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Studies on genetic diversity in cultivated populations of
Atractylodes macrocephala

药用植物白术栽培群体的遗传多样性研究



全 文 :药用植物白术栽培群体的遗传多样性研究
刘逸慧1,陈斌龙2,周晓龙2,李 攀1,邱英雄1,傅承新1
(1.浙江大学 生命科学学院 植物系统进化与生物多样性研究室,浙江 杭州 310058;
2.浙江省磐安县中药材研究所,浙江 磐安 322300)
[摘要] 目的:研究药材白术Atractylodesmacrocephala国内主要种质资源的遗传多样性,对白术种质遗传分化
进行分析,为白术品种选育提供建议。方法:应用 ISSR分子标记技术对来自浙江磐安3个和浙江、贵州、福建、湖
北的4个白术栽培群体以及来自安徽的1个苍术栽培群体进行遗传多样性分析。结果:用12个 ISSR引物对白术
86个个体和5个苍术个体的DNA进行PCR扩增,共得到63条清晰的条带,其中55条为多态性条带,总多态性位
点(PPL)为8730%。7个白术栽培群体的多态位点(PPL)在5873%~7143%,平均为6485%。其中,磐安县栽
培群体光明表现出最高的遗传变异(PPL=7143%;HE=02835,HO=04267)。根据 POPGEN软件计算得到的
群体之间的遗传距离进行聚类分析,结果显示浙江的各栽培群体有较近的遗传关系,与其他群体已存在遗传分化。
AMOVA分析表明,白术种质遗传分化主要存在于栽培群体内个体间(9052%)。结论:我国栽培白术的种质遗传
多样性较高,有利于培育高品质的药材。
[关键词] 白术;栽培群体,遗传多样性;ISSR
[中图分类号]R282.5 [文献标识码]B [文章编号]10015302(2008)23275606
[收稿日期] 20080121
[基金项目] 浙江省磐安县重大农业项目(2005ZB01)
[通讯作者] 傅承新,Tel:(0571)88206607,Email:cxfu@
zju.edu.cn
  白术为菊科苍术属 Atractylodes多年生草本植
物白术 A.macrocephala的干燥根茎,主要产于浙
江、安徽、湖南、江西等地,其中浙江白术品质上佳。
白术与元胡 Coydalisyanhusuo、浙贝母 Fritilaria
thunbergi、玄参 Scrophulariabuergeriana、白芍 Paeo
nialactiflora共称为“磐五味”,是著名中药材“浙八
味”中的5味药材。磐安地处亚热带季风气候区,
气候温和,降水充沛,光照充足,山岭绵延,地形复
杂[1]。由于独特的地理环境和气候条件,使磐安所
产的这5种药材质量上乘,品质稳定,尤其白术,目
前已形成一定规模的生产基地(种植面积占全国的
20%~30%)[1]。
近年来,国内外对白术的种质资源进行了一些
研究。李金兰等[2]、彭华胜等[3]从本草学角度探索
了白术道地药材的形成历史和与变迁进行了研究。
Shiba等[4]利用ITS序列分析方法对日本的苍术属
Atractylodes的4个种和1个杂交种的干燥根茎DNA
进行了分析,认为 ITS序列分析方法在该类药材的
鉴定中有价值。上述研究对揭示白术的起源、与苍
术的关系以及苍术的遗传分化研究起了重要作用。
但迄今为止,还未见利用分子标记方法对中国不同
产地白术药材的种质资源进行遗传变异分析的相关
报道。
本研究利用 ISSR[5](intersimplesequencere
peats)分析技术对白术7个栽培群体的种质资源进
行遗传分析,旨在阐明国内栽培白术种质资源遗传
多样性和不同产地白术的遗传变异和分化,揭示白
术不同栽培地药材种源之间的遗传关系,为白术资
源的引种栽培、选种和育种提供依据[6]。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2006年6月,采集磐安3个产地及磐安白术种
质园种植的来自国内其他4个不同产地的86个白
术样品和来自安徽的5个苍术(群体代码:CZ)样
品,所有样品的植物经浙江大学生命科学学院傅承
新教授鉴定。每2个样品之间的距离大于5m以保
证采集样品的随机性,同时避免2个样品由克隆繁
殖而来。从每个采样植株上采取少量叶片放入采样
袋中,硅胶干燥保存(表1)。
1.2 DNA提取与PCR扩增
采用改进的 CTAB法[7]进行 DNA提取。ISSR
扩增反应条件经过比较和优化确定为25μL的反应
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   表1 白术7个栽培群体的取样情况
产地 群体代码 采样数
福建寿宁   FJ 12
贵州罗甸   GZ 10
湖北保康   HB 11
浙江磐安光明 GM 11
浙江磐安凌峰 LF 18
浙江磐安仁川 RC 14
浙江天目山  ZJ 10
体系,内含 10mmol·L-1 TrisHCl(pH90),25
mmol·L-1KCl,25mmol·L-1MgCl2,02mmol·
