全 文 :夏枯草液相色谱指纹图谱研究
孙维广1,柯雪红2,李 苑3,花汝凤1,陈锦富2
(1.广州星群药业股份有限公司,广东 广州 510288;
2.广州中医药大学 第一附属医院 实验中心,广东 广州 510405;
3.广东省药物研究所,广东 广州 510440)
[摘要] 目的:建立夏枯草HPLC指纹图谱,为中药材质量控制提供有效的方法。方法:SunfireC18色谱柱;A
相为1%醋酸,B相为甲醇组成的梯度洗脱液;检测波长290nm;柱温30℃;流速10mL·min-1;分析时间60min。
对不同产地的夏枯草指纹图谱测定,采用统计方法对其进行分类。结果:10批夏枯草指纹图谱相似度≥0810。采
用聚类分析将不同产地的药材分为3类。结论:该方法稳定可靠,可以有效地用于夏枯草原材料质量控制,为制剂
的稳定性提供参考。
[关键词] 夏枯草;指纹图谱;HPLC;质量控制
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18209004
[收稿日期] 20071217
[基金项目] 广州市科技攻关重大项目(2007Z1E5033)
[通讯作者] 柯雪红,Tel:(020)36591740,Email:kexuehong
@126.com.cn
夏枯草为唇形科夏枯草属植物夏枯草 Prunela
vulgarisLinn的干燥果穗,具有清火、明目、散结、消
肿之功效,中医应用于目赤肿痛,头痛眩晕,瘰疬,瘿
瘤,乳痈肿痛,甲状腺肿大,淋巴结结核,乳腺增生,
高血压等病症[1]。在国外,夏枯草作为一种自我康
复药物,在缓解咽喉疼痛、发热及加速伤口愈合等方
面得到广泛应用,并受到重视。夏枯草主要含有三
萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机
酸、挥发油及糖类等成分[23]。目前,文献报道只对
夏枯草单个有效成分熊果酸进行含量测定[4],本研
究采用 HPLCPDA建立其指纹图谱,利用 SPSS及
中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对10批样
品进行分析,为夏枯草质量控制提供依据。
1 仪器和试剂
Waters2695高效液相色谱仪,Waters2996二极
管阵列检测器;Empower色谱工作站,瑞士梅特勒公
司AE-200型电子分析天平,超声波清洗器
(SK3300LH,上海科导超声仪有限公司);超纯水器
(ReoPure75LPTM,Waterspurificationsystems);
SunfireC18分析柱(46mm×150mm,5μm);甲醇
为色谱纯,乙醇、醋酸为分析纯,水为超纯水;夏枯草
(广州星群药业股份有限公司提供)见表1,由广州
中医药大学柯雪红副主任药师鉴定为Pvulgaris。
表1 10批夏枯草药材来源
No. 产地 批号
1 湖北随州 060611
2 湖北随州 060509
3 河南信阳 060508
4 江苏 60322
5 河南信阳 060713
6 湖北罗田 060610
7 河南信阳 060612
8 河南信阳 060715
9 河南信阳 060714
10 河南信阳 060716
中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件
(2004A版),SPSS115统计软件。
2 HPLC指纹图谱的建立
2.1 供试品溶液制备 精密称取夏枯草药材粉末
(过65目筛)25g置具塞三角瓶中,精密加入甲醇
50mL,塞紧,浸泡2h,超声(功率59kHz)处理30
min后,放至室温,用溶剂补足失重,摇匀,过滤,滤
液挥干,残渣用甲醇溶解转移置2mL量瓶中,加甲
醇至刻度。摇匀,045μm微孔滤膜过滤,即得供试
品溶液。
2.2 色谱条件 SunFireC18色谱柱(46mm×150
mm,5μm),流动相A为1%醋酸水溶液,B为甲醇,
梯度洗脱程序 0~5min,B0~7%;5~9min,B
7%~10%;9~13min,B10%~18%;13~20minB
·0902·
第33卷第18期
2008年9月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 18
September,2008
18% ~22%;20~35min,B22% ~40%;35~55
min,B40%~70%;55~60min,B70%~100%。流
速10mL·min-1,柱温 30℃。考察发现 290nm
波长检测效果较好(图1),供试品溶液20μL进样,
理论板数按参照峰(S峰)计算应不低于3000。
1~15.特征峰
图1 夏枯草的HPLC特征指纹图谱
2.3 精密度试验 同一批样品在上述色谱条件,连
续进样5次,测定指纹图谱,结果以5号峰为参照
峰,各共有峰的相对保留时间RSD均低于05%,相
