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Studies on in vitro culture of adventitious root in Salvia miltiorrhiza

丹参不定根离体培养的研究



全 文 :丹参不定根离体培养的研究
陈 巍 t o郭肖红 t o高文远 t3 o陈海霞 t o黄璐琦 u o肖培根 v
kt1天津大学 药物科学与技术学院 o天津 vssszu~ u1中国中医科学院 中药研究所 o北京 tsszss~
v1中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|wl
≈摘要   目的 }对丹参不定根的离体培养进行系统研究 ∀方法 }考察了蔗糖质量浓度 !培养基 ³‹ !接种 !植物
生长物质等影响因子对丹参不定根的生长及其次生代谢产物含量的影响 ∀结果 }随着蔗糖质量浓度的增加 o丹参
不定根增殖倍数呈增长趋势 o丹参酮的含量呈递减趋势变化 o原儿茶醛含量呈折线变化 o其中以添加 vs ª# pt的
蔗糖最高 ~培养基 ³‹为 y1xo x1x k或 y1slo x1{时分别最有利于丹参不定根的生长 !丹参酮 µ „的合成和原儿茶醛
的合成 ∀当接种量为 u1xh时 o丹参不定根的增殖倍数显著增加 ~ ≥培养基中附加 s1x °ª# pt Ž×最有利于丹参
酮 µ „和原儿茶醛合成 ∀结论 }蔗糖质量浓度 !培养基 ³‹ !接种量 !植物生长物质显著影响丹参不定根的生长和次
生代谢产物的合成 ∀
≈关键词   丹参 ~不定根 ~组织培养 ~次生代谢
≈中图分类号   ≥ xyz ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukussyltz2tws|2sw
≈收稿日期   ussx2ts2ts
≈基金项目   国家 {yv项目 kussv„„uuswsl~国家中医药管
理局中医药科学技术研究专项 ksw2sx°tsl
≈通讯作者   3 高文远 oר¯}ksuul{zwst{|xo∞2°¤¬¯} ³«¤µ°ª¤²
ƒ ·­∏q §¨∏q¦±
丹参 Σαλϖια µ ιλτιορρηιζα …ª¨是唇形科鼠尾草属
多年生草本植物 o以根和根茎入药 ∀和传统的大田
栽培相比 o利用组织培养方法生产丹参中有用次生
代谢产物具有不受时间 !地点限制 o可以提供均一产
物等特点 ∀本实验研究了影响丹参不定根生长和其
次生代谢产物合成的一些因素 o如蔗糖质量浓度 !培
养基 ³‹ !接种量 !植物生长物质的含量及系统性的
探索 o为利用丹参不定根进行次生代谢产物的合成
奠定了理论和实践基础 ∀
1 材料与仪器
111 材料 供试材料为在附加 Œ…„ u °ª# pt oŽ×
s1u °ª# pt的基本  ≥液体培养基中继代多次的
丹参 Σ1 µ ιλτιορρηιζα不定根 ∀丹参酮 µ „对照品 k批
号 szyy2ussstsl!原儿茶醛对照品 k批号 tts{ts2
ussusxl均购自中国药品生物制品检定所 ∀
112 仪器 ≤ pts„×∂ °高效液相色谱仪 k日本岛
津公司 o ‘usss色谱工作站 l~  ∞×׌∞• ג∞⁄’
⁄¨¯·¤vus ³‹ 计 k上海梅特勒 2托利多仪器公司 l~
‹≠ p y双层摇瓶机 k金坛市医疗仪器设备厂 l∀
2 方法
211 理化因子对丹参不定根生长及其有效成分含
量的影响 ≠蔗糖质量浓度 }将约 t1ux ªk鲜重 l丹
参不定根接种到蔗糖质量浓度分别为 usovsowso
xsoys ª# pt的  ≥培养基中 o附加 Œ…„ u °ª# pt o
Ž× s1u °ª# pt ∀培养基在灭菌前调 ³‹到 y1so每
个处理 v ∗ w瓶 o置于摇床 k转速为 tts µ# °¬±pt l上
