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Simultaneous determination of four components in Hedyotis diffusa
oral solution by reversed-phase HPLC

反相HPLC同时测定白花蛇舌草口服液中
4种组分含量



全 文 :60hoursteamingprocess.Thecontentsof5HMFin11samplesofRadixPolygoniMultifloripreparatawerefrom0013% to0101%,
andonlyonein4samplesofRadixPolygoniMultifloricontainingtraceamountof5HMF.Conclusion:Thechemicalcomponentsin
RadixPolygoniMultifloriwerechangedduringtheprocessingprocedures.Therefore,theprocessingofRadixPolygoniMultiflorishould
becontroledandstandardized.
[Keywords] RadixPolygoniMultiflori;precessing;DDMP;5HMF;content
[责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20080327
[基金项目] 2005年第二批教育部“春晖计划”科研合作项目
(0052110016)
[通讯作者] 郭兴杰,Tel:(024)23986285,Email:gxjhyz@
yahoo.com.cn
反相 HPLC同时测定白花蛇舌草口服液中
4种组分含量
张洪飞1,张华燕1,李 燕2,郭兴杰1
(1.沈阳药科大学 药学院,辽宁 沈阳 110016;2.日本国立遗传研究所,静冈县411-8540,日本)
[摘要] 目的:建立反相HPLC同时测定白花蛇舌草口服液中3,4二羟基苯甲酸甲酯 (Ⅰ)、对香豆酸(Ⅱ)、
阿魏酸(Ⅲ)和反式6O对香豆酰鸡屎藤苷甲酯(Ⅳ)的含量。方法:采用 DiamonsilTM C18柱(46mm×250mm,5
μm);流动相A乙腈,B甲醇水冰醋酸(5∶95∶025),梯度洗脱:0~20min,1%~16%A;20~42min,16%A;42~46
min,16%~20%A;46~65min,20%A。检测波长265nm;流速10mL·min-1。结果:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ与Ⅳ分别在21~
105(r=09998),35~175(r=09998),172~86(r=09999),40~200mg·L-1(r=10000)线性关系良好,
方法平均回收率分别为999%,979%,986%,981%。结论:方法简便快速、准确度高,可用于白花蛇舌草口服
液中4种组分的同时测定。
[关键词] HPLC;白花蛇舌草;3,4二羟基苯甲酸甲酯;对香豆酸;阿魏酸;反式6O对香豆酰鸡屎藤苷甲酯
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)20232903
  白花蛇舌草 HedyotisdifusaWild.为茜草科植
物白花蛇舌草的干燥全草,广泛分布于亚热带地区,
日本,我国云南、广东、广西、福建、浙江、江苏、安徽
等地均有生长[13]。其味苦、甘,性寒,具有清热解
毒、活血化瘀、消炎止痛之功效。民间常用此药治疗
咽喉肿痛、小便不利等,也可用于癌症的辅助治疗。
成分3,4二羟基苯甲酸甲酯(Ⅰ)为本实验室从白
花蛇舌草中首分,对香豆酸(Ⅱ),阿魏酸(Ⅲ)和反
式6O对香豆酰鸡尿藤苷甲酯(Ⅳ)[46]已有文献报
道。对白花蛇舌草中Ⅱ和Ⅳ2种成分同时进行含量
测定已有文献报道[7],但对白花蛇舌草中Ⅰ和Ⅲ的
含量测定还未见报道。Ⅲ有提高人体的免疫功能及
补血活血的功效[8],Ⅰ具有抗菌活性[9],均为白花
蛇舌草中的活性成分。本研究建立了反相HPLC同
时测定白花蛇舌草口服液中Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ的含量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪(PU-2080二元梯度泵),MD
-2010二极管阵列检测器(Jasco,日本分光公司);
LC-NETⅡ/ADC色谱工作站(Jasco,日本分光公
司);As3120B超声波振荡器(天津 Autoscience公
司);甲醇、乙腈(色谱纯,天津市康科德科技有限公
司),冰醋酸(分析纯,天津市百世化工有限公司),
重蒸水(自制),对照品Ⅰ(纯度≥991%),Ⅱ(纯
度≥995%)与Ⅳ(纯度≥986%)均由本实验室自
制,Ⅲ(中国药品生物制品检定所,批号 0773
9910)。白花蛇舌草购自市售中药材,由沈阳药科
大学药用植物教研室孙启时教授鉴定,白花蛇舌草
口服液(批号20071105,20071110,20071116)自制。
