全 文 ：刺梨不同提取部位对人类肝癌细胞株 k ³¨ul胆固醇代谢的影响
吴水生 t3 o郭改革 t o王 宏 u o ⁄¤√¬§¨¨u
kt1福建中医学院 药学系 o福建 福州 vxsssv~
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≈收稿日期 ussy2ts2ts
≈通讯作者 3 吴水生 oר¯}ksx|tluu{yttvxo∞2°¤¬¯}º¶¶·¦°
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刺梨 Ροσα ροξβυργηιι ×µ¤·q为蔷薇科属野生植
物 o用于治疗积食腹胀 !肠炎痢疾 !维生素 ≤缺乏症
等 ∀刺梨含维生素 ≤ !维生素 ∞!超氧化物歧化酶
k≥⁄l!多糖 o以及 Β2谷甾醇 !原儿茶酸 !委陵菜酸 !
∏¨¶¦¤³«¬¦¤¦¬§!硬脂酸和廿一烷酸等成分 ≈t ∀具有
清除自由基 !增强机体免疫力 !防动脉粥样硬化 !抗
细胞突变和抗癌等药理作用 ≈u o此外还有明显的降
血脂作用 ≈v ∀本实验以人类肝癌细胞系 ³¨u为
模型 o测定刺梨各部位对细胞胆固醇合成与代谢的
影响 o以筛选刺梨降血脂作用有效成分或有效部位 o
为进一步开发刺梨降血脂药用部位奠定基础 ∀
1 材料与方法
111 材料
¬³¬·²µ标准品 k≥¬ª°¤公司 l~≥¼± µ¨ª¼µ ×酶标
仪 k ¬¦µ²× ®¨公司 l∀
112 试药制备
干燥刺梨果粉碎成 us目左右的粗粉 o皮肉与果
核同用 ∀
11211 水提物制备 称取一定量刺梨粉 o分别加入
{o y倍量的水 o各煎煮 t «o过滤 o合并 u次煎液 o浓
缩成浸膏 o真空冷冻干燥成干粉备用 ∀
11212 系统提取物制备 称取一定量刺梨粉 o加入
y倍量正已烷 o超声提取 wx °¬±o过滤 o再加入等量
溶剂超声 wx °¬±o合并 u次提取溶剂 o回收挥干溶
剂 ∀加热药渣挥去溶剂后再加入下一梯度溶剂 o做
法同上 ∀分别制得正已烷 !醋酸乙酯 !丙酮 !甲醇和
水刺梨提取物 o真空冷冻干燥备用 ∀
11213 甲醇提取物的 ⁄¬¤¬²± p °us分离纯化 取
刺梨甲醇提取物适量 o用水适量溶解 o上载到已经制
备好的 ⁄¬¤¬²± p °us树脂上 o先用水洗脱到无色 o
再改用 uxh o xsh o zxh otssh甲醇分别洗脱 o得
到上述 x个部位 o挥干溶剂 o真空冷冻干燥备用 ∀
11214 细胞培养试药的制备 准确称取一定量的
上述各已经制好备用的提取物 o以 ⁄ ≥溶解配制
成以 °ª# °pt为单位的贮存液 o再用不含脂蛋白
的 ⁄ ∞液稀释配制成不同浓度的工作液 k⁄ ≥
终浓度 s1th lo无菌过滤备用 ∀对照药 ¬³¬·²µ则配
成 v °°²¯# pt的贮存液备用 ∀
113 细胞培养与制备
³¨u细胞购自美国 ×≤≤ k
2{syxlo用含
有 tsh的胎牛血清 ƒ
≥k≥¬ª°¤l的 ⁄ ∞ k≤¨¯ ¯µ²o
tx2stv2≤∂ l做培养基 o种植于 y孔培养板内置于 vz
ε 的 ≤u培养箱内 ~待细胞长至合适密度后 o吸去上
清液 o用 °
≥清洗 u次 o分别加入 t1u °的上述试
验用药工作液 o对照组则加空白 ⁄ ∞ 液 ~培养 uw
«后收取 t °的培养液供测定培养液内的胆固醇
含量 ~然后吸除剩余的培养液 o用 °
≥清洗 u次 ~加
入 tus Λ的 ¬³¤
∏©©¨µ于各孔内 o轻轻振摇 ou ∗ v
°¬±后用 t °的 ·¬³头轻刮盘底 o使细胞脱落与溶
解 o吸取细胞溶解液 o置于 pus ε 冰冻保存备用 ∀
114 细胞毒性与活性测定
分别选用基于细胞内酯酶活性及胞膜完整性原
理的 ¬√ r¨⁄ ¤¨§µ试剂盒 k ²¯ ¦¨∏¯¤µ°µ²¥¨ ¶o 2vuuwl
及反应活细胞线粒体代谢活性的 ¤¯°¤µ¥¯∏¨ ×试剂
盒 k
¬²≥²∏µ¦¨o ⁄ttss ≥lo测定程序分别按说
明书方法操作 o以酶标仪测定 ∀
115 胆固醇含量测定
按试剂盒 °³¯ ¬¨µ k ²¯ ¦¨∏¯¤µ°µ²¥¨ ¶l的说明书
程序 o胆固醇标准曲线质量浓度为 so s1xo t1so
u1so w1so {1s Λª# °pt ∀吸取细胞溶解液 us Λo
加入 ¬³¤
∏©©¨µtss Λo稀释 y倍以供测定 ∀
116 蛋白质含量测定
用蛋白质含量测定试剂盒 k
¬²2 ¤§l测定 ∀蛋
白质标准曲线质量浓度分别为 so s1to s1xo t1so
t1x Λª# °pt ∀吸取细胞溶解液 x Λo加入 us Λ
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第 vu卷第 u期
ussz年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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的 ¬³¤
