全 文 ：斑点免疫印迹法快速测定水蛭炮制品中
水蛭素水解产物含量
王厚伟，田景振
（山东中医药大学 药学院，山东 济南 ２５０３５５）
［摘要］ 目的：测定４批次水蛭炮制品水蛭素水解产物含量，建立斑点免疫印迹法评价相应生药材药效成分
明确的中药炮制品质量新方法。方法：以鼠抗水蛭素单抗为一抗，应用斑点免疫印迹法对水蛭炮制品中水蛭素水
解产物作定性检测，杂交信号应用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件作定量分析。结果：４批次水蛭炮制品所含水蛭素水解产物的
质量分数分别为２９６５１，１６５４７，９５５８，２９８０５μｇ·ｇ－１。结论：不同批次水蛭炮制品之间水蛭素水解产物含量差
异显著，斑点免疫印迹法简便快捷，结果准确，无需大型设备，可用于水蛭与类似中药材炮制品的品质评价。
［关键词］ 水蛭；斑点印迹；水蛭素
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１９２１９３０３
［收稿日期］ ２００８０３２３
［基金项目］ 山东省教育厅（Ｊ０６Ｌ１７）；山东省优秀中青年科学
家奖励基金（２００７ＢＳＢ１４０８７）；山东省中药理论与技术创新团队资助
［通讯作者］ 王厚伟，Ｔｅｌ：１３７９１１３８４１９，Ｅｍａｉｌ：ｈｏｕｗｅｉｗ＠
１６３．ｃｏｍ
活体水蛭唾液中含有肽类化合物水蛭素，能够
阻止血液凝固，是水蛭抗凝血的主要活性成分，也是
该种生药材质量评价的重要指标成分。中医临床应
用的是水蛭的干燥体，是将新鲜活体水蛭经沸水烫
死后再经滑石粉烫制工艺加工而成。水蛭素不稳
定，在较高温度下短时间即可灭活。大量研究表明，
水蛭炮制品中不含有水蛭素，其发挥抗凝药效作用
的物质基础主要为水蛭素的水解产物［１］。因此，水
蛭素水解产物含量可以作为水蛭炮制品的质量评价
指标。鉴于水蛭素水解产物的不确定性，传统用于
中药质量评价的ＨＰＬＣ无法直接测出水蛭炮制品中
该类组分的含量。至今，没有建立这类直接应用于
中医临床的中药炮制品质量评价的便捷方法，除非
作繁琐的药效学检验。基于大分子蛋白质抗原的水
解产物大都能够与原抗原抗体结合的特性，作者拟
用斑点免疫印迹的方法，以鼠抗水蛭素单抗为一抗，
检测水蛭炮制品中水蛭素及其水解产物含量。
１ 仪器与试药
４批次水蛭炮制品药材购自山东中医药大学附
属中鲁医院，水蛭素对照品（Ｓｉｇｍａ公司），鼠抗水蛭
素单抗（Ａｂｃａｍ公司），硝酸纤维素膜，辣根酶标记
山羊抗鼠ＩｇＧ，ＥＣＬ试剂盒（北京中山公司），封闭脱
脂奶粉（安怡高钙脱脂奶粉，新西兰）。
２ 方法与结果
２．１ 试验方法 基于水蛭素抗体对水蛭炮制品中
的水蛭素水解产物的免疫识别作用，以鼠抗水蛭素
单抗为一抗，与４批次水蛭制品水提液在硝酸纤维
素膜上作免疫杂交，经 ＨＲＰ标记的二抗催化底物
ＥＣＬ显色，应用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件对杂交斑点作定量
分析。
取５０μＬ水蛭素对照品或水蛭炮制品水提液滴
加到硝酸纤维素膜上，用５％脱脂奶粉封闭２ｈ后，
室温下先用一抗鼠抗水蛭素抗体（１∶１０００稀释）孵
育２ｈ，ＰＢＳＴ洗膜１ｈ，再用辣根过氧化物酶标记的
山羊抗鼠ＩｇＧ二抗（１∶２０００稀释）孵育１ｈ，ＰＢＳＴ
（磷酸盐吐温缓冲液）洗膜３０ｍｉｎ后，按 Ａｍｅｒｓｈａｍ
公司试剂盒说明书进行 ＥＣＬ显影。免疫杂交斑点
应用 Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件作定量分析。分析方法采用
轨迹定量法，背景排除的 ＲｏｌｉｎｇＤｉｓｋＳｉｚｅ值设为
１０。各项数据以 珋ｘ±ｓ表示，各组间差异显著性统计
采用ＳＰＳＳ１３０统计软件进行分析。
２．２ 供试样品溶液的制备 准确称量４批次水蛭
炮制品各２０ｇ，加入２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的ＰＢＳ（磷酸盐缓
冲液）２０ｍＬ，搅拌浸润３０ｍｉｎ后，充分研磨浸提３０
ｍｉｎ，其间，分３次加入６０ｍＬＰＢＳ。然后，转移至２
个５０ｍＬ离心管４０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，上清过滤去
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脂，收集于２５０ｍＬ量瓶中。沉淀加入２０ｍＬＰＢＳ重
新悬浮，研磨浸提３０ｍｉｎ，４０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，取
上清液合并于量瓶中，定容至２５０ｍＬ。
２．３ 对照品溶液的制备 精密称取水蛭素对照品
１６ｍｇ，置于１０ｍＬ量瓶中，加水至刻度，摇匀，用作
对照品储备液（１６０ｍｇ·Ｌ－１）。精密量取储备液
１００，０７５，０５０，０２５ｍＬ，置于４个１０ｍＬ量瓶中，
加水至刻度，摇匀，即得１６，１２，８，４ｍｇ·Ｌ－１的水蛭
素抗原标准液。以１ｇ·Ｌ－１的ＢＳＡ溶液与５％的脱
