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Investigation on inhibition of HIVⅢB virus with extractions of Juglans regia

胡桃提取物抗HIV-1病毒的初步研究



全 文 :胡桃提取物抗 HIV1病毒的初步研究
刘兆梅,温瑞兴,马洪涛,杨怡姝,王小利,吕岫华,李泽琳
(北京工业大学 生命科学与工程学院,北京 100022)
[摘要] 目的:研究胡桃提取物抗HIV1病毒的作用,寻找新型高效的抗HIV病毒中药先导化合物。方法:采
用植物化学柱层析等技术对胡桃进行提取分离,通过体外药效学实验,观察胡桃提取物的抗HIV1病毒作用,并结
合作用靶点的研究对胡桃提取物的作用机制进行探讨。结果:胡桃提取物具有很好的抗 HIV1作用,筛选出6个
抗艾滋病毒作用显著的有效部位,其中2个有效部位的作用靶点分别为gp41跨膜蛋白和HIV整合酶。结论:胡桃
提取物具有很强的体外抗HIV1病毒作用。
[关键词] 胡桃提取物;提取分离;抗HIV1病毒;作用靶点
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)21253504
[收稿日期] 20080410
[基金项目] 北京市自然科学基金预探索项目(7073087)
[通讯作者] 温瑞兴,Tel:(010)67391668,Email:rxwen@
bjut.edu.cn
  胡桃JuglansregiaL.为胡桃科核桃属植物,其
枝、叶、外果皮、根皮、坚果内隔及果仁均可入药[1]。
本研究所用的胡桃为胡桃树的嫩枝,其主要含有萘
醌及其苷类、黄酮、二芳基年庚烷类、萜类、有机酸类
等化合物。近年来的药理研究证实,其中某些成分
有抗菌、抗肿瘤、清除氧自由基等作用,对泌尿系统
结石、慢性气管炎、皮炎、湿疹及痢疾等疾病疗效都
很好[25],但是到目前为止,有关胡桃抗 HIV病毒的
研究报道很少[67]。本实验室采用细胞病变效应法
(cytopathicefects,CPE)和p24抗原检测法相结合,
对胡桃提取物进行了体外抗 HIV病毒的药效学研
究,同时采用国际先进的 BIA(biomolecularinterac
tionanalysis)分子偶联技术对胡桃的提取部位进行
作用机制探讨,再以实验结果为指导,有针对性地对
目标产物进行分离纯化,为进一步研究奠定基础。
1 材料
1.1 药材、试剂、病毒 胡桃枝为核桃树的嫩枝,采
于北京当地;阳性对照药 3叠氮脱氧胸苷(AZT)
(Sigma公司);RPMI1640培养基、进口特优胎牛血
清(GIBCO公司);p24抗原检测试剂盒购自河北医
科大学,批号20080313;谷氨酰胺、青链霉素均为国
产试剂。MT4细胞与HIV1ⅢB病毒由本实验室自
行培养。
1.2 仪器 BakerSterilGARDⅢ AdvanceModel
SG403/SG603生物安全柜(美国贝克公司);ELITE
ⅡCO2培养箱(REVCO公司);XDS-1B倒置显微镜
(重庆光学仪器厂);CK40相差显微镜(OLYMPUS
公司);微量加样器(GILSON)。
2 方法
2.1 药物制备 鲜药材洗净,用085%的生理盐水
进行渗漏提取,提取液旋干4℃待用。取干粉80g,
水溶解离心后,上大孔吸附树脂HPD-450进行柱色
谱,用不同浓度的乙醇进行洗脱,得到5个洗脱部位
(A,B,C,D,E),称取 B部位600mg进行 Sephadex
LH-20柱色谱,用50%甲醇进行洗脱,得到22个洗
脱部位(B1B22)。称取 B,E,B1,B3,B20,B22各部
位,用无血清的培养基1mL分别配成实验用药,调
pH70,经022μm滤器过滤,放4℃冰箱待用。
2.2 细胞培养 无菌条件下取 25×105个/mL
MT4细胞加入 25cm2的细胞培养瓶,补加 13mL
RPMI1640全培养基(1%谷氨酰胺,1%青链霉素,
10%胎牛血清),置5%CO2培养箱37℃培养72h,
每隔3d换1次液。
2.3 抗 HIV药物实验法[7] 实验分为给药、细胞
毒对照、病毒对照、AZT对照和细胞对照组。将96
孔板划线分组,把不同药物按倍比稀释取100μL分
别加入各组,再把100μL(25×104个/孔)MT4细
胞分别加入细胞毒对照和细胞对照组,然后把200
倍半数组织细胞感染剂量(TCID)50HIV1ⅢB病毒
与剩余的MT4细胞混匀,放入5%CO2培养箱中37
℃培养30min,取预温好的细胞病毒混悬液100μL
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加入各个给药组的孔中,置5%CO2培养箱37℃培
养6d,第3天后换药1次,于第6天观察结果,结果
判定根据以下公式:
IR(%)=(1-CCTGCCVC)×100%
式中:IR为抑制率,CC为细胞对照,VC为病毒
对照,TG为实验组,1为100%存活率。当细胞对照
生长正常,可以设定 CC的活细胞数为100%,代入
上式,那么TG和VC是1以下相应小数。根据图像
结果估算VC的活细胞平均数约等于 CC的30%,
