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Effect of Erythrina variegata on Ca2+ homeostasis in ovariectomized rats and action mechanism

刺桐醇提取物对去卵巢大鼠体内钙稳态的影响及作用机制分析



全 文 :刺桐醇提取物对去卵巢大鼠体内钙稳态的影响
及作用机制分析
张 岩 t3 o李晓莉 u o黄文秀 tov
ktq深圳市中药药学及分子药理学研究重点实验室 o广东 深圳 xt{sxz~
uq沈阳药科大学 中药学院 o辽宁 沈阳 ttssty~
vq香港理工大学 应用生物与化学技术系 o香港 l
≈摘要   目的 }考察刺桐醇提取物对去卵巢大鼠体内钙稳态的影响及对小肠近端 !肾脏相关基因表达的调控 ∀
方法 }大鼠手术处理 w周后 o将去卵巢大鼠随机分为模型组 !阳性对照组 !刺桐低 !高剂量组 kvssoyss °ª# ®ªpt #
§pt lo另有 {只为假手术组 o{只为正常对照组 ∀灌胃给药治疗 tw周 ∀血清 !尿液中钙含量采用比色法测定 ∀采用
• ×2°≤• 技术分析小肠及肾脏基因表达 ∀结果 }对体内钙稳态的影响 o与模型组比较 o刺桐提取物高 !低剂量都显著
抑制尿钙排泄 kΠ  s1sstlo并且有效改善去卵巢大鼠低血钙水平 ∀机制分析表明 o刺桐提取物高 !低剂量能够成剂
量依赖性地显著上调大鼠小肠近端 ∂ ⁄• 基因表达 kΠ  s1sxl以及肾脏 ≤¤…°2|®基因表达 kΠ  s1sxl∀结论 }刺桐
醇提取物能够维持去卵巢大鼠体内钙稳态 ∀
≈关键词   刺桐 ~去卵巢 ~钙 ~基因表达
≈中图分类号   • u{xqx ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszlsz2syuz2sw
≈收稿日期   ussy2sz2uy
≈通讯作者   3 张岩 oר¯}kszxxluyzvztzyo∞2°¤¬¯}° §¨¬¦¬± ¼¨¤±
ƒ ¼¤«²²q¦²°q¦±
刺桐 Ερψτηρινα ϖαριεγατα q为豆科植物 o主要分
布于热带地区 ∀在我国 !印度以及东南亚地区 o刺桐
皮 !叶主要用来治疗风湿性综合征 o包括风湿性关节
炎 !四肢痉挛 !腰膝酸痛 o还可以促进妇女分泌乳液
及行经 ∀动物实验表明 o刺桐能够改善去卵巢大鼠
松质骨微观结构 o提高皮质骨生物力学强度 o并明显
抑制去卵巢引起的大鼠的高骨转换 ≈t  ∀实验显示 o
刺桐能够显著促进大鼠成骨样细胞 k˜ • tsyl增
殖 ≈u  ∀体内 !外实验表明 o刺桐具有良好的抗骨质
疏松作用 ∀本实验通过分析刺桐对去卵巢大鼠相关
基因表达的影响 o对其潜在的抗骨质疏松作用机制
进行初探 ∀
1 材料
1q1 动物
v月龄雌性 ≥⁄大鼠 kuux ? |l ªo购于广州中医
药大学实验动物中心 o动物合格证号 }粤检证字第
ussu„ssx号 ∀动物自由饮水及摄食 k饲料含钙量约
th lo光照周期 tu «o室温 uu ∗ uw ε o适应环境 t
周 ∀
1q2 药材
粉碎的刺桐皮 k产自深圳 o经沈阳药科大学生
药学教研室孙启时教授鉴定 l用 {倍体积 yxh乙醇
溶液浸泡 o常压回流提取 v次 o合并提取液 o减压浓
缩 o继而低温真空干燥得棕色粉末备用 o收率为
x1vh ∀
1q3 试剂
tzΒ2雌二醇 k≥¬ª°¤公司 l~钙试剂盒 k北京中生
北控生物有限公司 o批号 vwssutl~引物合成 !琼脂
糖 k北京赛百盛基因技术有限公司 l~×µ¬½²¯ • ¤¨ª¨ ±·!