L-1dNTPs,015μmol·L-1ISSR引物,12UTaq
酶(5U·μL-1)和10~20ng模板DNA。PCR扩增
程序为94℃预变性5min,然后进行45个循环:94
℃变性 45s,52~55℃复性 45s,72℃延伸 15
min,循环结束后72℃延伸 10min。PCR产物在 4
℃保存,在含有01% EB的15%的琼脂糖胶中电
泳,以DL2000(大连TAKARA公司)为DNA标准分
子质量对照,然后用凝胶成像系统照相保存。
1.3 ISSR引物筛选
本实验参照大不列颠哥伦比亚大学(University
ofBritishColumbia:ISSRKitNo.9)提供的引物序
列,每个群体选1个个体进行引物筛选,从该系列引
物中筛选扩增信号强、背景清晰、多态性高的引物用
于全部 7个白术栽培群体和 1个苍术栽培群体
DNA样品的扩增。变性温度根据引物的退火温度
变化1~3℃。
1.4 条带统计与数据分析
1.4.1 带的记录与数据矩阵的建立 电泳图谱中
的每一条带均视为1个分子标记,并代表1个引物
的结合位点。按凝胶同一位置上 DNA带的有无进
行统计,有带(包括弱带)的记为“1”,无带的记为
“0”。对群体遗传参数的统计基于2个假设:群体
处于HardyWeinberg平衡;统计条带时认为电泳迁
移率相同的条带是扩增基因组上相同 DNA片段的
产物[8]。
1.4.2 遗传多样性水平和遗传结构的度量 采用
POPGENE131软件分别对全部群体和各单个群体
进行遗传参数分析。分别计算了多态性位点百分数
(PPL,percentageofpolymorphicloci)、观测等位基
因数(NO,numberofalelesperlocus)、有效等位基
因数(NE,efectivenumberofalelesperlocus)、群体
总基因多样性(HT,totalgenediversitypooledoveral
thepopulations)、群体内基因多样性(HS,meangene
diversitywithinpopulations)、各群体间的遗传分化指
数(GST,coeficientofpopulationdiferentiation,GST=
1-HS/HT)和Shannon信息指数(Ho,Shannoninfor
mationindex);计算了 Nei's基因多样性(HE)、Nei's
遗传距离(D,geneticdistance)和遗传一致度(I,ge
neticidentity)[911]。根据 Nei's遗传距离,利用 NT
SYSpc软件对群体进行 UPGMA聚类分析,利用
WINAMOVA155软件[12]对分布于群体内和群体
间的分子变异进行了分析。
2 结果与分析
2.1 白术群体和物种水平遗传多样性分析
从61个 ISSR引物中筛选出12个引物(表2)
对7个白术群体和1个苍术群体进行扩增。12个
引物扩增得到的条带数从3~8条不等,条带片段大
小分布在100~2500bp(图1)。12个引物总共扩
增得到63个条带,其中55条为多态性条带,总的多
态性条带比例为8730%。通过与国内其他草本药
材遗传多样性比较(表3),发现白术遗传多样性在
同类药材中处于较高水平。
表2 用于ISSR扩增的引物及引物扩增的条带数
引物
序列
(5′3′)
退火温度
/℃
扩增总
条带数
多态性
条带数
PPL
/%
UBC811 (GA)8C 55 7 6 8571
UBC812 (GA)8A 55 3 3 100
UBC815 (CT)8G 52 7 6 8571
UBC822 (TC)8A 52 7 6 8571
UBC824 (TC)8G 55 6 4 6667
UBC827 (AC)8G 55 5 5 100
UBC852 (TC)8RA 52 8 8 100
UBC854 (TC)8RG 55 4 2 50
UBC857 (AC)8YG 55 5 4 80
UBC874 (CCCT)4 55 3 3 100
UBC886 VDV(CT)7 52 4 4 100
UBC893 (N)15 55 4 4 100
  注:N=(A,T,C,G);D=(A,G,T);R=(A,G);Y=(C,T);
V=(A,C,G)
  在供试的7个栽培群体中,来自磐安的栽培群
体 GM和 LF表现出最高的遗传变异水平,浙江天
目山的栽培群体 ZJ表现出最低的遗传变异水平
(表4)。
2.2 栽培群体间遗传分化程度的比较分析
根据总的遗传多样性(HT)和群体内遗传多样
性(HS)计算不同群体间的分化水平(GST)。所分析
的7个群体间GST=01749,即表明总的遗传变异
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图1 引物UBC893扩增GM群体11个样品和LF群体18个样品的电泳图谱
表3 白术与其他栽培药材的遗传多样性比较
种类 分子标记 PPL/% 生活型 分布 花粉传播 文献
白术 Atractylodesmacrocephala ISSR 8730 多年生草本 窄域种 动物/风媒 -
人参 Panaxginseng RAPD 461 多年生草本 窄域种 动物   [13]