对峰面积RSD均低于3%,表明精密度良好。
2.4 稳定性试验 同一批样品在上述色谱条件下,
分别在0,6,12,24,48h测定指纹图谱,结果以5号
峰为参照峰,各共有峰的相对保留时间 RSD均低
于1%,相对峰面积RSD均低于3%,表明在48h内
样品稳定性良好。
2.5 重复性试验 取同一批样品按2.1项下方法
制备5份供试液,按上述色谱条件测定指纹图谱,结
果以5号峰为参照峰,各共有峰的相对保留时间
RSD均低于1%,相对峰面积RSD均低于3%,表明
重复性良好。
3 不同产地夏枯草指纹图谱分析
3.1 参照峰的选定 按2.1项下方法制备不同产
地夏枯草供试液,按2.2项下色谱条件,分别进样
20μL,测定各产地夏枯草指纹图谱。指纹图谱中5
号峰为夏枯草指纹图谱共有特征峰,保留时间(约
为2140min)位于色谱图的中心位置,分离度理
想,吸收度较高,以该峰为参照峰。
3.2 共有峰的确定 10批不同产地夏枯草样品的
色谱指纹图谱虽然有一定差异,但其中有15个色谱
峰为夏枯草药材的共有特征峰,约占总峰面积的
86%,其保留时间分别为 1028,1132,1170,
1511,2133,2787,2844,3681,3733,3985,
4074,4459,4502,4765,5524min,这些特征峰
可作为控制夏枯草药材质量的标准之一。非共有色
谱峰没有特定的规律,可视为不同样品之间的差异,
结果见图2。以5号色谱峰为参照峰(S峰),计算
共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见
表2,3。
图2 10批夏枯草HPLC指纹图谱
表2 10批夏枯草共有峰的相对保留时间 /min
No
样品号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
均值
1 04831 04828 04877 04828 04831 04812 04816 04821 04824 04813 04828
2 05305 05309 05297 05328 05318 05294 05307 05307 05313 05315 05309
3 05496 05488 05475 05488 05497 05487 05484 05487 05493 05481 05488
4 07093 07063 07116 07078 07087 07071 07084 07093 07087 07082 07085
5 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000
6 13025 13075 12871 13102 13090 13102 13099 13156 13131 13102 13075
7 13363 13339 13396 13325 13304 13299 13323 13342 13314 13336 13334
8 17233 17259 17476 17372 17185 17149 17226 17250 17203 17253 17261
9 17406 17460 17700 17967 17389 17354 17432 17450 17415 17461 17504
10 18615 18708 18681 18767 18649 18542 18708 18725 18703 18754 18685
11 19031 19148 19209 19303 18991 19036 19052 19017 19044 19166 19100
12 20843 20810 21047 20991 20854 20738 20981 20959 20890 20958 20907
13 21055 21038 21275 21189 21062 20940 21096 21173 21099 21165 21109
14 22265 22294 22296 22362 22296 22149 22305 22365 22288 22338 22296
15 25805 25747 25671 26263 25867 25615 25933 25948 25969 26156 25897
3.3 不同产地夏枯草的指纹图谱相似度评价 对
10批夏枯草进行指纹图谱测定,用相关系数、夹角
余弦及中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算相似
度(5号样为参照),结果见表4。
·1902·
第33卷第18期
2008年9月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 18
September,2008
表3 10批夏枯草共有峰的相对峰面积
No
样品号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