反转录试剂 kŒ±√¬·µ²ª¨ ±公司 l~ °≤• 试剂 !§‘×°¶k深
圳晶美生物公司 l~’ ¬¯ª² §×o• ‘„¤¶¨ ‹ k°µ²° ª¨¤生
物技术有限公司 l∀氯仿 !异丙醇均为国产分析纯
试剂 ∀
1q4 主要仪器
全自动生化分析仪 k„≤≠’‘vss¬o美国 „¥¥²·
¤¥²µ¤·²µ¬¨¶公司 l~凝胶成像定量系统 k× u „o意大
利 …Œ’ 2• „⁄ ¤¥²µ¤·²µ¬¨¶公司 l~ °≤• 仪 k °×≤ p
susso美国  • ¶¨¨¤µ¦«公司 l~紫外 2可见分光光度
计 k …„ ussso美国 ° µ¨®¬± ∞ °¯ µ¨公司 l~匀浆器 k×
ux … ≥uo德国 Š …‹ i ≤²1ŽŠ公司 l~水平 ⁄‘„电
泳设备 k∞°≥ vsto美国 „° µ¨¶«¤°公司 l∀
#zuy#
第 vu卷第 z期
ussz年 w月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ z
„³µ¬¯o ussz
2 方法
2q1 手术及分组
共 xw只大鼠 o{只做假手术处理 o{只作为正常
对照 ov{只大鼠行双侧去卵巢手术 ∀术后 w周 o去
卵巢大鼠随机分为 w组 }模型组 kν € {l~雌二醇组
k∞u ou °ª# ®ªpt # §pt oν € tsl~刺桐低剂量组 kvss
°ª# ®ªpt # §pt oν € tsl~刺桐高剂量组 kyss °ª#
®ªpt # §pt oν € tsl∀刺桐醇提物干粉溶于蒸馏水
中 o分别配制成剂量为 vsoys °ª# °pt o按照 tss ª
体重给药体积 t °o经灌胃给药 o持续 tw周 ∀
2q2 样本收集
大鼠置于代谢笼 o收集 uw «尿液 ∀在乙醚轻度
麻醉下 o腹主动脉取血 o离心得血清 o保存于 p {s
ε ∀剪取近胃端小肠 k约 v ¦°lo用冰冷 °…≥冲洗 o
将小肠纵向剪开后 o再次用冰冷 °…≥冲洗 o之后置
于玻璃板上 o用盖玻片轻轻刮下黏膜 o置入含 t °
×µ¬½²¯的离心管内保存 o整个过程中所用器具全部事
先用冰冷 °…≥浸泡 o用时取出 ∀迅速取出大鼠双侧
肾 o剥去肾外膜 o保存于 p{s ε ∀
2q3 钙含量测定
使用全自动生化分析仪及相应试剂盒 o采用标
准比色法测定血清 !尿液中钙含量 ∀
2q4 提取 • ‘„及反转录 k• ×l
根据说明书操作步骤 o使用 ×µ¬½²¯提取总 • ‘„o
并在 uys ±°处测定其吸光度 kΑloΑuys rΑu{s比值 
t1{o说明提得总 • ‘„质量很好 ∀取 v Λª总 • ‘„
于 us ˏ反应体系内 o使用反转录酶 ≥∏³¨ µ≥¦µ¬³·× ŒŒ
制备 ¦⁄‘„∀
2q5 多聚酶链扩增反应 k°≤• l
使用半定量 °≤• 方法考察小肠钙结合蛋白 2|®
k≤¤…°2|®lo维生素 ⁄受体 k∂ ⁄• l和肾脏 ≤¤…°2|®o
∂ ⁄• 的基因表达 ∀管家基因 Š„°⁄‹作为内参 ∀加
t ˏ¦⁄‘„模板于 us ˏ°≤• 反应体系 o其中包括 }
vss ±°²¯# pt引物 ot ≅ °≤• 反应缓冲液 ot1x °°²¯
# pt  ª≤ u¯ ouss Λ°²¯# pt §‘×°¶和 t ˜ פ´ ⁄‘„
聚合酶 ∀ °≤• 反应程序 o以最初于 |x ε 变性 v °¬±
开始 o最后于 zu ε 延伸 u °¬±结束 o中间 °≤• 循环
