全 文 :胡桃提取物抗 HIV1病毒的初步研究
刘兆梅,温瑞兴,马洪涛,杨怡姝,王小利,吕岫华,李泽琳
(北京工业大学 生命科学与工程学院,北京 100022)
[摘要] 目的:研究胡桃提取物抗HIV1病毒的作用,寻找新型高效的抗HIV病毒中药先导化合物。方法:采
用植物化学柱层析等技术对胡桃进行提取分离,通过体外药效学实验,观察胡桃提取物的抗HIV1病毒作用,并结
合作用靶点的研究对胡桃提取物的作用机制进行探讨。结果:胡桃提取物具有很好的抗 HIV1作用,筛选出6个
抗艾滋病毒作用显著的有效部位,其中2个有效部位的作用靶点分别为gp41跨膜蛋白和HIV整合酶。结论:胡桃
提取物具有很强的体外抗HIV1病毒作用。
[关键词] 胡桃提取物;提取分离;抗HIV1病毒;作用靶点
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)21253504
[收稿日期] 20080410
[基金项目] 北京市自然科学基金预探索项目(7073087)
[通讯作者] 温瑞兴,Tel:(010)67391668,Email:rxwen@
bjut.edu.cn
胡桃JuglansregiaL.为胡桃科核桃属植物,其
枝、叶、外果皮、根皮、坚果内隔及果仁均可入药[1]。
本研究所用的胡桃为胡桃树的嫩枝,其主要含有萘
醌及其苷类、黄酮、二芳基年庚烷类、萜类、有机酸类
等化合物。近年来的药理研究证实,其中某些成分
有抗菌、抗肿瘤、清除氧自由基等作用,对泌尿系统
结石、慢性气管炎、皮炎、湿疹及痢疾等疾病疗效都
很好[25],但是到目前为止,有关胡桃抗 HIV病毒的
研究报道很少[67]。本实验室采用细胞病变效应法
(cytopathicefects,CPE)和p24抗原检测法相结合,
对胡桃提取物进行了体外抗 HIV病毒的药效学研
究,同时采用国际先进的 BIA(biomolecularinterac
tionanalysis)分子偶联技术对胡桃的提取部位进行
作用机制探讨,再以实验结果为指导,有针对性地对
目标产物进行分离纯化,为进一步研究奠定基础。
1 材料
1.1 药材、试剂、病毒 胡桃枝为核桃树的嫩枝,采
于北京当地;阳性对照药 3叠氮脱氧胸苷(AZT)
(Sigma公司);RPMI1640培养基、进口特优胎牛血
清(GIBCO公司);p24抗原检测试剂盒购自河北医
科大学,批号20080313;谷氨酰胺、青链霉素均为国
产试剂。MT4细胞与HIV1ⅢB病毒由本实验室自
行培养。
1.2 仪器 BakerSterilGARDⅢ AdvanceModel
SG403/SG603生物安全柜(美国贝克公司);ELITE
ⅡCO2培养箱(REVCO公司);XDS-1B倒置显微镜
(重庆光学仪器厂);CK40相差显微镜(OLYMPUS
公司);微量加样器(GILSON)。
2 方法
2.1 药物制备 鲜药材洗净,用085%的生理盐水
进行渗漏提取,提取液旋干4℃待用。取干粉80g,
水溶解离心后,上大孔吸附树脂HPD-450进行柱色
谱,用不同浓度的乙醇进行洗脱,得到5个洗脱部位
(A,B,C,D,E),称取 B部位600mg进行 Sephadex
LH-20柱色谱,用50%甲醇进行洗脱,得到22个洗
脱部位(B1B22)。称取 B,E,B1,B3,B20,B22各部
位,用无血清的培养基1mL分别配成实验用药,调
pH70,经022μm滤器过滤,放4℃冰箱待用。
2.2 细胞培养 无菌条件下取 25×105个/mL
MT4细胞加入 25cm2的细胞培养瓶,补加 13mL
RPMI1640全培养基(1%谷氨酰胺,1%青链霉素,
10%胎牛血清),置5%CO2培养箱37℃培养72h,
每隔3d换1次液。
2.3 抗 HIV药物实验法[7] 实验分为给药、细胞
毒对照、病毒对照、AZT对照和细胞对照组。将96
孔板划线分组,把不同药物按倍比稀释取100μL分
别加入各组,再把100μL(25×104个/孔)MT4细
胞分别加入细胞毒对照和细胞对照组,然后把200
倍半数组织细胞感染剂量(TCID)50HIV1ⅢB病毒
与剩余的MT4细胞混匀,放入5%CO2培养箱中37
℃培养30min,取预温好的细胞病毒混悬液100μL
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加入各个给药组的孔中,置5%CO2培养箱37℃培
养6d,第3天后换药1次,于第6天观察结果,结果
判定根据以下公式:
IR(%)=(1-CCTGCCVC)×100%
式中:IR为抑制率,CC为细胞对照,VC为病毒
对照,TG为实验组,1为100%存活率。当细胞对照
生长正常,可以设定 CC的活细胞数为100%,代入
上式,那么TG和VC是1以下相应小数。根据图像
结果估算VC的活细胞平均数约等于 CC的30%,
AZT约等于90%,AZT抑制率计算如下,其余依次
类推:
IR=(1-1-091-03)×100%=857%
2.4 统计方法 本实验采用 CPE法和 p24抗原检
测相结合的方法对实验结果进行评定。全部数据输