AZT约等于90%,AZT抑制率计算如下,其余依次
类推:
IR=(1-1-091-03)×100%=857%
2.4 统计方法 本实验采用 CPE法和 p24抗原检
测相结合的方法对实验结果进行评定。全部数据输
入电脑,由 SPSS115统计软件包进行处理统计。
P<005为有显著性差异。
3 结果
CPE法根据图1评判结果。CC组的 MT4细
胞生长状态良好,细胞成团成片生长。VC组细胞生
长状态较差,细胞大量死亡。阳性药 AZT的细胞生
长状态良好,但不及 CC组的细胞。而有效部位 B,
B1,B3,B20,B22和 E在相应剂量下的细胞也成
团成片生长,并且在加入病毒后,细胞生长明显优于
病毒对照组,与 AZT组相差不大,有些组分优于
AZT组,说明这些有效部位均有良好的抗病毒作用。
CC细胞对照;VC病毒对照;AZT阳性药对照;Ba提取物025g·L-1;Bb提取物0125g·L-1;B1a提取物008g·L-1;
B1b提取物004g·L-1;B3a提取物0082g·L-1;B3b提取物004g·L-1;B20a提取物003g·L-1;B20b提取物
0016g·L-1;B22a提取物0106g·L-1;B22b提取物0053g·L-1;E提取物E0099g·L-1
图1 胡桃枝不同提取物抗HIV1作用显微图像(×100)
  CPE法检测结果见表1,p24抗原测定结果见表
2,药物治疗指数见表3。
4 作用机制研究
本实验采用BIA分子偶联技术[810],对胡桃提
取部位B和E与靶点蛋白 HIV1整合酶和 gp41跨
膜蛋白进行了作用机制研究。由于 AZT是逆转录
酶抑制剂,对HIV整合酶和 gp41跨膜蛋白没有偶
联作用,所以采用 AZT作为阳性对照药,见
表4,5。
从数据中发现,中药胡桃的这6个组分治疗指
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   表1 CPE法检测结果
提取物 剂量/g·L-1 抑制率/%
B 05 95711)
  025 92861)
  0125 9001)
  0063 7502)
  0031 500
0016 300
B1 0083 1001)
  0042 602)
  0025 552)
0012 20
B3 0082 1001)
  0041 702)
  0021 45
  001 10
B20 0016 901)
  0008 502)
  0004 10
B22 0053 901)
  0027 702)
  0013 40
  0007 10
E 0050 92861)
  0025 9001)
  00124 7502)
  0006 5502)
  0003 200
AZT 0038 8572)
病毒对照 -  0
细胞对照 - 100
  注:与病毒对照相比1)P<001,2)P<005(表2同)
表2 p24抗原检测法测定结果
提取物
剂量
/g·L-1
A570/A630
p24
/ng·L-1
抑制率
/%
B 05 0075 0 1001)
  0125 0077 0 1001)
B1 1598 0085 0 1001)
  01 0113 0 1001)
B3 0658 0074 0 1001)
  0041 0072 0 1001)
B20 0128 009 0 1001)
  0032 0078 0 1001)
B22 0106 0077 0 1001)
  0053 0084 0 1001)
E 0099 0083 0 1001)
AZT 0038 0283 1145 88782)
病毒对照 - 1478 10199  
细胞对照 - 0032 0  
数都比较高,其中B1的抗病毒活性最高,效果最好
(P<001)。
由表中可见,阳性对照药 AZT与 HIVgp41跨
膜蛋白和整合酶基本上无偶联(12RU),胡桃提取
部位B在较低剂量(20mg·L-1)时与靶点 HIV整
   表3 样品的治疗指数
样品名称 TC50/g·L-1 IC50/g·L-1 TI
B 17816 00271 65695
E 03220 00055 58353
B1 21433 00222 96630
B3 12317 00208 59100
B20 03437 00078 43840
B22 04065 00178 22840
表4 HIVgp41跨膜蛋白与药物的结合
药物
剂量
/mg·L-1
单位
/RU
名称
剂量
/mg·L-1
单位
/RU
AZT 26 120 AZT 26 108
胡桃B 30 208 胡桃E 30 366
  50 279   50 931
  125 227   125 5010
表5 HIV整合酶与药物的结合
名称
剂量
/mg·L-1
单位
/RU
名称
剂量
/mg·L-1
单位
/RU
AZT 26 120 AZT 26 108
胡桃B 20 3168 胡桃E 20 276
  50 379   100 777
合酶有偶联作用,且结合程度很强(3168RU),而
与靶点gp41跨膜蛋白偶联的程度不很明显,即使在
高剂量(125mg·L-1)时,结合量也仅仅227RU。