脂奶粉作为阴性对照品溶液。
２．４ 斑点免疫印迹干扰试验 取５０μＬ的 ＢＳＡ溶
液点加到硝酸纤维素膜上，重复５次，以５％的脱脂
奶粉封膜后，按上述试验方法作斑点免疫印迹，显色
结果无杂交斑点出现，表明ＢＳＡ与脱脂奶粉蛋白对
水蛭素抗体无免疫识别作用，该２种阴性对照溶液
对斑点免疫印迹实验结果无干扰。
２．５ 线性关系考察 取４种浓度的水蛭素抗原标
准液各５０μＬ，点加到硝酸纤维素膜上（相当于水蛭
素标准品的质量为 ０２０，０４０，０６０，０８０μｇ），室
温下与１∶１０００稀释的鼠抗水蛭素单抗作斑点免疫
印迹，免疫杂交图谱采用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件作轨迹定
量扫描分析（图１），应用轨迹定量法测定不同浓度
对照品的杂交信号（表１），以标准抗原水蛭素浓度
为横坐标，轨迹信号量为纵坐标，得回归方程 Ｙ＝
２４３２５Ｘ；Ｒ２＝０９５４４。结果表明水蛭素标准抗原
在０～１６ｍｇ·Ｌ－１与Ｄｏｔｂｌｏｔｉｎｇ斑点的轨迹信号量
的线性关系良好。
１，２，３，４分别为１６，１２，８，４ｍｇ·Ｌ－１的水蛭素
标准液的免疫印迹斑点
图１ 水蛭素标准液的斑点免疫印迹与轨迹扫描图
２．６ 精密度试验 取同一批次水蛭炮制品水提液
５０μＬ，点加到硝酸纤维素膜上，重复５次，参照２．１
作斑点免疫印迹，应用轨迹定量法测定杂交斑点的
表１ 水蛭素标准液斑点免疫印迹信号轨迹分析
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
Ｎｏ．
水蛭素
／ｍｇ·Ｌ－１
峰值
／Ｉｎｔ
轨迹信号量
／Ｉｎｔ×ｍｍ
１ １６ ４４８０±２１５ ４２５０±３７０
２ １２ ３２８０±１８２ ２５８０±２３０
３ ８ ２６５０±１０７ １８３０±１１０
４ ４ １４３０±０５５ ７９０±０６７
轨迹信号量，５次重复的平均值为３６１７Ｉｎｔ×ｍｍ，
ＲＳＤ１９０％。
２．７ 稳定性试验 取同一批次水蛭炮制品水提液
５０μＬ，点加到硝酸纤维素膜上，分别于０，２，４，６，８ｈ
后与水蛭素单抗作免疫杂交，杂交信号作轨迹定量
扫描分析，计算得其ＲＳＤ１５０％。结果表明供试品
溶液在８ｈ内是稳定的。
２．８ 重复性试验 称取同一批次水蛭炮制品６份，
每份２０ｇ，按上述方法制备供试品溶液，取５０μＬ点
加到硝酸纤维素膜上，作斑点免疫印迹，杂交信号作
轨迹定量分析，计算得其 ＲＳＤ３９０％，结果表明实
验方法的重复性良好。
２．９ 回收率试验 精确称取０１０ｍｇ水蛭素标准
品，加入到２０ｍＬ的１ｇ·Ｌ－１的 ＢＳＡ溶液中，取５０
μＬ点加到硝酸纤维素膜上，与１∶１０００稀释的水蛭
素单抗作斑点免疫印迹，重复 ５次，杂交信号应用
Ｑｕａｎｉｔｙｏｎｅ软件作轨迹定量扫描分析，计算得水蛭
素的平均回收率为９３２６％，ＲＳＤ４４０％。
２．１０ 样品测定 各取４批次水蛭炮制品水提液
５０μＬ，点加到硝酸纤维素膜上，与１∶１０００稀释的
鼠抗水蛭素抗体作斑点免疫印迹，重复５次，杂交信
号应用 Ｑｕａｎｉｔｙｏｎｅ做定量分析（图２）。根据标准
曲线的回归方程得出４批次水蛭炮制品中水蛭素水
解产物的浓度与质量分数（表 ２）。由表 ２可见，４
批次水蛭炮制品中水蛭素水解产物的质量分数分别
为２９６５１，１６５４７，９５５８，２９８０５μｇ·ｇ－１，由表 ３
可见，第１批与第４批次水蛭素水解产物含量最高，
二者无显著性差异，其次是第２批次药材，水蛭素水
解产物含量最低的是第３批次药材，第２，３批次药
材的水蛭素水解物含量与第１，４批次之间差异极显
著。
３ 讨论
作者所提出的斑点免疫印迹法，是一种建立在
国际经典Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术上的基于药物免疫原性
相同的免疫杂交方法［２］。结果表明，不同批次水蛭
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１～４分别为４个批次水蛭炮制品的免疫印迹斑点
图２ ４批次水蛭炮制品的斑点免疫印迹与轨迹扫描图
表２ 斑点免疫印迹法测定４批次水蛭炮制品中
水蛭素水解产物含量（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
批次
斑点轨迹信号
／Ｉｎｔ×ｍｍ
峰值
／Ｉｎｔ
水蛭素
ｍｇ·Ｌ－１ μｇ·ｇ－１
１ ３６７０±３２０ ５７７０±２７０ ２３７２ ２９６５１
２ １８２０±１７０ ３２２０±１５０ １３２４ １６５４７
３ １０７０±１０９ １８６０±１０４ ７６５ ９５５８
４ ３７８０±３４０ ５８００±２９０ ２３８４ ２９８０５
表３ ４批次水蛭炮制品中水蛭素水解产物
质量分数的ＬＳＤ检验
组平均数 １ ２ ３ ４
１ ０ １３１０４１） ２００９３１） １５４
２ １３１０４１） ０ ６９８９１） １３２５８１）
３ ２００９３１） ６９８９１） ０ ２０２４７１）
４ １５４ １３２５８１） ２０２４７１） ０