包括 }变性 |x ε otx ¶~退火 xs ε k≤¤…°2|®l rxy ε
k∂ ⁄• oŠ„°⁄‹ lous ¶~延伸 zu ε ous ¶∀ °≤• 产物
于 s1yh 琼脂糖凝胶电泳后 o通过 …¬²2• ¤§公司
±∏¤±·¬·¼ ’± 软¨件进行半定量 ∀基因表达水平以目
标基因 rŠ„°⁄‹表示 ∀
2q6 统计分析
所有数据以 cξ ? σ表示 ∀使用 Šµ¤³«°¤§公司统
计分析软件 °µ¬¶° w对数据进行单因素方差分析 o
×∏µ®¨ ¼检验比较各组间差异 ∀
3 结果
3q1 血清 !尿液钙含量
同假手术组相比 o模型组血钙下降 kΠ  s1sxlo
尿钙排泄提高了将近 t倍 kΠ  s1stl∀雌二醇组明
显提高大鼠血钙水平 o抑制大鼠尿钙排泄 ∀刺桐提
取物组大鼠血钙水平升高 o并呈剂量依赖性的显著
降低大鼠尿钙含量 kΠ s1sstlk见表 tl∀
表 t 刺桐醇提取物对去卵巢大鼠血钙 !尿钙的影响 kcξ ? σl
组别 ν
剂量
r°ª# ®ªpt
血钙
r°ª# pt
尿钙 r肌苷
r°ª# °ªpt
正常 { p tts1{ ? t1y s1suy ? s1ssv
假手术 { p ts|1w ? u1v s1svx ? s1ssw
模型 { p tsv1x ? t1vtl s1sy{ ? s1sszul
雌二醇 ts u ttt1{ ? u1vwl s1suz ? s1ssyxl
刺桐醇提物 ts vss ts{1w ? t1wvl s1suy ? s1sszxl
ts yss tsw1{ ? t1v s1stv ? s1ssvxl
注 }与假手术组比 tl Π  s1sxoulΠ  s1st ~与模型组比 vl Π  s1sxo
wl Π  s1stoxl Π  s1sst
3q2 大鼠小肠近端基因表达
3q2q1 维生素 ⁄受体 k∂ ⁄• l°• ‘„表达 大鼠去
卵巢后 o模型组小肠 ∂ ⁄• 基因表达水平显著降低 ∀
雌二醇 !刺桐提取物高 !低剂量组都显著提高大鼠小
肠 ∂ ⁄• 表达水平 kΠ s1sxlo刺桐的作用呈剂量依
赖性 k见表 ul∀
3q2q2 钙结合蛋白 k≤¤…°2|®l°• ‘„表达 同假
手术组相比 o模型组大鼠小肠近端 ≤¤…°2|®基因表
达水平下降 tvh kΠ  s1sxlo而雌二醇及刺桐提取
物未能有效抑制去卵巢引起的大鼠肠黏膜 ≤¤…°2|®
基因水平的下降 k见表 ul∀
表 u 各组大鼠小肠近端基因表达 kcξ ? σl
组别 ν
剂量
r°ª# ®ªpt
∂ ⁄•
rŠ„°⁄‹
≤¤…°2|®
rŠ„°⁄‹
正常 { p tvx1v ? tx1s tt|1z ? |1|
假手术 { p tu|1u ? tz1y ttx1w ? tu1{
模型 { p tss1s ? tv1|tl tss1s ? tz1utl
雌二醇 ts u txs1x ? vu1vul |x1z ? v1s
刺桐醇提物 ts vss txs1v ? tt1{ul |v1w ? y1{
ts yss txy1u ? tw1uul |u1y ? y1z
注 }与假手术组相比 tl Π  s1sx~与模型组相比 ul Π  s1sx
3q3 大鼠肾脏基因表达
3q3q1 ∂ ⁄• °• ‘„表达 模型组大鼠肾脏 ∂ ⁄• 的
#{uy#
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ z
