全 文 ：¶¬½¨ ²©³²³∏¯¤·¬²±¶º¬·«²∏·¥∏¯¥¬¯¶²µ¬ª¬±¤·¨§©µ²° ¬±ª∏² × °¨³¯¨¶¬§¨ º¤¶²±¯¼ tv1uv Λ° ≅ tt1|{ Λ° ¤±§©¤µ¯ ¶¨¶·«¤± ²©¤¯¯³²³∏¯¤·¬²±¶º¬·«
¥∏¯¥¬¯¶q׫¨ ³²¯¯¨ ± ¶∏µ©¤¦¨ ²©¤¯¯³²³∏¯¤·¬²±¶¶·¬¦®¶²∏·º¬·«¶³¬±¨ ¶o√¤µ¼¬±ª¬±¶¬½¨ ¤±§§¨±¶¬·¼o·«¨ ¥¤¶¨ ¤±§·²³³¤µ·²©¶³¬±∏¯ ¶¨º¤¶§¬©©¨µ¨±·
¤°²±ª³²³∏¯¤·¬²±¶q׫¨ ³²¯¯¨ ± ªµ¤¬±¶³¤·¨µ±¶²©ª¨µ°¬±¤·¬²± ¤³¨µ·∏µ¨¶²© Π. τερνατα º¤¶ ¬¯®¨ ¼¯·² «¤√¨¦²¯³¤·¨ ¦²√ µ¨q
[ Κεψ ωορδσ] Πινελλια τερνατε ~³²³∏¯¤·¬²±¶~³²¯¯¨ ± °²µ³«²¯²ª¼~ª¨ ±¨ ·¬¦§¬√ µ¨¶¬·¼
≈责任编辑 张宁宁 
≈收稿日期  ussx2sv2us
≈基金项目  中央级科研院所科技基础性工作专项基金k≠≥2
vyx2stl
≈通讯作者  3马小军 oר¯ }kstslyu{|sy|u o∞2°¤¬¯}¬­°¤ƒ ³∏¥2
¬¯¦q¥·¤q±¨ ·q¦±
半夏不同种质资源 „ƒ°指纹系谱分析及其应用
杜 娟t o马小军u 3 o李学东t
kt1 首都师范大学 生命科学学院 o北京 tsssvz ~
u1 中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|wl
≈摘要  目的 }获得更多半夏 ⁄‘„指纹信息 o验证 „ƒ°与其他方法是否一致 o为半夏及其他中药材道地性研
究 !种质资源鉴定 !亲缘关系研究 !品种选育和引种栽培提供分子水平生物学依据 ∀方法 }选择全国 ts个主要产地
的野生或栽培半夏为材料 o采用扩增酶切片段多态性 „ƒ°方法研究 o用 ‘×≥≠≥³¦u1t软件包利用 ˜°Š„法进行
聚类分析 o构建遗传系统树 ∀结果 }筛选 tu对引物 o共扩增出 t yzv条带 ∀进行聚类分析 o结果与利用总生物碱含
量差异结果相吻合 ∀结论 }本研究所获得的特征带和缺失带体现了 „ƒ°的高特异分辨率在中药半夏品种鉴定上
的潜力 o绘制的系统进化树不同种源之间遗传关系的远近与其总生物碱含量差异趋势一致 ∀
≈关键词  半夏 ~种质资源 ~„ƒ° ~遗传关系 ~总生物碱
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussylst2ssvs2sw
半夏 Πινελιατορνατα k׫∏±¥l …µ¨¬·为天南星科半
夏属植物 o以块茎入药 ∀在我国大部分地区均有分
布 o由于产地生态环境的变化和栽培中人为选择 o半
夏的植物形态发生了较大变异 o如叶形 !珠芽 !块茎
等 o使得古方中所用道地药材出现在形态和质量方
面的变化和混淆 ∀因此 o种质鉴定和选择成为非常
迫切的问题 ∀目前对于半夏的鉴定主要是对于半夏
