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微波辅助提取-高效液相色谱分析制备鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的研究



全 文 :  收稿日期:2011-01-04   修回日期:2011-01-12
  基金项目:国家自然科学基金(No.20905080);广东省科技计划(No.2009B010900021,2010B030600012)
 *通讯作者:李攻科,女,博士,教授,博士研究生导师,研究方向为复杂体系分离分析,色谱分析.
第27卷第3期
Vol.27 No.3
分 析 科 学 学 报
JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCE
2011年6月

June 2011
文章编号:1006-6144(2011)03-0284-05
微波辅助提取-高效液相色谱分析制备鸡骨草中
相思子碱和下箴刺桐碱的研究
邱贺媛1,2,肖小华1,李攻科*1
(1.中山大学化学与化学工程学院,广东广州510275;
2.韩山师范学院化学系,广东潮州521041)
摘 要:建立了鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的微波辅助提取-高效液相色谱(MAE-
HPLC)分析方法。优化得到的最佳微波辅助提取条件为:以25%甲醇为溶剂、固液比
1∶10(m/V)、提取温度50℃、提取时间10min。分析了广东、广西等7个不同产地鸡骨
草中相思子碱和下箴刺桐碱含量,其中相思子碱含量范围0.03~0.84mg/g,回收率
89.6%~92.9%,相对标准偏差(RSD)0.4%~3.9%;下箴刺桐碱含量范围0.06~
0.62mg/g,回收率88.8%~95.5%,RSD 1.1%~3.4%。利用半制备高效液相色谱
分离得到了相思子碱和下箴刺桐碱对照品,并采用电喷雾质谱(ESI-MS)和核磁共振
(1H NMR)对其结构进行了表征。
关键词:微波辅助提取;高效液相色谱;鸡骨草;相思子碱;下箴刺桐碱
中图分类号:O 657.7+2   文献标识码:A
鸡骨草(Abrus cantoniensis Hance),别名红母鸡草、石门坎、黄食草、细叶龙鳞草、大黄草,是我国传统
中药材和大宗出口中药材之一,主要分布于我国广西、广东、湖南等地[1-2]。鸡骨草现已被开发成鸡骨草
肝炎冲剂等制剂[3-4],其中相思子碱和下箴刺桐碱作为指标成分用于鸡骨草及其相关制品的质量控制[5],
但相思子碱和下箴刺桐碱的对照品难以获得,此外相思子碱和下箴刺桐碱的分离制备鲜有文献提及,这些
均限制了鸡骨草的相关研究。
鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的分析研究中常用的提取技术有加热回流提取、索氏提取及超声波
辅助提取[6-9]等。这些方法一般所需时间长、溶剂消耗量大。微波辅助提取法快速高效、节省溶剂,在食
品、环境和天然产物等领域得到了广泛的应用[10-11]。本研究采用微波辅助萃取-高效液相色谱(MAE-
HPLC)法分析不同产地鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的含量,并结合制备型液相色谱从鸡骨草中分离
制备相思子碱和下箴刺桐碱对照品。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
LC-2010C高效液相色谱仪,带自动进样器,配LC solution工作站(日本,岛津公司),所用色谱柱为
Kromasil ODS柱(250×4.6mm,5μm)。LCMS-2010A液相色谱质谱联用仪包括SCL-10A系统控制
器,LC-6AD泵,SIL-10AF自动进样器,SPD-M10A二极管阵列检测器,配LCMS Solution工作站(日本,
岛津公司),所用色谱柱为Shim-Pack PREP-ODS(H)KIT柱 (250×20mm i.d.,5μm)半制备色谱柱。
Mercury-Plus 300核磁共振波谱仪(美国,VARIAN公司)。MAS-Ⅱ型常压微波合成/萃取反应工作站
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(上海新仪微波化学科技有限公司);RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);B-260恒温水浴锅(上
海亚荣生化仪器厂)。
相思子碱对照品(纯度98%,日本TCI),用分析纯甲醇溶解并配成100μg/mL的对照品溶液。下箴
刺桐碱对照品(纯度>96%,自制),用分析纯甲醇溶解并配成100μg/mL的对照品溶液。甲醇(色谱纯,
德国 Merck公司),乙腈(色谱纯,英国LAB-SCAN公司),无水甲醇、冰乙酸、三乙胺(分析纯,天津市富宇
精细化工有限公司),实验用水为怡宝纯净水(怡宝食品饮料深圳有限公司)。
鸡骨草样品购买于广州采芝林、大森林药店。
1.2 色谱条件
分析型 HPLC条件:流动相为甲醇-乙腈-水(含0.25%冰乙酸,0.37%三乙胺),体积比13∶7∶80;流速
1.0mL/min;紫外检测波长280nm;柱温25℃。梯度洗脱:0~8min,V甲醇/V水/V乙腈 为13/80/7;8~10
min,V甲醇/V水/V乙腈为13/80/7~13/76/11;10~25min,V甲醇/V水/V乙腈 为13/76/11;25~30min,V甲醇/
V水/V乙腈为13/76/11~13/80/7);30~37min,V甲醇/V水/V乙腈为13/80/7。
