全 文 ：６０ｈｏｕｒｓｔｅａｍｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆ５ＨＭＦｉｎ１１ｓａｍｐｌｅｓｏｆＲａｄｉｘＰｏｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉｐｒｅｐａｒａｔａｗｅｒｅｆｒｏｍ００１３％ ｔｏ０１０１％，
ａｎｄｏｎｌｙｏｎｅｉｎ４ｓａｍｐｌｅｓｏｆＲａｄｉｘＰｏｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｒａｃｅａｍｏｕｎｔｏｆ５ＨＭＦ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎ
ＲａｄｉｘＰｏｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉｗｅｒｅｃｈａｎｇｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆＲａｄｉｘＰｏｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉｓｈｏｕｌｄ
ｂｅｃｏｎｔｒｏｌｅｄａｎｄｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＲａｄｉｘＰｏｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉ；ｐｒｅｃｅｓｓｉｎｇ；ＤＤＭＰ；５ＨＭＦ；ｃｏｎｔｅｎｔ
［责任编辑 鲍 雷］
［收稿日期］ ２００８０３２７
［基金项目］ ２００５年第二批教育部“春晖计划”科研合作项目
（００５２１１００１６）
［通讯作者］ 郭兴杰，Ｔｅｌ：（０２４）２３９８６２８５，Ｅｍａｉｌ：ｇｘｊｈｙｚ＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
反相 ＨＰＬＣ同时测定白花蛇舌草口服液中
４种组分含量
张洪飞１，张华燕１，李 燕２，郭兴杰１
（１．沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 １１００１６；２．日本国立遗传研究所，静冈县４１１－８５４０，日本）
［摘要］ 目的：建立反相ＨＰＬＣ同时测定白花蛇舌草口服液中３，４二羟基苯甲酸甲酯 （Ⅰ）、对香豆酸（Ⅱ）、
阿魏酸（Ⅲ）和反式６Ｏ对香豆酰鸡屎藤苷甲酯（Ⅳ）的含量。方法：采用 ＤｉａｍｏｎｓｉｌＴＭ Ｃ１８柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５
μｍ）；流动相Ａ乙腈，Ｂ甲醇水冰醋酸（５∶９５∶０２５），梯度洗脱：０～２０ｍｉｎ，１％～１６％Ａ；２０～４２ｍｉｎ，１６％Ａ；４２～４６
ｍｉｎ，１６％～２０％Ａ；４６～６５ｍｉｎ，２０％Ａ。检测波长２６５ｎｍ；流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１。结果：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ与Ⅳ分别在２１～
１０５（ｒ＝０９９９８），３５～１７５（ｒ＝０９９９８），１７２～８６（ｒ＝０９９９９），４０～２００ｍｇ·Ｌ－１（ｒ＝１００００）线性关系良好，
方法平均回收率分别为９９９％，９７９％，９８６％，９８１％。结论：方法简便快速、准确度高，可用于白花蛇舌草口服
液中４种组分的同时测定。
［关键词］ ＨＰＬＣ；白花蛇舌草；３，４二羟基苯甲酸甲酯；对香豆酸；阿魏酸；反式６Ｏ对香豆酰鸡屎藤苷甲酯
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２０２３２９０３
白花蛇舌草 ＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｕｓａＷｉｌｄ．为茜草科植
物白花蛇舌草的干燥全草，广泛分布于亚热带地区，
日本，我国云南、广东、广西、福建、浙江、江苏、安徽
等地均有生长［１３］。其味苦、甘，性寒，具有清热解
毒、活血化瘀、消炎止痛之功效。民间常用此药治疗
咽喉肿痛、小便不利等，也可用于癌症的辅助治疗。
成分３，４二羟基苯甲酸甲酯（Ⅰ）为本实验室从白
花蛇舌草中首分，对香豆酸（Ⅱ），阿魏酸（Ⅲ）和反
式６Ｏ对香豆酰鸡尿藤苷甲酯（Ⅳ）［４６］已有文献报
道。对白花蛇舌草中Ⅱ和Ⅳ２种成分同时进行含量
测定已有文献报道［７］，但对白花蛇舌草中Ⅰ和Ⅲ的
含量测定还未见报道。Ⅲ有提高人体的免疫功能及
补血活血的功效［８］，Ⅰ具有抗菌活性［９］，均为白花
蛇舌草中的活性成分。本研究建立了反相ＨＰＬＣ同
时测定白花蛇舌草口服液中Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ的含量。
