定方法分别测总黄酮与总鞣
质的含量,计算比吸附量、吸附率、比洗脱量、洗
脱率。见表2,3。
比吸附量=(M上 -M残 -M水洗)/W
M上为上柱液中指标成分的含量;M残为流出残
液中指标成分的含量;M水洗为水洗脱液中指标成分
的含量;W为树脂量。
吸附率(%)=(C0-Cr)/C0×100%
C0:起始质量浓度(mg·mL
-1);Cr为过柱液中
总黄酮质量浓度(mg·mL-1)。
比洗脱量=M洗脱/W
  M洗脱:洗脱液中指标成分的含量。
洗脱率(%)=比洗脱量/比吸附量×100%
表2 总黄酮动态吸附洗脱实验结果
树脂种类
比吸附量
/mg·mL-1
吸附率
/%
比洗脱量
/mg·mL-1
洗脱率
/%
S-8 3102 9750 1452 468
HPD-100 1423 9750 1275 896
HPD-400 1617 9460 1465 906
表3 总鞣质动态吸附洗脱实验结果
树脂种类
比吸附量
/mg·mL-1
吸附率
/%
比洗脱量
/mg·mL-1
洗脱率
/%
S-8 6243 9890 2025 324
HPD-100 3020 9710 2437 807
HPD-400 3575 9540 2871 803
  结果表明:S-8型大孔树脂对2种成分的动态
比吸附量最大,但比洗脱量小,洗脱效率低,许多物
质不能解析,产品损失严重,不能用于产品纯化;
HPD-400大孔树脂对2种成分具有较高的比吸附
量与比洗脱量,由此得出:HPD-400大孔树脂对罗
布麻叶总黄酮和总鞣质具有较好的吸附和解吸性
能,因此将其作为进一步使纯化罗布麻叶总黄酮和
总鞣质所用树脂。
2.4 纯化工艺考察
2.4.1 上样吸附参数的考察
2.4.1.1 上样浓度的考察 取处理好的 HPD-
400型大孔吸附树脂30mL,湿法装柱(15cm×15
cm),取5份上柱液250mL,分别浓缩至药材量浓
缩液体积比为1∶12,1∶10,1∶8,1∶6,1∶4,以1BV·
h-1流速上样,然后用纯化水洗脱至无明显颜色,计
算比吸附量,见表4。
表4 上样液质量浓度对比吸附量的影响
上样液质量
浓度
比吸附量/mg·mL-1
总黄酮 总鞣质
1∶12 994 3065
1∶10 1184 3169
1∶8 1444 3472
1∶6 1739 4137
1∶4 1725 3592
  比吸附量数据表明,随着上样液质量浓度的增
高,树脂吸附量逐渐增加,升高到1∶6时趋于饱和。
2.4.1.2 吸附流速的考察 为了了解不同上样流
速对比吸附量是否有影响,取5份浓度为1∶6的上
柱液150mL,分别以不同流速上样,然后用纯化水
洗脱至无明显颜色,比较不同吸附流速下的比吸附
量,见表5。
表5 吸附流速对比吸附量的影响
吸附流速
/BV·h-1
比吸附量/mg·mL-1
总黄酮 总鞣质
25 12 34
20 14 38
15 14 42
10 17 48
05 18 49
  吸附流速数据表明,随着上样流速减慢,比吸附
量增加,但当流速从 10BV·h-1减至 05BV·
h-1,比吸附量升高不大,但吸附时间显著延长。
2.4.1.3 上样综合考察 为了了解上样浓度与吸
附流速对上样量的综合影响,在前面实验的基础上,
选择了2个水平设计正交实验,见表6,7。
表6 因素水平
水平

质量浓度/mg·mL-1

流速/BV·h-1
1 1∶6 15
2 1∶4 10
表7 正交试验结果
No. 总比吸附量/mg·mL-1
1 6336
2 6940
3 5479
4 5901
  总比吸附量:黄酮和鞣质的比吸附量之和。
直观分析表明,影响因素A>B;方差分析显示,
上样浓度与流速对比吸附量影响不显著。得出最佳
上样条件为 A1B2,即上样浓度为 1∶6,流速为 10
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BV·h-1。
2.4.2 树脂解吸参数的考察
2.4.2.1 水洗除杂用量的确定 树脂解吸前,需要
用水洗脱除去极性大的杂质成分。称取经预处理的
HPD-400大孔树脂30mL,按1∶10径高比湿法装
柱,上柱液150mL,浓度1∶6,以吸附流速 1BV·
h-1上样;分别采用2,4,6,8个体积水冲洗,流速为
1BV·h-1,最后用70%乙醇洗脱至无明显 AlCl3反
应,流速1BV·h-1。按2.1.1和2.1.2项样品含
量测定方法分别测总黄酮与总鞣质的含量。结果总
黄酮 保 留 率 分 别 为 959%,944%,916%,
936%,889%,鞣质的保留率分别为 670%,
660%,640%,637%,589%;70%乙醇洗脱物中
总黄 酮 纯 度 分 别 为 278%,296%,308%,
307%,297%;总 鞣 质 纯 度 分 别 为 606%,
616%,642%,637%,587%。水洗 2BV后
70%乙醇洗脱物中总黄酮与鞣质的纯度已较高,为
了尽量减少指标成分的损失,选择2BV为洗脱除杂
用水量。
2.4.2.2 洗脱溶剂的考察 上样方法同前,水洗2
BV后,依次用不同浓度乙醇洗脱,考察不同浓度乙
醇的洗脱效果,结果见表8。实验过程中,发现黄酮
较难洗脱,而鞣质容易洗脱,因此只考察总黄酮的解
吸参数。
表8 不同体积分数乙醇的洗脱效果
乙醇/% 比洗脱量/mg·mL-1 洗脱率/% 纯度/%
20 36 177 124
40 176 867 289
60 183 901 295
80 183 901 293
  数据表明:随着乙醇体积分数的增加,总黄酮洗
脱率、纯度逐渐提高。醇浓度大于60%后,洗脱效
果与60%乙醇洗脱效果相同,故选择60%乙醇作为
洗脱剂。
2.4.2.3 洗脱剂用量的考察 实验方法同前,采用
60%乙醇洗脱至无明显AlCl3反应。收集洗脱液,每
份10mL,3份为1BV,按2.1.2项样品含量测定方
法测定总黄酮含量。结果表明,60%乙醇在洗脱3
BV后,洗脱百分率达到981%;洗脱4BV后,洗脱
百分率达到99%,综合考虑洗脱效果与成本,采用
60%乙醇洗脱3BV。
2.5 产品纯度的验证
根据上述结果,按最佳条件,称取经预处理的
HPD-400大孔树脂30mL,湿法装柱,上柱液 150