2 方法
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2.1 色谱条件 迪马公司 DiamonsilTM C18柱(46
mm×250mm,5μm);流动相 A乙腈,B甲醇水冰
醋酸(5∶95∶025);梯度洗脱程序:0~20min,1%~
16%A;20~42min,16%A;42~46min,16% ~20%
A;46~65min,20%A;检测波长265nm;流速10
mL·min-1;柱温25℃;进样量20μL。
2.2 对照品贮备液的制备 精密称取Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ
对照品适量,用甲醇溶解,配制成质量浓度分别为
210,350,172,400mg·L-1的对照品贮备液。分别
取各贮备液2mL于同一个10mL量瓶中,用甲醇稀
释至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 精密吸取10mL口服液
于50mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,过 045
μm微孔滤膜,取续滤液作为供试品溶液。
2.4 系统适用性试验 在上述色谱条件下,取供试
品溶液(批号20071105)20μL,进样,各组分色谱峰
与其相邻峰达到完全分离,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ相应的理
论塔板数分别为31151,30104,18263和73128。
供试品溶液与混合对照品溶液的色谱图见图1。取
同一份供试品溶液,连续进样6次,各组分峰面积的
RSD分别为 15%(Ⅰ),12%(Ⅱ),17%(Ⅲ),
18%(Ⅳ)。
1.3,4二羟基苯甲酸甲酯;2.对香豆酸;3.阿魏酸;
4.反式6O对香豆酰鸡屎藤苷甲酯
图1 供试品溶液(a)与对照品溶液(b)的HPLC图
2.5 线性关系及检测限 分别精密吸取2.2项下
各对照品贮备液01,05,1,15,25,50mL,分别
置于10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。在上
述色谱条件下测定,以质量浓度 X(mg·L-1)为横
坐标,峰面积为纵坐标,计算回归方程。结果表明
Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ分别在 21~105,35~175,172~
86,40~200mg·L-1呈良好的线性关系,回归方程
分别为Y=5434×104X+2772×103,r=09998;
Y=3817×104X+3513×103,r=09998;Y=
2253×104X+2593×103,r=09999;Y=7748×
103X-2574×102,r=10000。当信噪比(S/N)为
3时,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的最低检测限分别为 16,27,
27,20ng。
2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号
20071105),分别在0,2,4,8,12,24h进样分析,记
录峰面积,结果Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ峰面积的 RSD均小于
25%,表明供试品溶液至少在24h内稳定。
2.7 重复性试验 按照2.3项下供试品溶液的制
备方 法,平 行 制 备 供 试 品 溶 液 6份 (批 号
20071105),在上述色谱条件下测定,计算含量。Ⅰ,
Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的 RSD分别为 16%,14%,18%,
16%,表明方法重复性良好。
2.8 回收率试验 精密吸取已测含量的口服液
(批号20071105)6份,各05mL,分别置于50mL
量瓶中,每份准确加入2.2项下Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的对照
品贮备液各50mL,用水定容至刻度,摇匀。在上
述色谱条件下,测定峰面积,计算回收率。Ⅰ,Ⅱ,
Ⅲ,Ⅳ 的 平 均 回 收 率 及 RSD 分 别 为 999%
(18%),979%(17%),986%(13%),981%
(15%)。
2.9 供试品测定 按照2.3项下的方法制备供试
品溶液,在上述色谱条件下,采用外标一点法进样测
定,3批口服液的含量测定结果见表1。
表1 白花蛇舌草口服液中4种组分质量浓度
批号
质量浓度/g·L-1
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
RSD/%
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
071105 252 702 096 716 11 12 15 16
071110 257 713 117 733 13 15 18 15