提示有效部位B抗HIV的作用靶点为HIV整合酶。
胡桃提取部位E在剂量为125mg·L-1时与靶
点HIVgp41跨膜蛋白结合很强(5010RU),且结合
量呈剂量依赖关系。而与整合酶结合的程度没有
HIVgp41跨膜蛋白明显,但是在较高剂量(100mg·
L-1)时也有结合(777RU),并且也呈现出剂量依
赖关系。提示有效部位 E的主要作用靶点为
HIVgp41跨膜蛋白,HIV整合酶也可能是其中一个
靶点,推测有效部位E对HIV的抑制作用可能存在
于2个不同的靶点蛋白。
5 讨论
由于HIV病毒变异速度快,抗HIV新药研究迫
在眉睫。而逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和整合
酶抑制剂等合成药的开发成本高,易产生耐药性及
较严重的毒副作用,因而国际医学界开始关注天然
植物的研究。本实验是在以往实验基础上进行
的[67],事实说明中药具有很好的抗HIV1病毒的活
性成分,值得深入研究。本实验采用 CPE法结合显
微照相技术使观察结果一目了然,可以直接观察药
物对病毒的实际抑制情况。本研究又在 CPE法基
础上,利用HIVp24抗原检测方法再次验证结果的
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可靠性,达到了2种方法相互比较相互验证的目的。
实验发现,用 CPE方法检测出有效药物,用 p24抗
原检测法检测的结果其抑制率都很高,如有效部位
B在 05g· L-1 CPE法计算出的抑制率为
9571%,p24抗原测定法计算出抑制率为100%;样
品B1,B3,B20和B22在相应剂量下 CPE法和 p24
抗原测定法得出的结果基本相符。表明 CPE法和
p24抗原测定法得出的结果具有一致性。
由于植物药成分复杂,提取过程可能导致药物
分子结构的变化,本实验采用50℃低温旋转干燥
效果较好。鉴于胡桃水溶性部位抗病毒效果良好,
提示其有效成分在水相中,这为体外细胞学实验提
供了良好的基础。但水溶性好的中药分离提取较困
难,这也是多年来学术界面临的难题,本实验结果
显示中药水溶性有效成分具有很好的应用前景,应
予重视。
BIA是近年新发展的一种利用生物传感技术对
2个或2个以上的生物分子间相互作用进行的实时
监测技术,基本原理是采用光学现象———表面等离
子共振实现的,通过监测传感芯片表面与所结合的
生物分子质量成正比的液体折射率的变化来实时跟
踪生物分子间的相互作用。本试验采用BIACORE
3000分子偶连仪对其进行作用机制研究,以了解
药物发挥作用的具体位点,判断药物的药理作用及
疗效程度,是一种既直观实用又高度敏感的药理学
新方法。
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LIUZhaomei,WENRuixing,MAHongtao,YANGYishu,WANGXiaoli,LVXiuhua,LIZelin
(DepartmentofVirology&Pharmacology,ColegeofLifeScienceandBioengineering,BeijingUniversityofTechnology,
Beijing100022,China)
  [Abstract] Objective:TostudytheefectofantiHIVⅢBviruswithextractionsfromJuglansregia,soastosearchingforthe
newandeficaciousleadingcompoundofAIDStherapy.Method:Phytochemicalandchromatographicaltechniqueswereusedtoisolate
compoundsfromJ.regia;MT4celsandHIVⅢBviruswereusedtostudytheefectofantiHIVactivityinvitro.BIACORE3000
moleculecoupledequipmentwereusedforthetargetresearchalso.Result:Twoextractions(B&E)wereisolatedfromJ.regiawhich
possesstheefectofantiHIVactivity.TargetsstudyfoundthatextractionBcouldafectedonHIV1gp41fusingproteinandextraction
EcouldafectedonHIV1integraserespectively.Conclusion:J.regiaisatraditionalChinesemedicinewithactiveantiHIVactivity
andworthtobestudiedfurther.
[Keywords] Juglansregia;isolationandpurify;antiHIV1;targets
[责任编辑 古云侠]
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