均值
1 00290 00606 00420 00194 00502 00630 00353 00255 00319 00302 00387
2 00853 00406 01392 01387 01072 00942 00819 00889 00725 00563 00905
3 00847 00196 00924 01121 01170 02012 00668 00748 00849 00898 00943
4 01423 02014 01554 01791 02009 04210 00998 00841 01104 01089 01703
5 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000
6 01143 00078 00381 00191 01376 00124 00779 00589 00612 00118 00539
7 01683 00801 00827 00966 01328 01677 00929 00904 01021 01257 01139
8 02985 04810 02025 02131 02784 02141 01984 02158 02523 01359 02490
9 04283 07487 04231 15418 07207 04598 03957 04955 04502 02268 05891
10 06866 04545 07407 03388 11979 04213 03814 06906 06773 03206 05910
11 116446 76897 81796 32540 134560 58262 89023 80255 92795 55954 81853
12 00942 04849 01358 00424 00995 01321 00875 01126 00904 00558 01335
13 00804 01232 00454 00718 01480 00968 00945 01177 00882 00866 00953
14 02795 17016 00622 00764 00555 02841 06246 06081 00513 01920 03935
15 08988 26754 10758 04911 18654 21437 12044 12790 11804 05582 13372
表4 10批夏枯草指纹图谱相似度结果
参数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
相关系数 09958 09699 09983 09136 09977 09790 09986 09993 09985 09952
夹角余弦 09958 09699 09983 09136 09977 09790 09986 09993 09985 09952
色谱对照 08130 09300 09550 08720 09540 09440 09550 09321 09550 09510
色谱参照 06040 09520 09940 08820 10000 09640 09960 09542 09990 09880
3.4 夏枯草药材指纹图谱聚类分析 笔者分析比
较10批夏枯草样品的指纹图谱,采用计算机图谱解
析技术对上述样品的指纹图谱进行处理,获得其量
化指纹特征(HPLC色谱峰峰面积数据)。将量化指
纹特征作为变量输入计算机,用 SPSS115统计软
件进行系统聚类分析。聚类分析结果表明,10批样
品可分为3类:3,5,7,8,9,10号样品为一类,1,2,6
号样品为一类,4号样品为一类。这3类对应于夏
枯草产地分别为河南信阳、湖北和江苏。
4 讨论
考察了用甲醇及50%,75%,95%乙醇提取及
水提醇沉等方法筛选样品提取条件,结果甲醇提取
液色谱峰峰形好,基线稳,因此选用甲醇提取。
采用 PDA检测器所获得的各主要色谱峰紫外
吸收光谱在254,290,320nm波长附近有明显吸收。
其中290nm检测条件下,色谱峰较多,各峰吸收均
匀,基线平稳,因此确定290nm为检测波长。
相似度分析结果表明,10批不同产地夏枯草样
品与共模的相似度均大于081,表明本文建立夏枯
草指纹图谱可体现其药材共性特征,有利于质量控
制的提高。
采用聚类分析,运用欧氏距离(Euclidcan)作为
样品的测度,对10批夏枯草样品进行分类,结果系
统将批0个样品按产地分为3类,该分类结果与实
际情况基本相符,说明文中采用的聚类分析方法可
用于不同产地药材指纹图谱分类。聚类分析结果与
指纹图谱特征的相关性有待以后在大量样本基础上
进一步研究。
[参考文献]
[1] 刘明生,姚丽玲,李会轻,等.夏枯草研究进展[J].国外医药·
植物药分册,1993,8(3):104.
[2] 刘 悦,宋少江,徐绥绪,等.夏枯草的化学成分及生物活性研
究进展[J].沈阳药科大学学报,2003,20(1):55.