种间药材易混淆替代品的鉴别 o如对虎掌 Π1 πεδατι2
σεχτα ≥¦«²·!水半夏 Τψπηονιυµ φλαγελιφορµε …¯∏°¨ 以及
半夏的生药学 !化学成分 !药理 !毒性等方面的研
究≈t  ~而对于半夏的不同种质之间的比较鉴定则是
在植物的形态变异及其模糊聚类分析≈u  o由于对广
大地区品种资源之间的谱系情况并不了解 o无法以
地理渊源和表型差异来评价它们之间的亲缘关系 o
为此有必要对更广泛的半夏产地进行采样并采用
⁄‘„指纹技术对半夏进行较全面的遗传分析 o以便
为半夏的选育提供基础资料 ∀
„ƒ°k¤°³¯¬©¬¨§©µ¤ª°¨ ±·¯ ±¨ª«³²¯¼°²µ³«¬¶°o扩增
片断长度多态性l作为一种 ⁄‘„指纹新技术近年来
已被广泛用于种质资源遗传多样性研究 !作物品种
鉴定 !连续图谱构建等研究≈v2x  ∀其特异分辨率高 o
与 • „°⁄等相比 o一次扩增可获得更高的位点多态
性 ∀尚未见到这种新方法应用于半夏种质资源研究
的报道 ∀本研究应用 „ƒ°技术对不同种质半夏进
行分析 o以了解其遗传背景 ~并测量其总生物碱含
量 o验证 „ƒ°聚类分析与其他指标的一致性 o为选
育优良种质提供分子依据 ∀
1 材料
供试野生半夏品系采自全国 ts个不同产地 o样
品 t }山西新降 ~u }河南唐河 ~v }河北易县 ~w }四川南
充 ~x }四川安岳 ~y }湖北潜江 ~z }北京房山 ~{ }山东菏
泽 ~| }河南信阳 ~ts }北京密云 ∀实验所用材料是新
鲜嫩叶 s1u ª∀采用北京鼎国生物技术有限公司植
物基因组 ⁄‘„提取试剂盒及 ƒŒ≥‹2„ƒ°试剂盒 ∀
2 方法
#sv#
第 vt卷第 t期
ussy年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ t
¤±∏¤µ¼oussy
211 „ƒ°指纹图谱
21111 模板 ⁄‘„的提取 采用鼎国生物公司 ⁄‘„
提取试剂盒 ∀s1u ª组织可提取约 us Λª纯 ⁄‘„ o
s1{ h琼脂糖检测 ⁄‘„纯度 !完整性及产量 ot ˏ电
泳可见即可 ∀ ⁄‘„浓度大约为 xs ∀
21112 模板 ⁄‘„的限制性酶切与连接 在 s1x °
离心管中加入 kus ˏ体系l }w ˏ ⁄‘„ 模板 ~
„§¤³·¨t ~∞¦²•Œr¶¨ Œu ˏ~ts÷• ¤¨¦·¬²± ¥∏©©¨µu1x ˏ~
ts °°²¯#pt„×° u1x ˏ~×w ¬ª¤¶¨ t ˏ~„ƒ°2 • ¤·¨µ
z ˏ~混匀离心数秒 ovz ε 保温 x «o{ ε 保温 w «ow
ε 过夜 ∀
21113 „ƒ°预扩增反应 参考 „ƒ°试剂盒说
明 o采用不含碱基k n sl的预扩增引物 o引物序列见
表 t ∀
表 t ⁄‘„接头和 „ƒ°引物序列
⁄‘„接头和 „ƒ°引物 核苷酸序列 用途
∞¦²• Œ接头 接头 t }x.  ≤×≤ Š×„ Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤  v . 连接接头
接头 u }x.  „„× ׊Š ׄ≤ Š≤„ Š×≤ ׄ≤  v.