mL,浓度1∶6,以吸附流速1BV·h-1上样;水洗2
BV;60%乙醇洗脱3BV,收集60%乙醇洗脱液,水浴
蒸干,60℃真空干燥4h,得纯化后的有效部位。计
算出膏率为73%。精密称取有效部位样品10mg,
60%乙醇溶解定溶至50mL,按2.1.1和2.1.2项样
品含量测定方法分别测定总黄酮和总鞣质的含量,计
算有效部位中总黄酮与总鞣质的平均含量与转移率。
结果表明:纯化后的有效部位中,总黄酮的含量
达到279%(转移率8350%),总鞣质的含量达到
527%(转移率573%),说明采用本法分离纯化该
有效部位是可行的。
3 讨论
总黄酮含测方法一般采用显色后进行测定,该
方法具有灵敏、取样量少的特点,但显色需一定时
间,尚显不足。采用扫描二阶导数光谱法可以直接
从样品吸收峰中显示出芦丁的相关峰,具有直接测
定的优点,非常适用于工艺研究过程。
为了降低工业化生产成本,尽可能重复利用大
孔树脂,需要对使用过的树脂进行再生处理。实验
中发现,采用95%乙醇以较低流速对树脂进行再生
处理效果较好;再生中较难洗脱的物质主要集中在
柱端,提示工业生产中再生时最好采用逆向洗脱。
大孔树脂的极性、孔径、比表面积是影响吸附性
能的重要因素。遵从相似相容原则,极性较大的树
脂适合用于在弱极性溶液中吸附极性大的物质,极
性小的树脂适合用于在强极性溶液中吸附极性小的
物质。黄酮苷和鞣质类成分为极性物质,而黄酮苷
元类成分极性较小,因此本实验对不同极性以及相
同极性不同结构的8种树脂的对罗布麻叶总黄酮和
总鞣质吸附分离性能进行了考察。并对综合性能较
好的HPD-400型大孔树脂的纯化工艺进行了系统
的研究。结果表明,该工艺具有简单,安全,适合工
业大生产等优点;所得有效部位中总黄酮加总鞣质
的总含量达80%,为罗布麻叶有效部位的研究和开
发奠定了基础。
[参考文献]
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TextualresearchofmedicinalandedibleplantsinShanhaijing
HULiang
(SchoolofBiologyScience,FudanUniversity,Shanghai200433,China)
[Abstract] AccordingtotheshapeandfunctionoftheplantsinShanhaijing,referencetothenotesfrompastscholars,compa
ringwiththeplantsinbotanyliterature,thisarticlemadeatextualresearchofmedicinalandedibleplantsinShanhaijing.Knowledge
oftraditionalChinesemedicinesdescribedinancientbooksisourpreciousintangibleculturalheritage,itshouldbeimportanttotake
measurestoprotectthem.
[Keywords] Shanhaijing;plant;intangibleculturalheritage
[责任编辑 鲍 雷]
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Separationandpurificationprocessoftotalflavonesand
totaltanninsfromApocynumvenetumleaveswithmacroreticularresin
ZHANGSuqiong,HOUJinjun,LIQingshan
(SchoolofPharmaceuticalScience,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatethepurificationprocessoftotalflavonesandtotaltanninsfromApocynumvenetumleaves
withmacroreticularresin.Method:Thestaticcapacityabsorption,dynamicabsorptionratioanddynamicelutionratioofdiferenttypes
ofmacroreticularresinswerestudiedandcomparedinordertofindthebestoneamongtheeightmacroreticularresins,andthetechni
calprocessofthetypeofHPD-400typemacroreticularresinwasstudiedindetail.Result:ThetypeofHPD-400typemacroreticu
larresinshowedthebestcomprehensiveabsorptionpropertywiththefolowingtechnologicalconditions:thecurentvelocitywas1BV·
h-1,thevolumeofdistiledwaterwas2BV,theelutingreagentwas60% ethanol,andthevolumeof60% ethanolwas3BV.Con
clusion:Thepurityoftotalflavonesandtotaltanninsintheproductisupto80% afterpurifiedwithHPD-400macroreticularresin.
Therefore,thispurificationprocessisfeasible.
[Keywords] separationandpurification;macroreticularresin;efectivepart;Apocynumvenetumleave
[责任编辑 鲍 雷]
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