半制备型HLPC-MS联用条件:流动相为甲醇-乙腈-水,体积比13∶7∶80;流速5.0mL/min;检测波长
280nm;柱温为室温。
1.3 样品溶液制备
准确称取鸡骨草粉末1.00g,放入圆底烧瓶中,加入10mL 25%甲醇,摇匀。放入微波萃取装置中,
在转速1 000r/min、功率300W、温度50℃的微波条件下提取10min。抽滤,将滤液定容至50mL的容
量瓶中,摇匀、静置、待测。
2 结果与讨论
2.1 微波辅助提取条件优化
2.1.1 提取溶剂的选择 分别以水、25%、50%、75%甲醇、无水甲醇、50%乙醇、无水乙醇、0.5%乙酸水
溶液为溶剂,考察不同提取溶剂下鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的提取效果,结果如图1所示。由图1
可知,提取溶剂对鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的提取效果影响较大,当以25%的甲醇为溶剂时,鸡骨
草中相思子碱和下箴刺桐碱的提取率均最高,因此后续实验选择25%的甲醇为提取溶剂。
2.1.2 固液比的选择 以25%的甲醇为提取溶剂,考察了固液比分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30(m/V)时,
对鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的提取效果,结果见图2。在固液比为1∶10时,相思子碱和下箴刺桐
碱提取量已达到最大,故后续实验选择固液比为1∶10。
图1 溶剂对提取率的影响
Fig.1 The effect of extraction solvent on the extrac-
tion efficiency
图2 固液比对提取率的影响
Fig.2 The effect of solid to liquid ratio on the extrac-
tion efficiency
2.1.3 提取温度的选择 以25%的甲醇为提取溶剂,固液比为1∶10(m/V),考察了40、50、60、70℃等不
同提取温度时鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的提取效果,结果见图3。温度变化对相思子碱和下箴刺
桐碱的提取率影响不大。50℃时提取效果较好,故后续实验选择微波提取温度为50℃。
2.1.4 提取时间的选择 以25%的甲醇为提取溶剂,固液比为1∶10(m/V),提取温度为50℃,考察了提
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取时间分别为3、10、17、24min时鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的提取效果,结果见图4。在提取时间
从3min到10min提取出的相思子碱和下箴刺桐碱量有所增加,随着时间继续增加,相思子碱和下箴刺
桐碱提取量变化不大,表明10min时间已经可以提取完全,故后续实验的提取时间定为10min。
图3 温度对提取率的影响
Fig.3 The effect of temperature on the extraction effi-
ciency
图4 时间对提取率的影响
Fig.4 The effect of extraction time on the extraction
efficiency
图5 混合对照品(a)和鸡骨草样品(b)的色谱图
Fig.5 Chromatograms of reference substances(a)
and sample of Abrus cantoniensis(b)
1.abrine;2.hypaphorine.
2.2 鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的分析
在优化的实验条件下,建立了鸡骨草中相思子碱
和下箴刺桐碱的 MAE-HPLC分析方法。取100μg/
mL的对照品溶液分别稀释为0.2、2、8、15、25、40、60、
80μg/mL的系列标准溶液,按上述色谱条件分别进样
10μL,以各组分的峰面积A 对进样量溶液浓度c(μg/
mL)进行线性回归,得线性回归方程、相关系数和线性
范围,结果见表1。相思子碱和下箴刺桐碱对照品和样
品提取液的色谱图如图5所示。
采用建立的 MAE-HPLC方法测定了广东、广西
等7个不同产地的鸡骨草样品中相思子碱和下箴刺桐
碱的含量,结果见表2。
表1 分析方法的回归方程、线性范围、检出限及精密度
Table 1 Regression equation,linear range,correlation coefficient and detection limits
Compounds  Regression equation Linear range(μg/mL)
Correlation
coefficient
Detection limit
(S/N=3,μg/mL)
Precisiona
(n=6,%)
Abrine  A=1.24×104c+1.24×103  0.20~80  0.9999  0.10  3.8
Hypaphorine  A=9.94×103c-3.00×103  0.20~60  0.9998  0.10  3.0
  a:The precision of the method was investigated by the standard solution of 0.4μg/mL abrine and hypaphorine.