∏©©¨µo稀释 w倍以供测定 ∀
117 统计处理
所有数值以 cξ ? σ表示 o以 τ检验或 φ检验判断
两组或多组之间的差异显著性 ∀
2 结果
211 对细胞的毒性及代谢活性的影响
刺梨水提物分别以 so to xo ts °ª# °pt加入
已经长至一定密度的 ³¨u细胞 |y孔培养板内 o
置 ≤u培养箱内孵育 uw «后 o按试剂盒测定方法步
骤操作 ∀结果当质量浓度达 ts °ª# °pt时 o细胞
活性有所降低 o为 k|u ? v1xlh o故实验用药质量浓
度初拟为 so s1xo to x °ª# °pt ∀
212 对胆固醇含量的影响
在实验的不同阶段 o以 ⁄ ≥为溶剂制备各个
试验用药 o分别以 so s1xo t1so x1s °ª# °pt w个
质量浓度加药 ∀经过对 ¬³¬·²µ不同剂量的实验对
比 o最后确定 ¬³¬·²µ以 v Λ°²¯ # pt浓度为阳性对
照剂量 ∀具体测定方法按试剂盒方法操作 o分别测
定了培养液及细胞内胆固醇的含量 o单位以每毫克
蛋白质含胆固醇计算 kΛª# °ªpt l∀结果分别见表
t和表 u以及图 t∀
表 t 不同刺梨水提物对 ³¨u细胞胆固醇代谢
的影响 kcξ ? σl
组别 剂量 r°ª# pt 胆固醇 rΛª# °ªpt
空白 p tss ? vt
¬³¬·²µ p {s ? z
刺犁 sqx |s ? uv
水提物 t zx ? ty
x xu ? w
表 u 不同浓度的各种溶剂刺梨提取物对
³¨u细胞胆固醇代谢的影响 kcξ ? σl h
质量浓度
r°ª# °pt
正已烷 乙酸乙酯 丙酮 甲醇 水
sqx |x ? v tss ? { {| ? t |u ? z tsx ? t|
t |t ? w |{ ? tx |w ? t| y{ ? { {{ ? |
x |{ ? { |s ? tt {t ? ts ys ? v {s ? w
3 讨论
实验证实了刺梨在细胞层次上的降低胆固醇含
量的作用 o为刺梨降血脂新药的开发提供了基础 ∀
实验结果显示了刺梨水提物的明显降 ³¨u
细胞内胆固醇作用 o而且存在良好的量效关系 o其降
胆固醇幅度比阳性对照药 ¬³¬·²µ还大 ∀如此好的
结果 o令人产生是否存在假阳性的可能 ∀因为本
图 t 刺犁甲醇提取物 ⁄¬¤¬²±2 °us树脂不同洗脱部位
对 ³¨u细胞内胆固醇代谢的影响
实验所用胆固醇测定试剂盒 °³¯ ¬¨µ的测定原理中
涉及到氧化还原反应 o为了排除刺梨中所含抗氧化
剂对实验结果造成的影响 o通过空白试验 !培养液中
直接加入试验用药及加药培养细胞液等测定发现刺
梨提取物确实能提高胆固醇测定数值 o而且呈现极
明显的量效关系 o即随着用药量的增大所测定的胆
固醇值显著升高 ∀因此 o证明了刺梨提取物降低
³¨u细胞内胆固醇含量确实是其作用于细胞内
的胆固醇合成或者代谢的结果 o而非所用试药对测
定试剂直接影响而造成的假阳性 ∀
在肯定了刺梨水提物的降低胆固醇作用后 o进
行了系统溶剂的提取 o从所得到的正已烷 !醋酸乙
酯 !丙酮 !甲醇 !水提取物的降胆固醇效价试验中发
现 o以甲醇提取物的降胆固醇效价最高 o所以针对刺
梨甲醇提取物部分进行了更进一步的分离与纯化 ∀
考虑到刺梨中的主要有效成分偏于水溶性的 o故此
选择了 ⁄¬¤¬²± ° p us型树脂 o用不同浓度的甲醇
来进行洗脱 o得到了水 ouxh oxsh ozxh otssh甲醇
洗脱等 x个部位 ∀细胞培养试验表明 o其中以 xsh
甲醇洗脱部分的降胆固醇作用效价最高 ∀ xsh甲醇
洗脱部位的化学成分分析与鉴定正在进行中 ∀
≈参考文献
≈t 魏明山 1 刺梨果化学成分研究 ≈ 1中国野生植物 ot||to
kvl}t1
≈u 王 薇 o夏炳南 o刺梨的研究进展 ≈ 1中国药学杂志 ot||yo
vtkttl}ywv1
≈v 吴立夫 o杨履端 1刺梨汁的降血脂作用 ≈ 1贵州农学院学
报 ot||uottktl}{|1
≈w 戴尧天 o张 昭 1刺梨降低鹌鹑血脂和阻断动脉粥样硬化形成
的作用 ≈ 1营养学报 ot||wotykul}uss1
≈x 胡文尧 o白 焰 1刺梨抗动脉粥样硬化作用的研究 ≈ 1中国
药学杂志 ot||wou|k|l}xu|1
≈y 汪俊军 o刘小传 1刺梨汁对金黄地鼠的抗动脉粥样硬化作用
≈ 1中国动脉硬化杂志 oussto|ktl}tz1
≈责任编辑 刘
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第 vu卷第 u期
ussz年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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