１ 仪器与试药
高效液相色谱仪（ＰＵ－２０８０二元梯度泵），ＭＤ
－２０１０二极管阵列检测器（Ｊａｓｃｏ，日本分光公司）；
ＬＣ－ＮＥＴⅡ／ＡＤＣ色谱工作站（Ｊａｓｃｏ，日本分光公
司）；Ａｓ３１２０Ｂ超声波振荡器（天津 Ａｕｔｏｓｃｉｅｎｃｅ公
司）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公
司），冰醋酸（分析纯，天津市百世化工有限公司），
重蒸水（自制），对照品Ⅰ（纯度≥９９１％），Ⅱ（纯
度≥９９５％）与Ⅳ（纯度≥９８６％）均由本实验室自
制，Ⅲ（中国药品生物制品检定所，批号 ０７７３
９９１０）。白花蛇舌草购自市售中药材，由沈阳药科
大学药用植物教研室孙启时教授鉴定，白花蛇舌草
口服液（批号２００７１１０５，２００７１１１０，２００７１１１６）自制。
２ 方法
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第３３卷第２０期
２００８年１０月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ２０
Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００８
２．１ 色谱条件 迪马公司 ＤｉａｍｏｎｓｉｌＴＭ Ｃ１８柱（４６
ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相 Ａ乙腈，Ｂ甲醇水冰
醋酸（５∶９５∶０２５）；梯度洗脱程序：０～２０ｍｉｎ，１％～
１６％Ａ；２０～４２ｍｉｎ，１６％Ａ；４２～４６ｍｉｎ，１６％ ～２０％
Ａ；４６～６５ｍｉｎ，２０％Ａ；检测波长２６５ｎｍ；流速１０
ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温２５℃；进样量２０μＬ。
２．２ 对照品贮备液的制备 精密称取Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ
对照品适量，用甲醇溶解，配制成质量浓度分别为
２１０，３５０，１７２，４００ｍｇ·Ｌ－１的对照品贮备液。分别
取各贮备液２ｍＬ于同一个１０ｍＬ量瓶中，用甲醇稀
释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。
２．３ 供试品溶液的制备 精密吸取１０ｍＬ口服液
于５０ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，过 ０４５
μｍ微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
２．４ 系统适用性试验 在上述色谱条件下，取供试
品溶液（批号２００７１１０５）２０μＬ，进样，各组分色谱峰
与其相邻峰达到完全分离，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ相应的理
论塔板数分别为３１１５１，３０１０４，１８２６３和７３１２８。
供试品溶液与混合对照品溶液的色谱图见图１。取
同一份供试品溶液，连续进样６次，各组分峰面积的
ＲＳＤ分别为 １５％（Ⅰ），１２％（Ⅱ），１７％（Ⅲ），
１８％（Ⅳ）。
１．３，４二羟基苯甲酸甲酯；２．对香豆酸；３．阿魏酸；
４．反式６Ｏ对香豆酰鸡屎藤苷甲酯
图１ 供试品溶液（ａ）与对照品溶液（ｂ）的ＨＰＬＣ图
２．５ 线性关系及检测限 分别精密吸取２．２项下
各对照品贮备液０１，０５，１，１５，２５，５０ｍＬ，分别
置于１０ｍＬ量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。在上
述色谱条件下测定，以质量浓度 Ｘ（ｍｇ·Ｌ－１）为横
坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程。结果表明
Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ分别在 ２１～１０５，３５～１７５，１７２～
８６，４０～２００ｍｇ·Ｌ－１呈良好的线性关系，回归方程
分别为Ｙ＝５４３４×１０４Ｘ＋２７７２×１０３，ｒ＝０９９９８；
Ｙ＝３８１７×１０４Ｘ＋３５１３×１０３，ｒ＝０９９９８；Ｙ＝
２２５３×１０４Ｘ＋２５９３×１０３，ｒ＝０９９９９；Ｙ＝７７４８×
１０３Ｘ－２５７４×１０２，ｒ＝１００００。当信噪比（Ｓ／Ｎ）为
３时，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的最低检测限分别为 １６，２７，
２７，２０ｎｇ。
２．６ 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号