入电脑,由 SPSS115统计软件包进行处理统计。
P<005为有显著性差异。
3 结果
CPE法根据图1评判结果。CC组的 MT4细
胞生长状态良好,细胞成团成片生长。VC组细胞生
长状态较差,细胞大量死亡。阳性药 AZT的细胞生
长状态良好,但不及 CC组的细胞。而有效部位 B,
B1,B3,B20,B22和 E在相应剂量下的细胞也成
团成片生长,并且在加入病毒后,细胞生长明显优于
病毒对照组,与 AZT组相差不大,有些组分优于
AZT组,说明这些有效部位均有良好的抗病毒作用。
CC细胞对照;VC病毒对照;AZT阳性药对照;Ba提取物025g·L-1;Bb提取物0125g·L-1;B1a提取物008g·L-1;
B1b提取物004g·L-1;B3a提取物0082g·L-1;B3b提取物004g·L-1;B20a提取物003g·L-1;B20b提取物
0016g·L-1;B22a提取物0106g·L-1;B22b提取物0053g·L-1;E提取物E0099g·L-1
图1 胡桃枝不同提取物抗HIV1作用显微图像(×100)
CPE法检测结果见表1,p24抗原测定结果见表
2,药物治疗指数见表3。
4 作用机制研究
本实验采用BIA分子偶联技术[810],对胡桃提
取部位B和E与靶点蛋白 HIV1整合酶和 gp41跨
膜蛋白进行了作用机制研究。由于 AZT是逆转录
酶抑制剂,对HIV整合酶和 gp41跨膜蛋白没有偶
联作用,所以采用 AZT作为阳性对照药,见
表4,5。
从数据中发现,中药胡桃的这6个组分治疗指
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表1 CPE法检测结果
提取物 剂量/g·L-1 抑制率/%
B 05 95711)
025 92861)
0125 9001)
0063 7502)
0031 500
0016 300
B1 0083 1001)
0042 602)
0025 552)
0012 20
B3 0082 1001)
0041 702)
0021 45
001 10
B20 0016 901)
0008 502)
0004 10
B22 0053 901)
0027 702)
0013 40
0007 10
E 0050 92861)
0025 9001)
00124 7502)
0006 5502)
0003 200
AZT 0038 8572)
病毒对照 - 0
细胞对照 - 100
注:与病毒对照相比1)P<001,2)P<005(表2同)
表2 p24抗原检测法测定结果
提取物
剂量
/g·L-1
A570/A630
p24
/ng·L-1
抑制率
/%
B 05 0075 0 1001)
0125 0077 0 1001)
B1 1598 0085 0 1001)
01 0113 0 1001)
B3 0658 0074 0 1001)
0041 0072 0 1001)
B20 0128 009 0 1001)
0032 0078 0 1001)
B22 0106 0077 0 1001)
0053 0084 0 1001)
E 0099 0083 0 1001)
AZT 0038 0283 1145 88782)
病毒对照 - 1478 10199
细胞对照 - 0032 0
数都比较高,其中B1的抗病毒活性最高,效果最好
(P<001)。
由表中可见,阳性对照药 AZT与 HIVgp41跨
膜蛋白和整合酶基本上无偶联(12RU),胡桃提取
部位B在较低剂量(20mg·L-1)时与靶点 HIV整
表3 样品的治疗指数
样品名称 TC50/g·L-1 IC50/g·L-1 TI
B 17816 00271 65695
E 03220 00055 58353
B1 21433 00222 96630
B3 12317 00208 59100
B20 03437 00078 43840
B22 04065 00178 22840
表4 HIVgp41跨膜蛋白与药物的结合
药物
剂量
/mg·L-1
单位
/RU
名称
剂量
/mg·L-1
单位
/RU
AZT 26 120 AZT 26 108
胡桃B 30 208 胡桃E 30 366
50 279 50 931
125 227 125 5010
表5 HIV整合酶与药物的结合
名称
剂量
/mg·L-1
单位
/RU
名称
剂量
/mg·L-1
单位
/RU
AZT 26 120 AZT 26 108
胡桃B 20 3168 胡桃E 20 276
50 379 100 777
合酶有偶联作用,且结合程度很强(3168RU),而
与靶点gp41跨膜蛋白偶联的程度不很明显,即使在
高剂量(125mg·L-1)时,结合量也仅仅227RU。
提示有效部位B抗HIV的作用靶点为HIV整合酶。
胡桃提取部位E在剂量为125mg·L-1时与靶
点HIVgp41跨膜蛋白结合很强(5010RU),且结合
量呈剂量依赖关系。而与整合酶结合的程度没有
HIVgp41跨膜蛋白明显,但是在较高剂量(100mg·