注：１）Ｐ＜００１，差异极显著
炮制品之间水蛭素水解产物含量存在差异，这对在
用药标准条件下水蛭的临床药效产生影响。因此，
对于生药的药效成分已明确、而在炮制中不稳定的
这类中药炮制品，应用斑点免疫印迹法进行质量检
测与控制，并指导临床用药，具有重大实践意义。
［参考文献］
［１］ 刘 煜，谭树华，吴梧桐．全组水蛭素的抗凝与抗血栓作用研
究［Ｊ］．中国药科大学学报，２００２，３３（３）：２５０．
［２］ ＳａｍｂｒｏｏｋＪ，ＦｒｉｔｓｃｈＥＦ，ＭａｎｉａｔｉｓＴ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ［Ｍ］．２ｎｄｅｄ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９：９２４．
Ｒａｐｉｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｈｉｒｕｄｉｎ＇ｓｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｉｎ
ｐｒｏｃｅｓｓｅｄｌｅｅｃｈｂｙｄｏｔｂｌｏｔｔｉｎｇ
ＷＡＮＧＨｏｕｗｅｉ，ＴＩＡＮＪｉｎｇｚｈｅｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎａｎ２５０３５５，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｈｉｒｕｄｉｎ＇ｓｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｉｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄｌｅｅｃｈｅｓ，ｓｅｔｕｐａｎｅｗｅｖａｌｕａｔｉｎｇｍｅｔｈ
ｏｄｏｆｄｏｔｂｌｏｔｉｎｇｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｑｕａｌｉｔｉｅｓｏｆｔｈｏｓｅｐｒｏｃｅｓｓｅｄＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｓａｓｌｅｅｃｈｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｈｉｒｕｄｉｎ＇ｓｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ
ｉｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄｌｅｅｃｈｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｄｏｔｂｌｏｔｉｎｇｗｉｔｈｒａｔａｎｔｉｂｏｄｙｏｆａｎｔｉｈｉｒｕｄｉｎａｓｔｈｅｆｉｒｓｔａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｂｌｏｔｉｎｇｓｉｇｎａｌｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ
ｂｙｓｏｆｔｗａｒｅｏｆＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｈｉｒｕｄｉｎ＇ｓｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｉｎｆｏｕｒｂａｔｃｈｅｓｏｆｐｒｏｃｅｓｓｅｄｌｅｅｃｈｅｓｗｅｒｅ２９６５１，１６５４７，
９５５８，ａｎｄ２９８０５μｇ·ｇ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｆｏｕｒｂａｔｃｈｅｓｏｆｐｒｏｃｅｓｓｅｄｌｅｅｃｈｅｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｈｉｒｕｄｉｎ＇ｓｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ．Ｄｏｔｂｌｏｔｉｎｇ，ａｓａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｃａｎｂｅｂｒｏａｄｌｙｕｓｅｄｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｄｐｒｏｄ
ｕｃｔｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｃｒｕｄｅｄｒｕｇｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｌｅｅｃｈｅｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｌｅｅｃｈ；ｄｏｔｂｌｏｔｉｎｇ；ｈｉｒｕｄｉｎ
［责任编辑 鲍 雷］
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