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HPLC fingerprint of Prunella vulgaris

夏枯草液相色谱指纹图谱研究



全 文 :夏枯草液相色谱指纹图谱研究
孙维广1,柯雪红2,李 苑3,花汝凤1,陈锦富2
(1.广州星群药业股份有限公司,广东 广州 510288;
2.广州中医药大学 第一附属医院 实验中心,广东 广州 510405;
3.广东省药物研究所,广东 广州 510440)
[摘要] 目的:建立夏枯草HPLC指纹图谱,为中药材质量控制提供有效的方法。方法:SunfireC18色谱柱;A
相为1%醋酸,B相为甲醇组成的梯度洗脱液;检测波长290nm;柱温30℃;流速10mL·min-1;分析时间60min。
对不同产地的夏枯草指纹图谱测定,采用统计方法对其进行分类。结果:10批夏枯草指纹图谱相似度≥0810。采
用聚类分析将不同产地的药材分为3类。结论:该方法稳定可靠,可以有效地用于夏枯草原材料质量控制,为制剂
的稳定性提供参考。
[关键词] 夏枯草;指纹图谱;HPLC;质量控制
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18209004
[收稿日期] 20071217
[基金项目] 广州市科技攻关重大项目(2007Z1E5033)
[通讯作者] 柯雪红,Tel:(020)36591740,Email:kexuehong
@126.com.cn
  夏枯草为唇形科夏枯草属植物夏枯草 Prunela
vulgarisLinn的干燥果穗,具有清火、明目、散结、消
肿之功效,中医应用于目赤肿痛,头痛眩晕,瘰疬,瘿
瘤,乳痈肿痛,甲状腺肿大,淋巴结结核,乳腺增生,
高血压等病症[1]。在国外,夏枯草作为一种自我康
复药物,在缓解咽喉疼痛、发热及加速伤口愈合等方
面得到广泛应用,并受到重视。夏枯草主要含有三
萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机
酸、挥发油及糖类等成分[23]。目前,文献报道只对
夏枯草单个有效成分熊果酸进行含量测定[4],本研
究采用 HPLCPDA建立其指纹图谱,利用 SPSS及
中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对10批样
品进行分析,为夏枯草质量控制提供依据。
1 仪器和试剂
Waters2695高效液相色谱仪,Waters2996二极
管阵列检测器;Empower色谱工作站,瑞士梅特勒公
司AE-200型电子分析天平,超声波清洗器
(SK3300LH,上海科导超声仪有限公司);超纯水器
(ReoPure75LPTM,Waterspurificationsystems);
SunfireC18分析柱(46mm×150mm,5μm);甲醇
为色谱纯,乙醇、醋酸为分析纯,水为超纯水;夏枯草
(广州星群药业股份有限公司提供)见表1,由广州
中医药大学柯雪红副主任药师鉴定为Pvulgaris。
表1 10批夏枯草药材来源
No. 产地 批号
1 湖北随州 060611
2 湖北随州 060509
3 河南信阳 060508
4 江苏   60322
5 河南信阳 060713
6 湖北罗田 060610
7 河南信阳 060612
8 河南信阳 060715
9 河南信阳 060714
10 河南信阳 060716
  中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件
(2004A版),SPSS115统计软件。
2 HPLC指纹图谱的建立
2.1 供试品溶液制备 精密称取夏枯草药材粉末
(过65目筛)25g置具塞三角瓶中,精密加入甲醇
50mL,塞紧,浸泡2h,超声(功率59kHz)处理30
min后,放至室温,用溶剂补足失重,摇匀,过滤,滤
液挥干,残渣用甲醇溶解转移置2mL量瓶中,加甲
醇至刻度。摇匀,045μm微孔滤膜过滤,即得供试
品溶液。
2.2 色谱条件 SunFireC18色谱柱(46mm×150
mm,5μm),流动相A为1%醋酸水溶液,B为甲醇,
梯度洗脱程序 0~5min,B0~7%;5~9min,B
7%~10%;9~13min,B10%~18%;13~20minB
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    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 18
September,2008
18% ~22%;20~35min,B22% ~40%;35~55
min,B40%~70%;55~60min,B70%~100%。流
速10mL·min-1,柱温 30℃。考察发现 290nm
波长检测效果较好(图1),供试品溶液20μL进样,
理论板数按参照峰(S峰)计算应不低于3000。
1~15.特征峰
图1 夏枯草的HPLC特征指纹图谱
2.3 精密度试验 同一批样品在上述色谱条件,连
续进样5次,测定指纹图谱,结果以5号峰为参照
峰,各共有峰的相对保留时间RSD均低于05%,相
对峰面积RSD均低于3%,表明精密度良好。
2.4 稳定性试验 同一批样品在上述色谱条件下,
分别在0,6,12,24,48h测定指纹图谱,结果以5号
峰为参照峰,各共有峰的相对保留时间 RSD均低
于1%,相对峰面积RSD均低于3%,表明在48h内
样品稳定性良好。
2.5 重复性试验 取同一批样品按2.1项下方法
制备5份供试液,按上述色谱条件测定指纹图谱,结
果以5号峰为参照峰,各共有峰的相对保留时间
RSD均低于1%,相对峰面积RSD均低于3%,表明
重复性良好。
3 不同产地夏枯草指纹图谱分析
3.1 参照峰的选定 按2.1项下方法制备不同产
地夏枯草供试液,按2.2项下色谱条件,分别进样
20μL,测定各产地夏枯草指纹图谱。指纹图谱中5
号峰为夏枯草指纹图谱共有特征峰,保留时间(约
为2140min)位于色谱图的中心位置,分离度理
想,吸收度较高,以该峰为参照峰。
3.2 共有峰的确定 10批不同产地夏枯草样品的
色谱指纹图谱虽然有一定差异,但其中有15个色谱
峰为夏枯草药材的共有特征峰,约占总峰面积的
86%,其保留时间分别为 1028,1132,1170,
1511,2133,2787,2844,3681,3733,3985,
4074,4459,4502,4765,5524min,这些特征峰
可作为控制夏枯草药材质量的标准之一。非共有色
谱峰没有特定的规律,可视为不同样品之间的差异,
结果见图2。以5号色谱峰为参照峰(S峰),计算
共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见
表2,3。
图2 10批夏枯草HPLC指纹图谱
表2 10批夏枯草共有峰的相对保留时间 /min
No
样品号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
均值
1 04831 04828 04877 04828 04831 04812 04816 04821 04824 04813 04828
2 05305 05309 05297 05328 05318 05294 05307 05307 05313 05315 05309