自然光照培养 us §o培养室的温度为 kuy ? s1xl ε ∀
考察不同蔗糖质量浓度对丹参不定根和有效成分合
成的影响 ∀ 培养基 ³‹ }将约 t1ux ªk鲜重 l丹参不
定根接种到  ≥培养基中 o附加 Œ…„ u °ª# pt oŽ×
s1u °ª# pt o灭菌前培养基 ³‹ 分别调到 x1so
x1xo x1{o y1s和 y1xo每个处理 v ∗ w瓶 o培养条件
同 ≠ ∀ ≈接种量 }将继代多次的丹参不定根接种到
 ≥培养基中 o附加 Œ…„ u °ª# pt oŽ× s1u °ª#
pt o接种量分别为 uh ou1xh ovh owh和 xh ∀培
养基在灭菌前调 ³‹到 y1so培养条件同 ≠ ∀ …植物
生长物质 }将约 t1ux ªk鲜重 l丹参不定根接种到
 ≥培养基中 o分别考察 Œ…„ u °ª# pt与不同质量
浓度的 Ž× kso s1xot1sot1xo u1s °ª# pt l以及
Ž× s1x °ª# pt与不同质量浓度的 Œ…„ kso t1so
u1so v1so w1s °ª# pt l对丹参不定根的生长有效
成分合成的影响 o培养基在灭菌前调 ³‹到 y1so培
养条件同 ≠ ∀
212 不定根生物量的测定 将培养得到的丹参不
#|swt#
第 vt卷第 tz期
ussy年 |月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφΧηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vtoŒ¶¶∏¨ tz
≥ ³¨·¨°¥¨ µoussy
定根取出 o用滤纸吸去表面的培养基 o置于天平进行
称重即为鲜重 ∀将称过鲜重的不定根置于烘箱中 o
首先在 tsx ε 下烘 vs °¬±o使其酶系灭活 ~再在 ys
ε 下烘 v ∗ w «o使其干燥至恒重 o称其干重 o并计算
其增长率 }干重增长率 € k收获时的质量 p接种
量 l r接种量 ∀含水量 € k收获时的鲜重 p干重 l r收
获时的鲜重 ∀
213 丹参酮 µ „和原儿茶醛含量测定方法 丹参酮
µ „的含量测定 }称取 s1v ª左右干燥的丹参不定
根 o打碎后 o置于 tss °具塞三角瓶中 o加入 xs °
甲醇 o超声提取 vs °¬±后 o将其甲醇提取液进行过
滤 o然后浓缩至干 o残留物用甲醇溶解 o转移至 u
°量瓶中 o加甲醇稀释至刻度 o用 s1uu Λ°微孔滤
膜过滤 o得供试品溶液 ∀色谱条件 }色谱柱 „ª¬¯¨ ±·
²µ¥¤¬≤t{ kw1y °° ≅ uxs °°o x Λ°l~流动相甲
醇 2水 kwΒtl~流速 t °# °¬±pt ~检测波长 uzs ±°~
柱温 vs ε ∀
原儿茶醛含量测定 }称取丹参不定根 s1v ªo置
于 txs °圆底烧瓶中 o加入 xs °去离子水 o加热
回流 u1x «o离心后过滤 o取滤液 o加入无水乙醇至醇
体积为 xsh o静置 w{ «后 o过滤 o将滤液旋干 ∀残留
物用甲醇溶解 o转移至 u °量瓶中 o加甲醇稀释至
刻度 o用 s1uu Λ°微孔滤膜过滤 o得样品供试品溶
液 ∀色谱条件 }色谱柱 „ª¬¯¨ ±·²µ¥¤¬≤t{ kw1y °° ≅
uxs °°ox Λ°l~流动相甲醇 2s1xh ‹„≤ktxΒ{xl~流
速 t °# °¬±pt ~检测波长 u{s ±°~柱温 ux ε ∀
3 结果与分析
311 蔗糖质量浓度对丹参不定根生长及丹参酮 µ „
和原儿茶醛含量的影响 从表 t中可以看出 o随着
蔗糖质量浓度的增加 o丹参不定根增殖倍数呈增长
趋势 ∀在 us ª# pt时 o丹参不定根增殖倍数为
v1sx~在 ys ª# pt时达到 {1so是前者的 u1x{倍 ∀
蔗糖质量浓度为 us ∗ ys ª# pt时 o随着蔗糖质量浓