071116 263 715 113 727 09 17 16 17
3 讨论
3.1 对照品溶液与供试品溶液峰纯度考察 Ⅰ,
Ⅱ,Ⅳ的对照品均为本实验室自制,经 IR,1HNMR
和13CNMR确证结构。以峰面积归一化法计算,3
种对照品纯度均大于98%。供试品溶液与对照品
溶液中Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的色谱峰经DAD检测后比对,2
组色谱峰在200~400nm吸收光谱一致。供试品溶
液的色谱峰经用光谱图归一化(分别选择色谱峰的
前沿,峰顶和峰尾进行归一化),所得的紫外光谱基
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本一致,归化光谱几乎重合。同时经比率图法鉴定
均接近为纯峰。4种组分的匹配因子均大于990。
3.2 检测波长的选择 Ⅱ,Ⅲ与Ⅳ均在310nm处
有最大吸收,Ⅰ在254nm处有最大吸收。由于在
254nm处检测干扰较多,而在310nm检测Ⅰ没有
吸收峰,本研究选择265nm作为检测波长,方法灵
敏且干扰峰较少,峰形良好。经用 DAD检测,证明
供试品色谱图中4种组分均为单一成分。
3.3 色谱柱的选择 由于白花蛇舌草口服液中化
合物多且各成分极性差别小,为了使待测组分峰与
相邻色谱峰达到完全分离,本研究对色谱柱进行了
选择。试验了3种规格(或产地)的色谱柱,Restek
PinnacleIC18柱(46mm×250mm,5μm,北京高
比科技有限公司)、DiamonsilC18柱(46mm×200
mm,5μm,迪马公司)和DiamonsilC18柱(46mm×
250mm,5μm,迪马公司),发现使用250mm的Dia
monsilC18色谱柱时各组分能达到完全分离。
3.4 色谱条件的优化 Ⅰ,Ⅱ与Ⅲ均为弱酸性化合
物,在流动相中加入少量酸对分离和获得好的峰形
有利。本研究比较了流动相水相中添加 010%,
025%,060%的冰醋酸对各组分分离的影响。结
果表明,流动相水相中含有025%的冰醋酸可以使
各组分色谱峰的峰形和分离度均达到要求。
本研究建立了同时测定白花蛇舌草口服液中
Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ含量的方法,方法的准确度和重现性均
令人满意,可作为白花蛇舌草口服液的质量控制方
法。
[参考文献]
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ZHANGHongfei1,ZHANGHuayan1,LIYan2,GUOXingjie1
(1.SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;
2.NationalInstituteofGeneticsShizuoka411-8540,Japan)
[Abstract] Objective:Anewmethodforsimultaneousdeterminationoffourmethyl3,4dihydroxybenzoate(Ⅰ),Pcoumaric
acid(Ⅱ),ferulaicacid(Ⅲ)andE6OPcoumaroylscandosidemethylester(Ⅳ)inHedyotisdifusaoralsolutionbyreversed
phaseHPLCwasdeveloped.Method:TheseparationwasperformedonaDiamonsilTMC18column(46mm×250mm,5μm)with
gradientelution.Aacetonitrile,Bmethonalwaterglacialaceticacid(5∶95∶025),020min,1%16%A;2042min,16%A;42
46min,16%20%A;4665min,20%A.TheUVdetectionwassetat265nm;flowrate10mL·min-1.Result:Therewasgood
linearitybetweenthepeakareaandconcentrationattherangesof21105(r=09998),35175(r=09998),17286(r=
09999),40200mg·L-1(r=10000)forⅠ,Ⅱ,Ⅲ andⅣ respectively.TheaveragerecoveriesofⅠ,Ⅱ,Ⅲ andⅣ were
999%,979%,986% and981%.Conclusion:Themethodisrapid,simpleandaccurate,anditcanbeusedfortheevaluation
ofH.difusaoralsolution.
[Keywords] HPLC;Hedyotisdifusa;metyl3,4dihydroxybenzoate;pcoumaricacid;ferulaicacid;E6Opcoumaroyl
scandosidemethylester
[责任编辑 鲍 雷]
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