3 05496 05488 05475 05488 05497 05487 05484 05487 05493 05481 05488
4 07093 07063 07116 07078 07087 07071 07084 07093 07087 07082 07085
5 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000
6 13025 13075 12871 13102 13090 13102 13099 13156 13131 13102 13075
7 13363 13339 13396 13325 13304 13299 13323 13342 13314 13336 13334
8 17233 17259 17476 17372 17185 17149 17226 17250 17203 17253 17261
9 17406 17460 17700 17967 17389 17354 17432 17450 17415 17461 17504
10 18615 18708 18681 18767 18649 18542 18708 18725 18703 18754 18685
11 19031 19148 19209 19303 18991 19036 19052 19017 19044 19166 19100
12 20843 20810 21047 20991 20854 20738 20981 20959 20890 20958 20907
13 21055 21038 21275 21189 21062 20940 21096 21173 21099 21165 21109
14 22265 22294 22296 22362 22296 22149 22305 22365 22288 22338 22296
15 25805 25747 25671 26263 25867 25615 25933 25948 25969 26156 25897
3.3 不同产地夏枯草的指纹图谱相似度评价 对
10批夏枯草进行指纹图谱测定,用相关系数、夹角
余弦及中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算相似
度(5号样为参照),结果见表4。
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表3 10批夏枯草共有峰的相对峰面积
No
样品号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
均值
1 00290 00606 00420 00194 00502 00630 00353 00255 00319 00302 00387
2 00853 00406 01392 01387 01072 00942 00819 00889 00725 00563 00905
3 00847 00196 00924 01121 01170 02012 00668 00748 00849 00898 00943
4 01423 02014 01554 01791 02009 04210 00998 00841 01104 01089 01703
5 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000
6 01143 00078 00381 00191 01376 00124 00779 00589 00612 00118 00539
7 01683 00801 00827 00966 01328 01677 00929 00904 01021 01257 01139
8 02985 04810 02025 02131 02784 02141 01984 02158 02523 01359 02490
9 04283 07487 04231 15418 07207 04598 03957 04955 04502 02268 05891
10 06866 04545 07407 03388 11979 04213 03814 06906 06773 03206 05910
11 116446 76897 81796 32540 134560 58262 89023 80255 92795 55954 81853
12 00942 04849 01358 00424 00995 01321 00875 01126 00904 00558 01335
13 00804 01232 00454 00718 01480 00968 00945 01177 00882 00866 00953
14 02795 17016 00622 00764 00555 02841 06246 06081 00513 01920 03935
15 08988 26754 10758 04911 18654 21437 12044 12790 11804 05582 13372
表4 10批夏枯草指纹图谱相似度结果
参数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
相关系数 09958 09699 09983 09136 09977 09790 09986 09993 09985 09952
夹角余弦 09958 09699 09983 09136 09977 09790 09986 09993 09985 09952
色谱对照 08130 09300 09550 08720 09540 09440 09550 09321 09550 09510
色谱参照 06040 09520 09940 08820 10000 09640 09960 09542 09990 09880
3.4 夏枯草药材指纹图谱聚类分析 笔者分析比
较10批夏枯草样品的指纹图谱,采用计算机图谱解
析技术对上述样品的指纹图谱进行处理,获得其量
化指纹特征(HPLC色谱峰峰面积数据)。将量化指
纹特征作为变量输入计算机,用 SPSS115统计软
件进行系统聚类分析。聚类分析结果表明,10批样
品可分为3类:3,5,7,8,9,10号样品为一类,1,2,6
号样品为一类,4号样品为一类。这3类对应于夏
枯草产地分别为河南信阳、湖北和江苏。
4 讨论
考察了用甲醇及50%,75%,95%乙醇提取及
水提醇沉等方法筛选样品提取条件,结果甲醇提取
液色谱峰峰形好,基线稳,因此选用甲醇提取。
采用 PDA检测器所获得的各主要色谱峰紫外
吸收光谱在254,290,320nm波长附近有明显吸收。
其中290nm检测条件下,色谱峰较多,各峰吸收均
匀,基线平稳,因此确定290nm为检测波长。
相似度分析结果表明,10批不同产地夏枯草样
品与共模的相似度均大于081,表明本文建立夏枯
草指纹图谱可体现其药材共性特征,有利于质量控
制的提高。
采用聚类分析,运用欧氏距离(Euclidcan)作为
样品的测度,对10批夏枯草样品进行分类,结果系
统将批0个样品按产地分为3类,该分类结果与实
际情况基本相符,说明文中采用的聚类分析方法可
用于不同产地药材指纹图谱分类。聚类分析结果与
指纹图谱特征的相关性有待以后在大量样本基础上
进一步研究。
[参考文献]
[1] 刘明生,姚丽玲,李会轻,等.夏枯草研究进展[J].国外医药·
植物药分册,1993,8(3):104.