度的升高 o丹参不定根中丹参酮 µ „的含量呈递减趋
势变化 o其中 us ª# pt时丹参酮 µ „的含量最高 o而
原儿茶醛的含量则呈曲线变化 o当蔗糖为 vs ª# pt
时 o原儿茶醛的质量分数最高 o为 s1uu °ª# ªpt ∀
表 t 蔗糖质量浓度对丹参不定根培养及其有效成分含量的影响 kν € xl
蔗糖
rª# pt
接种量
r°ª
干重
r°ª
鲜重
r°ª
含水量
rh 增值倍数
丹参酮 µ „
r°ª# ªpt
原儿茶醛
r°ª# ªpt
us ywqz ? vq{t uyuqy ? t{qy wqvv ? squ| |vq| ? sq|y vqsx ? sqsz sqstu sqt{
vs x{q| ? uqx| vuxq| ? wq|z xqsv ? sqvu |vqx ? sqvx wqxv ? sqsu sqssy squu
ws ytq| ? vqvu vzyq| ? twqz xqts ? squv |uqy ? squt xqs| ? sqsz sqssu sqtx
xs x|q| ? sq|y w{uq{ ? u|qz yqsw ? sqys |uqs ? squv zqsy ? sqtw sqssu sqtx
ys x{qv ? vq{y xuyq{ ? wyqy yqtw ? sqvt |tqt ? squx {qsw ? sqts sqsst sqtv
312 ³‹值对丹参不定根生长及丹参酮µ„和原儿茶
醛含量的影响 由表 u可知 o当 ³‹较低时 kx1slo无
论是丹参不定根中的丹参酮µ„还是不定根的生长都
受到了抑制 o这时 o丹参不定根的增殖倍数最小 o为
v1v~当培养基中的 ³‹为 y1x时 o丹参不定根的生长
情况最好 o在培养 us §后 o丹参不定根的增殖倍数为

x1t∀当 ³‹为 x1x和 y1s时 o丹参不定根中丹参酮µ„
的质量分数最高 o为 s1svv °ª# ªpt ∀当培养基中的
³‹为 x1{时 o其原儿茶醛的质量分数最高 o为 s1uu
°ª# ªpt ∀当 ³‹为 y1x时 o丹参不定根生长情况最
好 o但是其丹参酮µ„和原儿茶醛的质量分数较低 o仅
为 s1ssv °ª# ªpt和 s1ts °ª# ªpt ∀
表 u 培养基 ³‹对丹参不定根生长及其有效成分含量的影响 kν € xl
培养基 ³‹ 接种量r°ª
干重
r°ª
鲜重
r°ª
含水量
rh 增殖倍数
丹参酮 µ „
r °ª# ªpt
原儿茶醛
r°ª# ªpt
xqs zvq{ ? sqy| vtxqu ? yqzz wqz| ? sqtx |vqw ? sqtt vquz ? sqsv sqstx sqty
xqx zwq{ ? tqzu vvzqw ? tzqz wq|u ? squs |vqs ? sqtu vqxt ? sqsv sqsvv squ
xq{ zwq| ? sqzz wtwq{ ? utq{ yqy| ? sqwv |vq{ ? sqsz wqxw ? sqsw sqssy squu
yqs zwqz ? uqu| vzzqs ? zqx xqzs ? sqtw |vqw ? sqsw wqsx ? sqsy sqsvv sqtu
yqx zuqy ? vqt{ wxuqy ? uuqy zqv{ ? sqtw |vq| ? sqv xquv ? sqtt sqssv sqts
313 接种量对丹参不定根生长的影响 实验结果
表明在接种量为 uh时 o丹参不定根培养物的质量
由接种时的 ys1| °ªk干重 lo增加到 txt1x °ªk干
重 lo增加了 t1x倍 ~当接种量为 u1xh o丹参不定根
增殖倍数达到了最大值 o为 w1xo不定根的质量由
zw1u °ªk干重 l增加到了 vzs1y °ªk干重 l~在
#stwt#