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°• ‘„表达水平比假手术组显著提高 kΠ s1sxl∀各
治疗组大鼠的肾脏 ∂ ⁄•基因表达同模型组基本处于
同一水平 o无统计学差异 k见表 vl∀
3q3q2 ≤¤…°2|® °• ‘„表达 大鼠去卵巢后肾脏
≤¤…°2|®基因表达水平与假手术组相比并无显著差
别 o雌二醇使大鼠肾脏 ≤¤…°2|®的 °• ‘„水平提高
wsh o而刺桐提取物呈剂量依赖性的提高大鼠肾脏
≤¤…°2|®的 °• ‘„水平 k见表 vl∀
表 v 各组大鼠肾脏基因表达 kcξ ? σl
组别 ν
剂量
r°ª# ®ªpt
∂ ⁄•
rŠ„°⁄‹
≤¤…°2|®
rŠ„°⁄‹
假手术 { p z{1u ? tt1t tts1w ? y1v
模型 { p tss1s ? tv1xtl tss1s ? z1z
雌二醇 ts u |u1| ? z1u twt1u ? |1vul
刺桐醇提物 ts vss |z1{ ? ty1| ttx1w ? x1t
ts yss {{1u ? vs1v tv|1y ? ts1vul
注 }与假手术组相比 tl Π  s1sx~与模型组相比 ul Π  s1sx
4 讨论
肠钙吸收主要有两种方式 ≈v  }一种是按照电化
学梯度 o由高浓度到低浓度 o非饱和的被动转运吸收
方式 ~另一种就是逆着电化学梯度 o由低浓度到高浓
度 o需要能量的主动转运吸收方式 ∀多数情况下 o钙
的主动转运能力是决定钙吸收的重要因素 ∀主动转
运受钙调激素调控 o主要是活性维生素 ⁄!甲状旁腺
激素 k°×‹ l∀活性维生素 ⁄主要通过位于小肠壁
细胞核中的 ∂ ⁄• 发挥作用 ∀本实验结果表明 o刺桐
提取物可以提高小肠 ∂ ⁄• 基因表达水平 o因此提高
了小肠对活性维生素 ⁄的反应活性 o从而提高钙的
主动转运吸收 ∀另外 o各组间 ≤¤…°2|®基因表达无
显著差异 o这与实验用饲料含钙量较高有关 o说明在
高钙饮食情况下 o刺桐对小肠钙结合蛋白的表达没

有影响 o但是 o刺桐对低钙饮食动物小肠 ≤¤…°2|®表
达的影响 o需要作进一步研究 ∀
刺桐对尿钙排泄的抑制作用与其可以提高肾脏
≤¤…°2|®表达有关 o因为 ≤¤…°2|®在肾脏负责钙重
吸收时的转运 ≈w  o此种钙结合蛋白表达升高 o使得
肾钙排泄减少 o重吸收增加 o因此刺桐组的尿钙水平
下降 ∀当然 o还有其他调控肾钙代谢的影响因素 o包
括骨转换 !肾小球滤过率以及其他基因的表达 ≈x  ∀
因此 o今后的研究重点可考察刺桐是否对其他涉及
调控肾钙代谢的因素有作用 ∀
总之 o刺桐通过调控小肠近端 ∂ ⁄• 基因表达以
及肾脏 ≤¤…°2|®基因表达 o使肠钙吸收增加 o尿钙排
泄减少 o从而维持去卵巢大鼠体内的钙稳态 o起到防
治骨质疏松症的作用 ∀
≈参考文献  
≈t  «¤±ª ≠ o ¬÷ o ¤¬• °o ·¨¤¯q „±·¬2²¶·¨²³²µ²·¬¦ ©¨©¨¦·²©
Ερψτηρινα ϖαριεγαταq ¬± ²√¤µ¬¨¦·²°¬½¨ §µ¤·¶≈ q ∞·«±²³«¤µ°¤2
¦²¯o usszots|ktl}tyxq
≈u  ¬÷ o • ¤±ª‘o • ²±ª ≥o ·¨¤¯q ƒ²∏µ± º¨ ¬¶²©¯¤√²±²¬§¶©µ²°
·«¨ ¶·¨° ¥¤µ®²© µ¨¼·«µ¬±¤√¤µ¬¨ª¤·¤≈ q ≤«¨ ° °«¤µ° …∏¯ o¯ ussyo