¶¨ Œ接头 接头 t }x.  Š„≤ Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š  v. 连接接头
接头 u }x.  ׄ≤ ×≤„ ŠŠ„ ≤×≤ „×  v
∞¦²• Œ引物
预扩引物序列 x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„  v. 预扩增
∞2t x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„„ ≤ 选择性扩增
∞2u x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„≤ „
∞2v x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„„ Š
∞2w x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„≤ ×
∞2x x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„≤ ≤
∞2y x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„≤ Š
∞2z x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„Š ≤
∞2{ x.  Š„≤ ׊≤ Š×„ ≤≤„ „×× ≤„Š Š
¶¨ Œ引物
预扩引物序列 x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤  v. 预扩增
2t x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤„ „ 选择性扩增
2u x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤„ ≤
2v x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤„ Š
2w x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤„ ×
2x x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤× „
2y x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤× ≤
2z x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤× Š
2{ x.  Š„× Š„Š ×≤≤ ׊„ Š×„ „≤× ×
21114 „ƒ°选择性扩增反应 采用 v n v引物组
合 }∞¦²• Œ和 ¶¨ Œ选择性扩增引物均含 v个选择性
碱基 ∀用 „ƒ°2×∞将预扩增产物按 tΒus稀释 o作为
选扩模板 ∀按下列参数 °≤• 循环k采用梯度 °≤•
法l ∀预变性 |w ε u °¬±~第一轮扩增参数 }|w ε vs
¶oyx ε vs ¶ozu ε {s ¶~以后每轮循环退火温度递
减 s1z ε o扩增 tu轮 ∀接着按下列参数扩增 uv轮 }
|w ε vs ¶oxx ε vs ¶ozu ε {s ¶~延伸加时 zu ε x
°¬±∀t ˏ°≤• 产物 n t ˏ内标 n t ˏ变性液 o|x
ε u °¬±o冰浴 o准备上样 ∀
21115 扩增产物的凝胶电泳分析 利用 „…Œ vzz
测序仪进行 „ƒ°多态性分析 o用注射器吹打加样
孔 o预电泳 v °¬±后点击 °¤∏¶¨ 键暂停测序仪 o设置
后开始电泳 ∀电泳时间 w «∀用 ‘×≥≠≥³¦u1t软件
包进行结果分析 o片段大小 o根据内标软件识别 ∀
212 总生物碱测定
按照文献≈y 中的测量方法 ∀
21211 样品制备 各种源半夏随机取样 ts株 o去
外皮 ys ε 干燥后 ys目过筛 o得干燥粉末 ∀
21212 总生物碱含量测定 将不同种源的半夏分
别称取 o按样品制备方法分别制备样品供试液及空
白对照液 o在 wt{ ±°处分别测定其吸收度 o并按以
下公式计算含量 }Ξ( %) € ( Χ≅ tsp y)/ ( Ω ≅稀释因
子) ≅ tss% , Χ€ (Αp s1suw x)/ s1txz y , Ω €样品质
量kªl o稀释因子 € trux ≅ trts ∀
3 结果与分析
311 „ƒ°指纹图谱
31111 模板 ⁄‘„ 的制备 植物基因组 ⁄‘„ 提取
#tv#
第 vt卷第 t期
ussy年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ t
¤±∏¤µ¼oussy
试剂盒 o速度快 o条带清晰 o无污染 o无 • ‘„污染 o纯