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≥ ³¨·¨°¥¨ µoussy
u1xh ∗ xh o随着接种量的增加 o丹参不定根增殖倍
数不断减少 o在接种量为 xh 时 o其增殖倍数仅为
t1xh ∀
314 植物生长物质对丹参不定根生长及丹参酮 µ „
和原儿茶醛含量的影响 由表 v中可以看出 o当
Œ…„保持不变 ku °ª# pt l时 oŽ×质量浓度的变化
对丹参不定根的生长有很大的影响 ∀ Œ…„作为唯一
植物生长物质时 o丹参不定根的增殖倍数最多 o为
w1u倍 ~添加 s1x °ª# pt Ž×时 o增殖的倍数最少 o
为 u1x倍 ∀对于丹参酮 µ „的积累来说 o在 Ž×为
s ∗ t °ª# pt时 o丹参酮 µ „的质量分数随着 Ž×质
量浓度的增加而不断上升 o由 s1ssw °ª# ªpt增加
到 s1t| °ª# ªpt o增加了 xs倍左右 ∀ Ž×质量浓度
继续上升 o丹参酮 µ „的质量分数反而下降 ∀ Ž×质
量浓度的变化对原儿茶醛质量分数的影响不如丹参
酮 µ „的显著 o当 Ž×为 s1x °ª# pt时 o原儿茶醛的
质量分数达到最大值 o为 s1us °ª# ªpt ∀
由表 w中可以看出 o在 Ž×保持不变 ks1x °ª#
pt l时 o随着 Œ…„质量浓度的增加 o丹参不定根增殖
倍数呈增加趋势 ∀ Œ…„质量浓度对其不定根中丹参
酮µ„和原儿茶醛含量的影响比较明显 ∀不添加 Œ…„
时 o不定根中的丹参酮µ„和原儿茶醛的质量分数均达
到最大值 o分别为 s1syw °ª# ªpt和 s1vu °ª# ªpt ∀
4 讨论
表 v Ž×质量浓度对丹参不定根生长及有效成分含量的影响 kν € xl
植物生长调节
物质配比 r°ª# pt
接种量
r°ª
干重
r°ª
鲜重
r°ª
含水量
rh
丹参酮µ„
r°ª# ªpt
原儿茶醛
r°ª# ªpt
Œ…„ u ytqw ? tqss vtzqz ? yq| wqvu ? sqvt |uqy ? sqtt sqssw sqtt
Œ…„ u nŽ× sqx ytqu ? uquz utxqx ? vqvz uq{z ? sqsu |uqx ? sqt{ sqswu squs
Œ…„ u nŽ× t x{qw ? tqyz uxsqt ? uqut vqwu ? sqsx |uqz ? sqsy sqt| sqs|
Œ…„ u nŽ× tqx x{qw ? sqzu uzsqv ? twqy wqst ? sqv{ |vqu ? squ{ sqssz sqs{
Œ…„ u nŽ× u ytqt ? uquu uzzqv ? txqy vq|| ? sqwu |vqs ? sqyv sqssz sqtu
表 w Œ…„含量对不定根生长及有效成分含量的影响 kν € xl
植物生长调节
物质配比 r°ª# pt
接种量
r°ª
干重
r°ª
鲜重
r°ª
含水量
rh
丹参酮µ„
r°ª# ªpt
原儿茶醛
r°ª# ªpt
Ž× sqx ytqz ? uqtx tuyqs ? tvqv tq{s ? sqtw |vqs ? sqty sqsyw sqvu
Œ…„ t nŽ× sqx ysqt ? sq|u t||qx ? tyq| vqv ? sqwz |vqy ? squz sqstu sqtt
Œ…„ u nŽ× sqx ytqu ? uquz utxqx ? vqvz uqz{ ? sqsu |uqx ? sqt{ sqswu squs
Œ…„ v nŽ× sqx x|q| ? tqyy uyuq| ? usqy wqtu ? squv |vqy ? sqvy sqssx sqtt
Œ…„ w nŽ× sqx ysqz ? sq{| vsxqx ? utqw wq{y ? sqvy |vqz ? sqsy sqss{ sqtu
培养基初始蔗糖含量影响植物组织或细胞的生