[2] 刘 悦,宋少江,徐绥绪,等.夏枯草的化学成分及生物活性研
究进展[J].沈阳药科大学学报,2003,20(1):55.
[3] 孟正木,何立文.夏枯草化学成分研究[J].中国药科大学学
报,1995,26(6):329.
[4] 李晓蒙,廖华卫.夏枯草中熊果酸的含量测定[J].广东药学院
学报,2002,18(1):31.
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StudyonHPLCfingerprintofPrunelavulgaris
SUNWeiguang1,KEXuehong2,LIYuan3,HUARufeng2,CHENJinfu2
(1.GuangzhouXingqunPharmaceuticalLtd.Co.,Guangzhou510288,China;
2.FirstHospitalAfiliatedtoGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China;
3.ProvincialInstituteofMedicine,Guangzhou510440,China)
[Abstract] Objective:ToestablishHPLCfingerprintofPrunelavulgariseforqualitycontroloftheherbalmedicine.Method:
AsunfireC18analyticalcolumnwasused.ThemobilephaseAwas1% aceticacid,andmobilephaseBwasmethanol.Theelutionwas
ingradientmodeanddetectionwavelengfhwassetat290nm.Theflowratewas10mL·min-1andthecolumntemperatureat30℃.
Theanalysistimewas60min.Result:Thesimilarityof10batchesofPvulgariswasnotlowerthan0810.Thefingerprintsofthe
herbalmedicinewereclassifiedPvulgarisontheresultsofclusteranalysis.Conclusion:Thismethodisavailableforqualityevalua
tionandcontrolthequalityofPvulgaris.
[Keywords] Prunelavulgaris;fingerprint;HPLC;qualitycontrol
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20071106
[基金项目] 国家“十五”重大科技专项(2004AA2Z373015)
[通讯作者] 张朝凤,Tel:(025)85391245,Email:njchaofeng
@126.com
千里光药材的 HPLC指纹图谱及 ESIMS分析
张朝凤,陈录新,张 勉,王峥涛
(中国药科大学 生药研究室,江苏 南京 210038)
[摘要] 目的:建立千里光Senecioscandens药材的质量评价方法。方法:采用 HPLCUV对12批千里光药材
的指纹图谱进行比较研究,用LCESIMS技术对其共有峰进行分析。结果:获得千里光药材的HPLC指纹图谱,并
检出8个共有峰,LCESIMS分析结果表明共有峰主要为绿原酸或黄酮类成分的吸收峰。结论:建立的HPLC指纹
图谱可用于千里光的质量评价。
[关键词] 千里光;HPLC;指纹图谱;ESIMS分析
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18209304
  千里光为菊科Compositae千里光属植物Senecio
scandensBuch.Ham.的干燥地上部分,我国应用历
史悠久的常用中药。本品以千里及之名始载于《本
草拾遗》,味苦、辛,性寒,清热解毒,明目退翳,杀虫
止痒。主治流感,上呼吸道感染,黄疸型肝炎,胆囊
炎,急性尿路感染,目赤肿痛翳障等[1]。主要分布
于我国浙江、江苏、安徽等地,广西、云南也有分布。
千里光HerbaSenecionisScandentis中化学成分主要
有黄酮、酚酸、生物碱类等[2]。国内外对千里光属
植物的研究较多,但针对千里光 Senecioscandens的
研究较少,且未被药典收录。为了合理利用药材资
源、有效控制其质量、完善药典,作者在获得有效成
分对照品金丝桃苷的基础上[3],建立了12批千里光
药材的HPLC指纹图谱,并对8个共有峰进行了LC
ESIMS分析,以期对千里光药材的质量控制提供理
论依据。
1 仪器、试剂与药材
Agilent1100高效液相色谱仪,G1313自动进样
器,G1314可变波长紫外检测器,HpChemstation
System色谱工作站,Agilent1100LCDADMS系统;
·3902·
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    中 国 中 药 杂 志
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