L-1)时也有结合(777RU),并且也呈现出剂量依
赖关系。提示有效部位 E的主要作用靶点为
HIVgp41跨膜蛋白,HIV整合酶也可能是其中一个
靶点,推测有效部位E对HIV的抑制作用可能存在
于2个不同的靶点蛋白。
5 讨论
由于HIV病毒变异速度快,抗HIV新药研究迫
在眉睫。而逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和整合
酶抑制剂等合成药的开发成本高,易产生耐药性及
较严重的毒副作用,因而国际医学界开始关注天然
植物的研究。本实验是在以往实验基础上进行
的[67],事实说明中药具有很好的抗HIV1病毒的活
性成分,值得深入研究。本实验采用 CPE法结合显
微照相技术使观察结果一目了然,可以直接观察药
物对病毒的实际抑制情况。本研究又在 CPE法基
础上,利用HIVp24抗原检测方法再次验证结果的
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可靠性,达到了2种方法相互比较相互验证的目的。
实验发现,用 CPE方法检测出有效药物,用 p24抗
原检测法检测的结果其抑制率都很高,如有效部位
B在 05g· L-1 CPE法计算出的抑制率为
9571%,p24抗原测定法计算出抑制率为100%;样
品B1,B3,B20和B22在相应剂量下 CPE法和 p24
抗原测定法得出的结果基本相符。表明 CPE法和
p24抗原测定法得出的结果具有一致性。
由于植物药成分复杂,提取过程可能导致药物
分子结构的变化,本实验采用50℃低温旋转干燥
效果较好。鉴于胡桃水溶性部位抗病毒效果良好,
提示其有效成分在水相中,这为体外细胞学实验提
供了良好的基础。但水溶性好的中药分离提取较困
难,这也是多年来学术界面临的难题,本实验结果
显示中药水溶性有效成分具有很好的应用前景,应
予重视。
BIA是近年新发展的一种利用生物传感技术对
2个或2个以上的生物分子间相互作用进行的实时
监测技术,基本原理是采用光学现象———表面等离
子共振实现的,通过监测传感芯片表面与所结合的
生物分子质量成正比的液体折射率的变化来实时跟
踪生物分子间的相互作用。本试验采用BIACORE
3000分子偶连仪对其进行作用机制研究,以了解
药物发挥作用的具体位点,判断药物的药理作用及
疗效程度,是一种既直观实用又高度敏感的药理学
新方法。
[参考文献]
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InvestigationoninhibitionofHIVⅢBviruswithextractionsofJuglansregia
LIUZhaomei,WENRuixing,MAHongtao,YANGYishu,WANGXiaoli,LVXiuhua,LIZelin
(DepartmentofVirology&Pharmacology,ColegeofLifeScienceandBioengineering,BeijingUniversityofTechnology,
Beijing100022,China)
[Abstract] Objective:TostudytheefectofantiHIVⅢBviruswithextractionsfromJuglansregia,soastosearchingforthe
newandeficaciousleadingcompoundofAIDStherapy.Method:Phytochemicalandchromatographicaltechniqueswereusedtoisolate
compoundsfromJ.regia;MT4celsandHIVⅢBviruswereusedtostudytheefectofantiHIVactivityinvitro.BIACORE3000
moleculecoupledequipmentwereusedforthetargetresearchalso.Result:Twoextractions(B&E)wereisolatedfromJ.regiawhich
possesstheefectofantiHIVactivity.TargetsstudyfoundthatextractionBcouldafectedonHIV1gp41fusingproteinandextraction
EcouldafectedonHIV1integraserespectively.Conclusion:J.regiaisatraditionalChinesemedicinewithactiveantiHIVactivity
andworthtobestudiedfurther.
[Keywords] Juglansregia;isolationandpurify;antiHIV1;targets
[责任编辑 古云侠]
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