黄芩 Cutelariabaicalensis RAPD 800 多年生草本 广布种 动物   [14]
鱼腥草 Houtuyniacordata RAPD 941 多年生草本 广布种 动物   [15]
  ISSR 923       [16]
丹参 Salviamiltiorhiza RAPD 1000 多年生草本 广布种 动物   [1718]
铁皮石斛 Dendrobiumoficinale RAPD 9135 多年生草本 窄域种 动物   [19]
地黄 Rehmanniaglutinosa ISSR 7158 多年生草本 广布种 动物   [2021]
  RAPD 699       [22]
厚朴 Magnoliaoficinalis RAPD 8181 落叶乔木  广布种 动物   [23]
百合 Liliumbrowni RAPD 9908 多年生草本 广布种 动物   [24]
甘草 Glycyrhizauralensis RAPD 844 多年生草本 广布种 动物   [25]
  注:繁育系统均以异交为主
表4 7个白术群体和1个苍术群体ISSR遗传多样性比较分析
群体 N NO NE HE HO PPL/%
GM 11 17143(04554) 15359(04042) 02952(02093) 04267(02930) 7143
LF 18 17143(04554) 14991(03821) 02829(02016) 04135(02846) 7143
LS 14 16825(04692) 14836(03932) 02725(02073) 03974(02928) 6825
GZ 10 16190(04895) 14459(04020) 02508(02129) 03652(03024) 6190
ZJ 10 15873(04963) 14128(04128) 02304(02167) 03363(03060) 5873
FJ 12 16349(04853) 14300(04003) 02431(02113) 03566(02984) 6349
HB 11 15873(04963) 14272(04121) 02380(02177) 03457(03085) 5873
  注:括号内为标准误差
中有1749%的变异存在于群体间,群体内的遗传
变异为8251%。
AMOVA结果表明,白术种质遗传分化主要存
在于各个栽培群体内个体间(9052%),栽培群体
间遗传分化很小。群体间和群体内的变异均显著
(P<0001)。
2.3 群体和个体间的聚类分析
用POPGENE软件计算Nei's遗传距离(D)和遗
传一致度(I)。7个白术栽培群体之间的遗传距离
变化范围为00520~01368,遗传一致度变化范
围为08722~09488。磐安栽培群体 GM与 LF
之间的遗传距离最小,为00520;而贵州的群体GZ
与浙江磐安的群体 GM之间遗传距离最大,为
01368。遗传一致度与遗传距离正好相反,群体
GM与群体LF之间的遗传一致度最大,为09488,
群体GZ与群体GM的遗传一致度最小,为09722。
外类群苍术与ZJ群体的遗传距离最大,为03212;
与LF群体的遗传距离最小,为02255。
利用NTSYSpc软件对Nei's遗传距离使用 UP
GMA方法聚类,得到树状图(图2)。所有的白术群
体聚在一起,对照种苍术与白术分化明显,单独聚为
一支。白术群体中,GM和 LF先聚为一支,表明两
者在遗传上几无分化;而 GZ群体与其他白术群体
分化较大。磐安的3个群体首先聚为一支,然后与
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浙江天目山栽培群体聚为一支;福建与湖北的群体
聚为另一支。
图2 白术群体间的聚类分析图
3 讨论
期望杂合度(HE)被认为是衡量一个物种遗传
多样性水平高低的标准[26]。本研究表明白术的期
望杂合度(HE)为03138,与 Nybom
[27]的 RAPD结
果比较,白术的期望杂合度高于双子叶植物平均水
平(HE=0191),表现较高的遗传多样性。
国内有许多运用 ISSR或 RAPD对栽培药材遗
传多样性研究的报道。尽管有些比较研究表明,
RAPD分子标记检测的多态性通常较 ISSR分子标
记低[2830],但从总体上看,ISSR和 RAPD等显性标
记所揭示的遗传多样性水平和群体遗传结构有很大
的可比性[31]。通过研究比较发现,白术的种质遗传
多样性高于人参、黄芩、地黄等草本药材,在国内草
本药材中处于较高的水平。同时本研究还表明栽培
白术遗传多样性也高于近缘种药用植物苍术。
朱晓琴等[6]通过对苍术4个居群的等位酶分
析,发现居群内遗传变异大于居群间,而且居群间的
平均遗传分化值也高于其他物种,认为苍术是多态
性较高的物种。本研究揭示的栽培白术表现出与苍
术相同的结果。苍术属是异花传粉植物,研究发现,
目前栽培苍术和白术的繁殖仍然是通过种子进行
的,保持了野生群体的特性,因此,表现出较大的居
群内变异可能与这种方式有关。
Hamrick和Godt[26]总结了来自种子植物165属