长速率 !次生代谢产物合成等 o在人参悬浮细胞培养
生产人参皂苷中 o相对较高的蔗糖质量浓度 kys ª#
pt l有利于皂苷的合成 ≈t  ∀本实验表明 o相对较高
的蔗糖质量浓度 kys ª# pt l有利于对丹参不定根
生长 o而较低质量浓度的蔗糖有利于次生代谢产物
的合成 ∀丹参酮 µ „和原儿茶醛含量分别在添加 us
ª# pt和 vs ª# pt蔗糖时达到最大值 ∀综合考虑
不定根的生长和有效成分的含量 o选择蔗糖质量浓
度为 vs ª# pt较为合适 ∀
培养基 ³‹通过影响植物对离子的吸收从而影
响着植物对营养的吸收 o进而影响植物器官的生长和
次生代谢产物的合成 ≈u  ∀本实验表明当 ³‹过低时 o
无论是丹参不定根的生长还是其次生代谢都受到了
抑制 ∀可能是过低的 ³‹抑制了丹参不定根对阳离
子的吸收 o从而使丹参不定根吸收营养成分不平衡 o
进而影响其生长和有效成分的合成 ≈v  ∀实验还表明
当丹参不定根生长较旺盛时 k³‹为 x1{和 y1x时 lo
其丹参酮µ„的含量较低 ∀这可能和丹参生长与丹参
酮µ„的积累不成平行关系 o属相斥形有关 ≈w  ∀
接种量决定于植物组织培养开始生长所需要时
间 o以及其后的生长情况 ≈x  ∀本实验研究表明当丹
参不定根接种量较少时 kuh lo不定根生长的滞后
期较长 o而且在 t个培养周期中其增殖的倍数也相
对较少 ~当接种量过多时 kwh ∗ xh lo培养基中营
养成分不足 o丹参不定根生长缓慢 o增殖倍数也相对
较低 ~当接种量适宜时 ku1xh lo丹参不定根的增殖
倍数最多 o为 w1xh ∀紫草的培养中也得到了类似
的结果 ≈y  ∀
Ž²¦«¬µ²报道 ≈z  o在 …x培养基中添加 s1t ∗ t1s
°ª# pt Œ…„抑制了丹参不定根的生长 o却促进了
丹参酮的合成 ∀本实验表明当 Œ…„保持不变时 o随
着 Ž×质量浓度的增加 o丹参酮 µ „的含量变化明
#ttwt#
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显 o这和王康才 ≈{ 等对丹参愈伤组织中 Ž×含量对
丹参酮 µ „含量影响的实验结果一致 ∀当 Ž×保持
不变时 o随着 Œ…„质量浓度的变化 o丹参不定根中
次生代谢产物的变化没有什么规律 ∀这可能是由于
不同配比激素对丹参不定根中内源性 „…„oŒ„„o
Š„v和 ¬°„¶的合成产生了影响所致 ≈|  o将在以后的
实验中对其机理进行进一步的探讨 ∀
≈参考文献  
≈t  ≤ ’ „®¤¯ ½¨¬o ¬∏≥o ¬± ≥o ·¨¤¯q ≤²°¥¬± §¨ ©¨©¨¦·¶²©¬±¬·¬¤¯ ¶∏2
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°µ²¦¨¶¶…¬²¦«¨ °o t|||o vw}yv|q
≈u   ¤µ¶¦«± µ¨‹ o  ¬± µ¨¤¯ ±∏·µ¬·¬²± ²©«¬ª«³¯¤±·¶≈  q ²±§²±} ‹¤µ2
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#植物分册 o t||to ykvl}tttq
≈y  …¤µ·²± ≥o …∏¯ ²¯¦® ≤o • ¬¨µ⁄q ׫¨ ©¨©¨¦·¶²©∏¯·µ¤¶²∏±§²± ·«¨ ¤¦2
·¬√¬·¬¨¶²©¶²°¨ ª¯¼¦²¶¬§¤¶¨ ±¨½¼° ¶¨²©¬±§∏¶·µ¬¤¯ ¬°³²µ·¤±¦¨ ≈ q
∞±½¼°¨ ¬¦µ²¥× ¦¨«±²¯o t||yo t{} t|sq
≈z  Ž²¬¦«¬µ² ≥«¬°²°∏µ¤o פ®¤¶«¬Ž¬·¤½¤º¤q פ±¶«¬±²±¨³µ²§∏¦·¬²± ¬±
¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶µ²²·¶¤±§µ¨ª¨ ± µ¨¤·¨§²©Σαλϖια µ ιλτιορρηιζα≈ q ‘¤·
°µ²§o t||to xwkyl}tx{vq
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成的研究 ≈ q中国中药杂志 ot||{o uvktsl}x|uq
≈|  李国婧 o王树才 o夏 凯 1酵母激发子与水杨酸对 ׬转化的
丹参组培物内源激素含量的影响 ≈ q南京农业大学学报 o
usstouwktl}tvq
Στυδιεσ ον ιν ϖιτρο χυλτυρε οφ αδϖεντιτιουσροοτ ιν Σαλϖια µ ιλτιορρηιζα
≤‹∞‘ • ¬¨t o Š˜’ ÷¬¤²2«²±ªt o Š„’ • ±¨2¼∏¤±t o ≤‹∞‘‹¤¬2¬¬¤t o ‹˜„‘Š ∏2´ ¬u o ÷ Œ„’ ° ¬¨2ª¨ ±v
(t. Τηε Χολλεγε οφ Πηαρµ αχευτιχαλσ Σχιενχε ανδ Τεχηνολογψ, Τιανϕιν Υνιϖερσιτψ, Τιανϕιν vssszu, Χηινα;
u. Ινστιτυτε οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα, Χηινα Αχαδεµ ψ οφ Χηινεσε ΜεδιχαλΣχιενχεσ, Βειϕινγ tsszss, Χηινα;
v. Ινστιτυτε οφΜεδιχιναλΠλαντ ∆εϖελοπµ εντ, Χηινεσε Αχαδεµ ψ οφΜεδιχαλΣχιενχε ανδ
Πεκινγ Υνιον ΜεδιχαλΧολλεγε, Βειϕινγ tsss|w , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¶·∏§¼ ·«¨ ¦∏¯·∏µ¨ ²©¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶µ²²·²©Σαλϖια µ ιλτιορρηιζα ιν ϖιτρο ¶¼¶·¨°¬¦¤¯ ¼¯q Μετηοδ : ∞©©¨¦·¶²©
¶∏¦µ²¶¨ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¶o ° §¨¬∏° ³‹ o ¬±²¦∏¯∏° ¶¬½¨ ¤±§ ³¯¤±·ªµ²º·« µ¨ª∏¯¤·²µ¶²± ¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶µ²²·ªµ²º·« ¤±§ ¶¨¦²±§¤µ¼ ° ·¨¤¥²¯¬·¨¶
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¦¨±·µ¤·¬²±¶o ° §¨¬∏° ³‹ o ¬±²¦∏¯∏° ¶¬½¨ ¤±§ ³¯¤±·ªµ²º·« µ¨ª∏¯¤·²µ¶«¤√¨ §¬¶·¬±¦·¨ ©©¨¦·¶²± ·«¨ ιν ϖιτρο ¦∏¯·∏µ¨ ²©¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶µ²²·
ªµ²º·«¤±§¶¨¦²±§¤µ¼ ° ·¨¤¥²¯¬·¨¶¶¼±·«¨ ¶¬¶²©Σ. µ ιλτιορρηιζαq
[ Κεψ ωορδσ] Σαλϖια µ ιλτιορρηιζα~ ¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶µ²²·~ ιν ϖιτρο ¦∏¯·∏µ¨ ≈责任编辑 张宁宁  
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