表2 不同产地鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱含量(n=3)
Table 2 Contents of abrine and hypaphorine in Abrus cantoniensis from different habitats(n=3)
Origin
Abrine  Hypaphorine
Contents
(mg/g)
Added
(mg/g)
Recovery
(%)
RSD
(%)
Contents
(mg/g)
Added
(mg/g)
Recovery
(%)
RSD
(%)
Foshan  0.16  0.80  89.6  0.4  0.10  0.10  90.2  1.3
Guangzhou  0.41  0.20  90.7  3.4  0.37  0.10  88.8  1.6
Shaoguan  0.22  0.20  90.2  2.0  0.09  0.10  91.4  1.5
Puning  0.84  0.20  91.3  0.6  0.62  0.10  92.1  1.4
Yulin  0.03  0.20  91.9  0.7  0.06  0.10  95.5  3.4
Guangxi  0.18  0.20  92.9  3.9  0.43  0.10  93.6  3.1
Qinzhou  0.63  0.20  91.3  3.1  0.44  0.10  92.7  1.1
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第3期 分 析 科 学 学 报 第27卷
相思子碱的回收率在89.6%~92.9%之间,相对标准偏差(RSD)为0.4%~3.9%;下箴刺桐碱的加
标回收率在88.8%~95.5%之间,RSD在1.1%~3.4%之间。表明MAE-HPLC方法具有较好的准确度
和精密度。
由表2可以看出,7个不同产地的鸡骨草样品中相思子碱和下箴刺桐碱的含量存在较大差异,相思子
碱含量范围在0.03~0.84mg/g之间,下箴刺桐碱含量范围在0.06~0.52mg/g之间,多数样品中相思
子碱含量高于下箴刺桐碱,部分样品中下箴刺桐碱的含量大于相思子碱。这表明可通过固定药材的产地
来控制鸡骨草药材的质量。
2.3 鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱对照品的制备
取鸡骨草样品10.00g,在优化条件下经 MAE提取,提取液采用半制备型液相色谱分离制备,可得到
图6 制备色谱图及对照品色谱图
Fig.6 Chromatograms of extract of Abrus cantoni-
ensis with preparative HPLC,and obtained abrine and
hypaphorine standards
相思子碱和下箴刺桐碱对照品。进一步浓缩后得到相
思子碱(乳白色不定型粉末)和下箴刺桐碱(乳白色不
定型粉末)。制备 HPLC图及得到的对照品 HPLC图
如图6所示。产物经分析型 HPLC检测,相思子碱纯
度>95%,下箴刺桐碱纯度>96%。可以作为一般科
研和检测时的对照品使用。
采用电喷雾质谱(ESI-MS)和核磁共振(1H NMR)
表征收集的对照品,其中,制备产物1的ESI-MS主要
显示m/z219的峰,对应于相思子碱的准分子离子峰
[M+H]+。其1 H NMR (300 MHz,CD3OD)为δ:
7.67(1H,d,J=7.8Hz,H-4),7.32(1H,d,J=8.1
Hz,H-7),7.17(1H,s,H-2),7.08(1H,m,H-6),7.01
(1H,m,H-5),3.62(1H,dd,H-11),3.24(2H,m,H-
10),2.49(3H,s,NH-CH3)。以上结果与文献[12]数据相符,据此判断该化合物为相思子碱。
制备产物2的ESI-MS主要显示m/z247[M+H]+和515[2M+Na]+的峰;其1H NMR(300MHz,
D2O)为δ:7.57(1H,d,J=7.5Hz,H-4),7.41(1H,d,J=7.9Hz,H-7),7.16(1H,t,J=7.3Hz,H-
6),7.15(1H,s,H-2),7.14(1H,t,J=7.5Hz,H-5),3.85(1H,m,H-11),3.40(2H,m,H-10),3.22
(9H,s,NH-(CH3)3)。以上结果与文献[12]数据相符,据此判断该化合物为下箴刺桐碱。
3 结论
本文建立了测定鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的微波辅助提取-高效液相色谱法(MAE-HPLC)分
析方法。方法简单快速、准确可靠。利用半制备高效液相色谱分离得到了相思子碱和下箴刺桐碱对照品,
为鸡骨草资源的开发利用及其相关制品的质量监控提供了基础。
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Analysis and Preparation of Abrine and Hypaphorine in
Abrus Cantoniensis Based Upon Microwave-Assisted Extraction
Coupled with High Performance Liquid Chromatography
QIU He-yuan1,2,XIAO Xiao-hua1,LI Gong-ke*1
(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Sun Yat-Sen University,Guangzhou510275;
2.Department of Chemistry,Hanshan Normal University,Chaozhou,521041)
Abstract:A simple method based upon microwave-assisted extraction(MAE)coupled with high
performance liquid chromatography for the analysis and preparation of abrine and hypaphorine in Abrus
cantoniensis was developed.The optimal conditions for MAE were as folows:extraction solvent,25%
(V/V)methanol;solid to liquid ratio,1∶10;extraction temperature,50℃and extraction time,10min.
The contents of abrine in Abrus cantoniensis from different habitats ranged from 0.03~0.84mg/g,and
the recoveries ranged from 89.6%~92.9% with RSD between 0.4%~3.9%;While the contents of
hypaphorine ranged from 0.06~0.62mg/g,and the recoveries were 88.8%~95.5% with RSD between
1.1%~3.4%.Abrine and hypaphorine were also prepared by semi-preparative high performance liquid
chromatography,and their chemical structures were identified with ESI-MS and 1H NMR.
Keywords:Abrus cantoniensis;Abrine;Hypaphorine;Microwave-assisted extraction(MAE);High
performance liquid chromatography
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