２００７１１０５），分别在０，２，４，８，１２，２４ｈ进样分析，记
录峰面积，结果Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ峰面积的 ＲＳＤ均小于
２５％，表明供试品溶液至少在２４ｈ内稳定。
２．７ 重复性试验 按照２．３项下供试品溶液的制
备方 法，平 行 制 备 供 试 品 溶 液 ６份 （批 号
２００７１１０５），在上述色谱条件下测定，计算含量。Ⅰ，
Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的 ＲＳＤ分别为 １６％，１４％，１８％，
１６％，表明方法重复性良好。
２．８ 回收率试验 精密吸取已测含量的口服液
（批号２００７１１０５）６份，各０５ｍＬ，分别置于５０ｍＬ
量瓶中，每份准确加入２．２项下Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的对照
品贮备液各５０ｍＬ，用水定容至刻度，摇匀。在上
述色谱条件下，测定峰面积，计算回收率。Ⅰ，Ⅱ，
Ⅲ，Ⅳ 的 平 均 回 收 率 及 ＲＳＤ 分 别 为 ９９９％
（１８％），９７９％（１７％），９８６％（１３％），９８１％
（１５％）。
２．９ 供试品测定 按照２．３项下的方法制备供试
品溶液，在上述色谱条件下，采用外标一点法进样测
定，３批口服液的含量测定结果见表１。
表１ 白花蛇舌草口服液中４种组分质量浓度
批号
质量浓度／ｇ·Ｌ－１
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
ＲＳＤ／％
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
０７１１０５ ２５２ ７０２ ０９６ ７１６ １１ １２ １５ １６
０７１１１０ ２５７ ７１３ １１７ ７３３ １３ １５ １８ １５
０７１１１６ ２６３ ７１５ １１３ ７２７ ０９ １７ １６ １７
３ 讨论
３．１ 对照品溶液与供试品溶液峰纯度考察 Ⅰ，
Ⅱ，Ⅳ的对照品均为本实验室自制，经 ＩＲ，１ＨＮＭＲ
和１３ＣＮＭＲ确证结构。以峰面积归一化法计算，３
种对照品纯度均大于９８％。供试品溶液与对照品
溶液中Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的色谱峰经ＤＡＤ检测后比对，２
组色谱峰在２００～４００ｎｍ吸收光谱一致。供试品溶
液的色谱峰经用光谱图归一化（分别选择色谱峰的
前沿，峰顶和峰尾进行归一化），所得的紫外光谱基
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本一致，归化光谱几乎重合。同时经比率图法鉴定
均接近为纯峰。４种组分的匹配因子均大于９９０。
３．２ 检测波长的选择 Ⅱ，Ⅲ与Ⅳ均在３１０ｎｍ处
有最大吸收，Ⅰ在２５４ｎｍ处有最大吸收。由于在
２５４ｎｍ处检测干扰较多，而在３１０ｎｍ检测Ⅰ没有
吸收峰，本研究选择２６５ｎｍ作为检测波长，方法灵
敏且干扰峰较少，峰形良好。经用 ＤＡＤ检测，证明
供试品色谱图中４种组分均为单一成分。
３．３ 色谱柱的选择 由于白花蛇舌草口服液中化
合物多且各成分极性差别小，为了使待测组分峰与
相邻色谱峰达到完全分离，本研究对色谱柱进行了
选择。试验了３种规格（或产地）的色谱柱，Ｒｅｓｔｅｋ
ＰｉｎｎａｃｌｅＩＣ１８柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ，北京高
比科技有限公司）、ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８柱（４６ｍｍ×２００
ｍｍ，５μｍ，迪马公司）和ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８柱（４６ｍｍ×
２５０ｍｍ，５μｍ，迪马公司），发现使用２５０ｍｍ的Ｄｉａ
ｍｏｎｓｉｌＣ１８色谱柱时各组分能达到完全分离。
３．４ 色谱条件的优化 Ⅰ，Ⅱ与Ⅲ均为弱酸性化合
物，在流动相中加入少量酸对分离和获得好的峰形
有利。本研究比较了流动相水相中添加 ０１０％，
０２５％，０６０％的冰醋酸对各组分分离的影响。结
果表明，流动相水相中含有０２５％的冰醋酸可以使
各组分色谱峰的峰形和分离度均达到要求。
本研究建立了同时测定白花蛇舌草口服液中
Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ含量的方法，方法的准确度和重现性均
令人满意，可作为白花蛇舌草口服液的质量控制方
法。
［参考文献］
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ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａ
ｏｒａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｂｙｒｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅＨＰＬＣ
ＺＨＡＮＧＨｏｎｇｆｅｉ１，ＺＨＡＮＧＨｕａｙａｎ１，ＬＩＹａｎ２，ＧＵＯＸｉｎｇｊｉｅ１
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｈｅｎｙａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００１６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓＳｈｉｚｕｏｋａ４１１－８５４０，Ｊａｐａｎ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｍｅｔｈｙｌ３，４ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（Ⅰ），Ｐｃｏｕｍａｒｉｃ
ａｃｉｄ（Ⅱ），ｆｅｒｕｌａｉｃａｃｉｄ（Ⅲ）ａｎｄＥ６ＯＰｃｏｕｍａｒｏｙｌｓｃａｎｄｏｓｉｄｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ（Ⅳ）ｉｎＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｕｓａｏｒａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｂｙｒｅｖｅｒｓｅｄ
ｐｈａｓｅＨＰＬＣｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａＤｉａｍｏｎｓｉｌＴＭＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ｗｉｔｈ
ｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎ．Ａａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，Ｂｍｅｔｈｏｎａｌｗａｔｅｒｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（５∶９５∶０２５），０２０ｍｉｎ，１％１６％Ａ；２０４２ｍｉｎ，１６％Ａ；４２
４６ｍｉｎ，１６％２０％Ａ；４６６５ｍｉｎ，２０％Ａ．ＴｈｅＵＶｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓｓｅｔａｔ２６５ｎｍ；ｆｌｏｗｒａｔｅ１０ｍＬ·ｍｉｎ－１．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｒｅｗａｓｇｏｏｄ
ｌｉｎｅａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｅａｋａｒｅａａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｔｔｈｅｒａｎｇｅｓｏｆ２１１０５（ｒ＝０９９９８），３５１７５（ｒ＝０９９９８），１７２８６（ｒ＝
０９９９９），４０２００ｍｇ·Ｌ－１（ｒ＝１００００）ｆｏｒⅠ，Ⅱ，Ⅲ ａｎｄⅣ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆⅠ，Ⅱ，Ⅲ ａｎｄⅣ ｗｅｒｅ
９９９％，９７９％，９８６％ ａｎｄ９８１％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｒａｐｉｄ，ｓｉｍｐｌｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
ｏｆＨ．ｄｉｆｕｓａｏｒａｌｓｏｌｕｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＨＰＬＣ；Ｈｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｕｓａ；ｍｅｔｙｌ３，４ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ；ｐｃｏｕｍａｒｉｃａｃｉｄ；ｆｅｒｕｌａｉｃａｃｉｄ；Ｅ６Ｏｐｃｏｕｍａｒｏｙｌ
ｓｃａｎｄｏｓｉｄｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ
［责任编辑 鲍 雷］
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