度较高能满足 „ƒ°分析的要求 o结果如图 t ∀
图 t 半夏基因组 ⁄‘„
31112 引物筛选结果 取半夏基因组 ⁄‘„ o利用
∞¦²• Œr¶¨ Œ双酶切筛选引物 o结果条带清晰 o片段
大小在 vx ∗ t zxs ¥³o符合 „ƒ°分析对酶切片段大
小的要求 o数量合适 o分布均匀 o证明该组引物适于
半夏的 „ƒ°分析 ∀见图 u ∀
图 u 引物筛选
31113 „ƒ°扩增结果 采用 tu对 „ƒ°引物组合
扩增出可辨认带k有效标记l共 t yzv条 o其中特异
带 tyx条 o特异缺失带 t|条 o特异百分率是 tt1s h ∀
总位点数 wts个 o其中共有位点 zw个 o多态位点百
分率 {u1s h ∀其中 x对引物多态性高 o区分能力强 o
鉴别率为 tss h o可用于进行半夏药材真实性和道
地性检测以及进一步的分子标记研究 o有较高的应
用价值 ∀
31114 „ƒ° 分析 选 ∞2„≤„r2≤„Š 引物对扩
增 o可获得清晰的 ⁄‘„ 指纹图谱 o所获得的片段在
所用引物对中最多 o扩增结果见图 v ∀共获得 uuy条
⁄‘„扩增带 o总位点 {s个 o其中多态性位点 v{个 o
占 wz1x h ∀每一个种源都有特异性条带或特异性
缺失条带与其他种源相区分 o这些带可作为识别不
同种源半夏的基因型鉴定的依据 ∀
31115 半夏的遗传距离及指纹图谱树状图的构建
使用 ‘×≥≠≥³¦k∂ µ¨¶¬²± u1tl分析软件对所获数据
进行分析 o条带记为 t o条带缺失记为 s o利用 ˜°Š2
 „方法进行聚类分析 o得到 „ƒ°指纹图谱的分析
树状图k图 wl ∀绘制的系统进化树表明不同种源半
夏之间遗传距离为 s1wwv ∗ s1yxw o四川南充与河南
信阳的半夏之间的相似性系数最高为 s1yxw ~各种
源半夏之间的遗传距离 s1vwy ∗ s1xxz ∀
图 v ∞2„≤„r2≤„Š引物对扩增结果
图 w 半夏的指纹图谱数值分析树状图
312 不同种源半夏总生物碱含量
表 u中数据显示不同产地生物碱含量变化范围
很大 o经方差分析达到极显著水平k Φ € w{1uwv 
Φs1stl ∀
表 u 生物碱含量测定k ν € vl
样品 含量r h Φ
t s1svt { s1suz y
u s1svx u s1su{ y
v s1sy{ x s1svt |
w s1sxy w s1svv t
x s1s|| y s1svx w
y s1s{z { s1suz |
z s1su{ | s1stt u
{ s1suu { s1stu x
| s1svz w s1stx v
ts s1suv v s1stt y
4 讨论
411 本研究中 ts个种源半夏 „ƒ°聚类分析图表
明 }河南唐河 !河北易县 !四川南充 !河南信阳 !湖北
潜江 !四川安岳的半夏之间的遗传相似性很高 o分在
同一组 o这一组中除河南唐河半夏外总生物碱含量
都很高ks1sxy w h ∗ s1s|| y h l o这说明在指纹图谱
上遗传距离越近 o反映在质量性状上越相似 o不同的
分析手段得到了相同的结果 o相互印证 ∀
#uv#
第 vt卷第 t期
ussy年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ t
¤±∏¤µ¼oussy
412 从 tu对引物筛选实验发现 o不同 „ƒ°引物扩
增带型 !扩增带数量和分布均匀程度差异很大 o多态
性和区分能力也不同 ∀因此 o必须进行引物筛选 o其
中 x对引物多态性高 o区分能力强 o鉴别率为 tss h o
可用于进行半夏药材真实性和道地性检测以及进一
步的分子标记研究 o有较高的应用价值 o如有望克隆
出控制其生物碱含量基因 !抗旱基因 !控制产量的基
因等等 ~将各基因型的特征带分离并转化为 ≥×≥k≥¨ 2
∏´¨ ±¦¨ ·¤ªª¨§¶¬·¨l标记后 o有利于提高半夏基因型检
测的效率 o为进一步研究半夏如 }毒性基因的敲除 !
增产 !转基因培育优良品系等提供基础资料 ∀对半
夏进行 „ƒ°分析确立指纹图谱 o将有助于从分子
生物学角度准确识别半夏种源 o有效利用半夏种源
优势 o进一步开发其栽培价值 o促进道地中药现代化
发展 ∀
笔者同时对不同种源半夏的染色体进行研究 o
发现不同种源半夏间染色体数目及倍性差异都很
大 o进一步说明半夏遗传多样性十分丰富 ~同一种源
半夏的不同植株之间染色体倍性也很可能存在差
异 o弄清这些问题 o有待于对半夏染色体及其指纹图
谱进一步深入研究 ∀
≈参考文献 
≈t  魏淑红 o彭正松 q半夏类药材研究概况 q中药材 oussv ouy
kttl }{u{ q
≈u  郭巧生 o贺善安 q半夏种内居群形态变异的模糊聚类分析 q植
物资源与环境 ot||z oykvl }u| q
≈v  ∞½¬² °²µ·¬¶o „¯ ¥¨µ·² „¦´∏¤§µ²o≤¬±½¬¤ ≤²°¬±²o ετ αλ. ∞©©¨¦·²©©¤µ°2