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≈w  …²∏«·¬¤∏¼ Œo ¤­¨∏± ¶¨¶¨ ⁄o ≤«µ¬¶·¤®²¶≥o ·¨¤¯q ׺² √¬·¤°¬± ⁄v 2
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Εφφεχτ οφ Ερψτηρινα ϖαριεγατα ον Χαu n ηοµ εοστασισ ιν
οϖαριεχτοµ ιζεδ ρατσανδ αχτιον µ εχηανισµ
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(t. Στατε Κεψ Λαβορατορψ οφ Χηινεσε Μεδιχινε ανδ ΜολεχυλαρΠηαρµ αχολογψ, Σηενζηεν xt{sxz, Χηινα;
u. Σχηοολοφ ΤραδιτιοναλΧηινεσε Ματερια Μεδιχα, Σηενψανγ Πηαρµ αχευτιχαλΥνιϖερσιτψ, Σηενψανγ ttssty, Χηινα;
v. ∆επαρτµ εντ οφ Αππλιεδ Βιολογψ ανδ Χηεµ ιχαλΤεχηνολογψ, τηε Ηονγ Κονγ Πολψτεχηνιχ Υνιϖερσιτψ, Ηονγ Κονγ , Χηινα)
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第 vu卷第 z期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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²§¶o ¤±§ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¶¬± §∏²§¨ ±∏° ¤±§®¬§± ¼¨ º µ¨¨ ¤±¤¯¼½¨ §¥¼ µ¨√ µ¨¶¨ ·µ¤±¶¦µ¬³·¤¶¨2³²¯¼° µ¨¤¶¨ ¦«¤¬± µ¨¤¦·¬²± k• ×2°≤• lq Ρ ε2
συλτ: ∞∂ ¬¨·µ¤¦·¶¦²∏¯§¬°³µ²√¨·«¨ ¶¨µ∏° ≤¤¯¨ √¨¯ ¤±§¬±«¬¥¬·¨·«¨ ∏µ¬±¤µ¼ ≤¤ ¬¨¦µ¨·¬²± ¬± ’∂ ÷ µ¤·¶o ¤±§·«¬¶°¬ª«·¥¨ §∏¨ ·²·«¨ ∏³2
µ¨ª∏¯¤·¬²± ²©∞∂ ²± ∂ ⁄• °• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¬± §∏²§¨ ±∏° ¤±§≤¤…°2|® °• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¬± ®¬§± ¼¨q Χονχλυσιον: ∞∂ ¦²∏¯§°¤¬±·¤¬±
≤¤«²° ²¨¶·¤¶¬¶¬± ’∂ ÷ µ¤·¶q
[ Κεψ ωορδσ] Ερψτηρινα ϖαριεγατα~ ²√¤µ¬¨¦·²°¼~ ¦¤¯¦¬∏°~ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±
≈责任编辑 古云侠  
克班宁注射剂在家兔体内的药动学研究
马云淑 t3 o商庆节 t o白一岑 t o孟小斐 u o康绍建 t
ktq云南中医学院 o云南 昆明 yxsuss~