[3] 孟正木,何立文.夏枯草化学成分研究[J].中国药科大学学
报,1995,26(6):329.
[4] 李晓蒙,廖华卫.夏枯草中熊果酸的含量测定[J].广东药学院
学报,2002,18(1):31.
·2902·
第33卷第18期
2008年9月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 18
September,2008
StudyonHPLCfingerprintofPrunelavulgaris
SUNWeiguang1,KEXuehong2,LIYuan3,HUARufeng2,CHENJinfu2
(1.GuangzhouXingqunPharmaceuticalLtd.Co.,Guangzhou510288,China;
2.FirstHospitalAfiliatedtoGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China;
3.ProvincialInstituteofMedicine,Guangzhou510440,China)
[Abstract] Objective:ToestablishHPLCfingerprintofPrunelavulgariseforqualitycontroloftheherbalmedicine.Method:
AsunfireC18analyticalcolumnwasused.ThemobilephaseAwas1% aceticacid,andmobilephaseBwasmethanol.Theelutionwas
ingradientmodeanddetectionwavelengfhwassetat290nm.Theflowratewas10mL·min-1andthecolumntemperatureat30℃.
Theanalysistimewas60min.Result:Thesimilarityof10batchesofPvulgariswasnotlowerthan0810.Thefingerprintsofthe
herbalmedicinewereclassifiedPvulgarisontheresultsofclusteranalysis.Conclusion:Thismethodisavailableforqualityevalua
tionandcontrolthequalityofPvulgaris.
[Keywords] Prunelavulgaris;fingerprint;HPLC;qualitycontrol
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20071106
[基金项目] 国家“十五”重大科技专项(2004AA2Z373015)
[通讯作者] 张朝凤,Tel:(025)85391245,Email:njchaofeng
@126.com
千里光药材的 HPLC指纹图谱及 ESIMS分析
张朝凤,陈录新,张 勉,王峥涛
(中国药科大学 生药研究室,江苏 南京 210038)
[摘要] 目的:建立千里光Senecioscandens药材的质量评价方法。方法:采用 HPLCUV对12批千里光药材
的指纹图谱进行比较研究,用LCESIMS技术对其共有峰进行分析。结果:获得千里光药材的HPLC指纹图谱,并
检出8个共有峰,LCESIMS分析结果表明共有峰主要为绿原酸或黄酮类成分的吸收峰。结论:建立的HPLC指纹
图谱可用于千里光的质量评价。
[关键词] 千里光;HPLC;指纹图谱;ESIMS分析
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18209304
千里光为菊科Compositae千里光属植物Senecio
scandensBuch.Ham.的干燥地上部分,我国应用历
史悠久的常用中药。本品以千里及之名始载于《本
草拾遗》,味苦、辛,性寒,清热解毒,明目退翳,杀虫
止痒。主治流感,上呼吸道感染,黄疸型肝炎,胆囊
炎,急性尿路感染,目赤肿痛翳障等[1]。主要分布
于我国浙江、江苏、安徽等地,广西、云南也有分布。
千里光HerbaSenecionisScandentis中化学成分主要
有黄酮、酚酸、生物碱类等[2]。国内外对千里光属
植物的研究较多,但针对千里光 Senecioscandens的
研究较少,且未被药典收录。为了合理利用药材资
源、有效控制其质量、完善药典,作者在获得有效成
分对照品金丝桃苷的基础上[3],建立了12批千里光
药材的HPLC指纹图谱,并对8个共有峰进行了LC
ESIMS分析,以期对千里光药材的质量控制提供理
论依据。
1 仪器、试剂与药材
Agilent1100高效液相色谱仪,G1313自动进样
器,G1314可变波长紫外检测器,HpChemstation
System色谱工作站,Agilent1100LCDADMS系统;
·3902·
第33卷第18期
2008年9月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 18
September,2008