499种共653篇报导等位酶的研究,提出在物种水
平上,影响遗传变异大小的因素有分类地位、分布范
围、生活型、繁育系统和种子散播机制。那些寿命
长、地理分布广、异交为主、风媒传粉、结实率高的物
种往往具有较高的遗传多样性。此外该研究还指出
居群的遗传结构与植物的生活史、地域分布状况、交
配系统、种子扩散机制和演化地位等因素有关。栽
培白术为有性繁殖,且以异交为主,结实率高,这些
特点是白术遗传变异高、群体间遗传分化小的原因。
本研究认为,栽培白术保持较高的遗传多样性是保
持药材白术优良品质和品种选育的基础,应加以保
护,防止遗传衰退。但是,栽培白术的繁育特性也不
利于优良品种的保持,应进行营养繁殖的研究。
本研究的7个白术群体中,磐安县的3个群体
和浙江天目山群体的遗传关系更接近,表现出有共
同的起源,尤其磐安栽培的3个群体,经长期的选育
已表现出一定的遗传一致性,是道地性的基
础[17,32]。其次,磐安栽培群体的遗传多样性要高于
其他群体。据调查,磐安栽培白术最早引自于本地
野生的白术种源 。是否磐安白术野生资源中涵盖
更丰富的变异类型,值得进一步挖掘和研究。
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Studiesongeneticdiversityincultivatedpopulationsof
Atractylodesmacrocephala
LIUYihui1,CHENBinlong2,ZHOUXiaolong2,LIPan1,QIUYingxiong1,FUChengxin1
(1.LaboratoryofPlantSystematicEvolutionandBiodiversity,ColegeofLifeSciences,ZhejiangUniversity,
Hangzhou310058,China;2.InstituteofChineseMedicine,PananCounty,Panan322300,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatethegeneticdiversityofmaingermplasmofAtractylodesmacrocephalainChinaandthege
neticdiferentiationofthegermplasmofA.macrocephala.Method:AmolecularmarkerISSRwasusedtoanalyzethegeneticdiversity
of7populationsofA.macrocephalaandapopulationofA.lancea.Result:TwelveprimerswereusedinthePCRamplificationof86
samplesofA.macrocephalaand5samplesofA.lancea.Sixtythreebandswithsizesrangedfrom100to2500bpweregeneratedfrom
12primers.Ofalthe63bands,55bandswerepolymorphicamong86individualsofA.macrocephala,thepercentageofpolymorphic
bandswere87.30% atthespecieslevel.Thepercentageofpolymorphicbands(PPL)forasinglepopulationrangedfrom58.73% to
71.43% (mean,64.85%).Amongthe7populations,apopulationfromPanan,GMexhibitedhighestvariability(PPL=71.43%;
HE=0.2835;I=0.4267).Adendrogramconstructedbyanunweightedpairgroupmethodofclusteranalysisshowedthatpopula
tionsfromPananconstructedonebranchandseparatedfromotherpopulations.IntheAMOVAanalysis,lowlevelofgeneticdiferentia
tionamongpopulationswasdetected,90.52% ofthevariabilityexistedinpopulation.Conclusion:Thegeneticdiversityofcultivated
A.macrocephalainChinaishigh,whichisgoodfortheproductionofhighqualityherbmedicine.
[Keywords] Atractylodesmacrocephala;cultivatedpopulations;geneticdiversity;ISSR
[责任编辑 吕冬梅]
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