µ¨¶. ¶¨ §¨¶¨¯¨ ¦·¬²±²± ª¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²±²©¤ ¤¯±§µ¤¦¨ ³²³∏¯¤·¬²±²©³¨ ³2
³¨µk Χαπσιχυµ αννυυµ ql oªµ²º± ¬± ‘²µ·«2 • ¶¨·Œ·¤¯¼ q Γενετ Ρεσ
Χροπ Εϖο , ussw oxt }x{t q
≈w  田松杰 o石云素 o宋燕春 o等 q利用 „ƒ°技术研究玉米及其
野生近源种的遗传关系 q作物学报 oussw ovskwl }vxw q
≈x  马小军 o汪小全 o肖培根 o等 q人参农家类型的 „ƒ°指纹研
究 q中国中药杂志 ousss ouxktul }zsz q
≈y  曾建红 o彭正松 o宋经元 o等 q半夏总生物碱含量的动态变化 q
中药材 oussw ouzkzl }wzt q
ΑΦΛΠφινγερπριντινγ οφ Πινελλια τερνατα ανδ ιτσ αππλιχατιον
⁄˜ ∏¤±t o  „ ÷¬¤²2­∏±u oŒ ÷∏¨2§²±ªt
(t1 Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχεσ , Χαπιταλ Νορµαλ Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ tsssvz , Χηινα ;
u1 Ινστιτυτε οφ Μεδιχιναλ πλαντ , Χηινεσε Αχαδεµψ οφ Μεδιχαλ Σχιενχεσ ανδ Πεκινγ Υνιον Μεδιχαλ Χολλεγε , Βειϕινγ tsss|w , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ²¥·¤¬± °²µ¨ ¬±©²µ°¤·¬²± ²± ⁄‘„ ©¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ª¶¤±§·²¦²±©¬µ°·«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¶²©·¨± º¬§¨ ³²³∏¯¤2
·¬²±¶²© Πινελλιατορνατα q Μετηοδ : ≤²¯¯¨ ¦·º¬§¨2·¼³¨ ²µ¦∏¯·¬√¤·¨§ Π. τορνατα©µ²°·¨± °¤­²µ³µ²§∏¦·¬²± ¤µ¨¤¶±¤·¬²±2º¬§¨ ¤¶°¤·¨µ¬¤¯ q׺¨¯√¨
¦²°¥¬±¤·¬²±¶²©∞¦²• Œ¤±§ ¶¨ Œ³µ¬° µ¨¶º µ¨¨ ∏¶¨§·²¤¶¶¨¶§¬√ µ¨ª¨ ±¦¨ ¤°²±ª·¨± ³²³∏¯¤·¬²±¶q׫¨ §¤·¤º µ¨¨ ¤±¤¯¼½¨ §∏¶¬±ª∏±º ¬¨ª«·¨§³¤¬µ2
ªµ²∏³ ° ·¨«²§o¥¤¶¨§²± ¤µ¬·«° ·¨¬¦¤√ µ¨¤ª¨¶k˜°Š„l ¥²²·¶·µ¤³¤±¤¯¼¶¬¶q≤¯ ∏¶·¨µ¤±¤¯¼¶¨¶º µ¨¨ ³¨µ©²µ° §¨¥¼ ∏¶¬±ª‘×≥≠≥³¦¶²©·º¤µ¨ √ µ¨¶¬²±
u1t q׫¨ ¤¯®¤¯²¬§º¤¶ ¬¨·µ¤¦·¨§©µ²° Π. τερνατε º¬·«¦«¯²µ²¯©²µ° ¤±§§¨·¨µ°¬±¨ §¬± ˜∂ ¤¥¶²µ³·¬²±¶³¨¦·µ²¶¦²³qΡεσυλτ : t yzv ¥¤±§¶º µ¨¨ ¤³2
³¯¬¨§º¬·«tu ¦²°¥¬±¤·¬²±¶q ׫¨ ¶¨ µ¨¶∏¯·¶²© ¦¯∏¶·¨µº µ¨¨ ¦²±ªµ∏¨±·º¬·«§¬©©¨µ¨±¦¨¶¬±·²·¤¯ ¤¯®¯²¬§¶q Χονχλυσιον } ׫¨ µ¨¶∏¯·¶²©·«¨ ¶·∏§¼
¶«²º §¨¤³²·¨±·¬¤¯ ¤³³¯¬¦¤·¬²± ²© „ƒ° ©¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ª©²µ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²© Π. τερνατα q
[ Κεψ ωορδσ] Πινελλια τερνατα ~¦¯∏¶·¨µ¶¨µ¬¨¶~„ƒ° ©¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ª~ª¨ ±¨ ·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³~·²·¤¯ ¤¯®¯²¬§¶
≈责任编辑 张宁宁 
5中国中药杂志6荣获中华人民共和国新闻出版署
组织的第三届国家期刊奖百种重点期刊
#vv#
第 vt卷第 t期
ussy年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ t
¤±∏¤µ¼oussy