uq山东中医药大学 附属医院 o山东 济南 uxssttl
≈摘要   目的 }建立血清中克班宁 k¦µ¨¥¤±¬± o¨≤µ¨l浓度的高效液相测定方法 o探讨克班宁注射剂在家兔体内
的药动学过程 ∀方法 }家兔按 u1s °ª# ®ªpt量耳缘静脉注射克班宁后 xotsousovsoxsozso|sotts °¬±采血 o用
‹ °≤测定血清中克班宁浓度 o以 ⁄„≥软件拟合药动学参数 ∀结果 }克班宁平均回收率分别为 k{|1w ? u1xlh o
ktsx1w ? w1tlh oktsu1z ? x1{lh ~精密度分别为日内 • ≥⁄ u1{h ov1|h ox1yh ~日间 • ≥⁄分别为 {1uh oy1{h o
z1uh ∀克班宁注射剂在家兔体内成二室模型 o雌 !雄兔体内的药动学参数经 τ检验差异无显著性意义 ∀主要药动
学参数为 }τtruΑ € kv1uwy ? s1uuul °¬±oτtruΒ € kvy1yzx ? x1xuxl °¬±oΧ°¤¬ € kt1wst ? s1syvl °ª# pt oς§ € kx1|u{
? s1{zzl # ®ªpt o≤¯€ ks1sxt ? s1ssvl # °¬±pt # ®ªpt ∀结论 }克班宁静注在家兔体内为超速处置类 kτtru  t «l
药物 o其在体内的分布迅速 !广泛 ∀
≈关键词   克班宁 ~注射剂 ~家兔 ~药动学
≈中图分类号   • u{xqx ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszlsz2syvs2sv
≈收稿日期   ussx2s{2us
≈基金项目   云南省自然科学基金项目 kussu≤ssyl
≈通讯作者   3 马云淑 oר¯}ks{ztlyutuytvo∞2°¤¬¯}¼∏±¶«∏°¤u
ƒ tuyq¦²°q
克班宁 ≈t  k¦µ¨¥¤±¬± o¨≤µ¨l主要存在于防己科千
金藤属云南地不容 Στεπηανινα ψυννανενσισ‹ ≥ ²及
其他几种植物的块茎中 o民间俗称 /山乌龟 0 ∀克班
宁属阿朴菲型生物碱 o研究 ≈u 证明 o它对多种实验
性心律失常具有较强的对抗作用 o作用迅速 ∀此化
合物还具有 ≈vow 镇静 !镇痛 !解痉 !抗惊厥等作用 o是
一值得深入研究开发的生物活性物质 ∀本实验对克
班宁注射剂进行了家兔血药浓度测定和药动学研
究 o经 ⁄„≥药动学程序拟合 o计算其药动学参数 o为
临床用药提供依据 ∀
1 材料
1q1 仪器
≤ p |„高效液相色谱仪 k日本 ≥‹Œ „⁄˜公
司 l~≥°⁄ p ts„∂ °紫外检测器 k≥‹Œ „⁄˜公司 lo
„× p tvs色谱柱恒温箱 k天津奥特赛恩斯仪器有限
公司 l~׊ptyŠ高速台式离心机 k上海安亭科学
仪器厂 l∀
1q2 动物
日本大耳白兔 u1x ∗ u1z ®ªts只 o雌雄各半 o购
自云南生物制药有限公司 o动物合格证号 ssst|sz∀
1q3 药品与试剂
克班宁对照品 o提取自云南地不容 Σ1 ψυν2
νανενσισo纯度为 |{quh ~克班宁注射剂自制 ≈x  k含
克班宁 s1uxh l~甲醇为色谱纯 ~水为重蒸水 ~其他
试剂均为分析纯 ∀
2 方法
#svy#
第 vu卷第 z期
ussz年 w月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ z
„³µ¬¯o ussz