全 文 ：ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｓＭｅｔｈｏｄ：ＡｆｔｅｒｔｈｅｔｏｔａｌＤＮＡｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ，ＣｖｅｒｎｕｓｗａｎｄＣｖｅｒｎｕｓｐｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｔｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｍ
ｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲｗｉｔｈｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒｏｆＩＴＳａｎｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌｏｎｉｎｇＴｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣｈｒｙｓ
ａｎｔｈｅｍｕｍｃｈａｎｅｔｉ，Ｎｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ，ＺｅａｍａｙｓａｎｄＧａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋＲｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅＩＴＳｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ，ＣｖｅｒｎｕｓｗａｎｄＣｖｅｒｎｕｓｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＩＴＳ１ｒＤＮＡ，５８ＳｒＤＮＡ，ＩＴＳ２ｒＤＮＡｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄＴｈｅＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｗａｓＤＱ０９４１８５，ＤＱ２２４３６３ａｎｄＤＱ２２４３６４ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＣｓａｔｉｖｕｓａｎｄｔｈｅｔｗｏ
ｇａｒｄｅｎｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｖｅｒｎｕｓｗａｓａｂｏｖｅ９１％；ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｔｙｗａｓ９９８４％ ｂｅｔｗｅｅｎＣｖｅｒｎｕｓｗａｎｄＣｖｅｒｎｕｓｐＴｈｅｒａｎｇｅｏｆｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｂｅｔｗｅｅｎＣｓａｔｉｖｕｓａｎｄｏｔｈｅｒｈｅｒｂｓｗａｓａｂｏｖｅ４６％ ｂａｓｅｄｏｎＩＴＳ１ａｎｄａｂｏｖｅ４１％ ｂａｓｅｄｏｎＩＴＳ２Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃｓａｔｉｖｕｓｃａｎｂｅｄｉｓｔｉｎ
ｇｕｉｓｈｅｄｆｒｏｍｍｉｓｕｓｅｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓｂｙｔｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅＴｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓａｎａｖａｉｌａｂｌｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣ
ｓａｔｉｖｕｓ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ；ＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｃｈｉｎｅｓｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
［责任编辑 张宁宁］
不同来源莲 ｒＤＮＡＩＴＳ的 ＰＣＲ扩增、克隆及序列分析
林 珊１，２，郑伟文２，吴锦忠１，周莉娟２，宋亚娜２
（１福建中医学院 药学系，福建 福州 ３５０００３；
２福建省农业科学院 生物技术研究所，福建 福州 ３５０００３）
［摘要］ 目的：通过分析不同来源莲的ＩＴＳ序列，为莲的鉴别提供 ＤＮＡ分子标记。方法：利用特异性引物进
行ＰＣＲ扩增和克隆、测序技术对莲的ｒＤＮＡＩＴＳ区间碱基序列进行测定，比较其差异。结果：得到参试的１１个莲栽
培品种的ｒＤＮＡ的ＩＴＳ及５８ＳｒＤＮＡ全序列，１８Ｓ和２６ＳｒＤＮＡ部分序列，共约７５０ｂｐ。显示了不同产地、不同栽培
品种莲的ｒＤＮＡＩＴＳ的差异。结论：本研究为利用ＩＴＳ区序列差异，鉴别不同来源的莲提供了依据，此法可用于莲种
间及真伪品鉴别。
［关键词］ 分子鉴定；莲；ＩＴＳ序列；序列分析
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）０８０６７１０５
［收稿日期］ ２００６０４０７
［基金项目］ 福建省科技重大项目（２００２Ｙ００６）；福建省科技项
目（２００４Ｙ００７，２００１Ｚ０２６）
［通讯作者］ 郑伟文，Ｅｍａｉｌ：ｂｃｆａａｓ０１＠ｈｏｔｍａｉｌｃｏｍ
莲ＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａＧａｅｒｔｎ为睡莲科多年生大
型水生草本植物，经过长期的人工繁育，莲已形成了
籽莲、花莲和藕莲三大品系，种质资源相当丰富。莲
的分布较广，且栽培历史悠久，形成较多的栽培品
种。道地品种有湖南的湘莲、江西的赣莲、福建的建
莲和浙江的宣莲。随着种质资源的开发利用，不同
栽培品种莲的道地产区除栽培本地的传统品种外，
还有新培育品种如杂交莲和太空莲等。众多栽培品
种的混合种植，势必会影响莲的道地性和质量稳定
性。另外，莲的栽培品种中大多数的表型性状易受
环境影响，因此，以形态特征为基础的种质资源鉴定
的准确性已受到质疑。
近年来，分子标记技术和ＤＮＡ指纹分析技术的
迅猛发展及其在农作物种质鉴定上的广泛应用，为
揭示药用植物的遗传差异和鉴定中药材品种的道地
性提供了新的方法和手段，其中核糖体 ＤＮＡ（即
ｎｒＤＮＡ）ＩＴＳ区（包括 ＩＴＳ１，５８Ｓ和 ＩＴＳ２）序列已
被广泛的用于植物属内、近缘属间等的系统发育分
析［１５］。许多学者应用分子生物学方法对莲进行研
究，如 ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰ，ＩＳＳＲ，ＦＩＳＨ等技术［６９］。在 ＩＴＳ
序列方面，有刘艳玲等对睡莲类植物 ＩＴＳ序列分子
系统发育的研究［１０１２］，但并未对序列差异进行分
析。本研究对不同来源的１１个莲品种，采用 ＰＣＲ
扩增以及测序技术进行了 ｒＤＮＡＩＴＳ区序列的测定
与分析，从分子水平比较了不同地区莲的差异，为莲
的种质资源道地性的鉴定、质量控制以及莲的 ＧＡＰ
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实施提供了科学依据。
１ 材料和方法
１１ 材料
１１个莲供试品种见表１。其中１０个品种来源
于福建省建瓯市吉阳镇福建地道药材莲子 ＧＡＰ栽
培示范基地，只有１个品种观赏莲来源于福建农林
大学。由福建省建瓯市吉阳镇农业技术推广站葛培
盛高级农艺师鉴定。取样时，切取未完全展开的箭
状幼叶，置于塑料袋中，排去多余的空气后密封，带
回实验室备用。
表１ 不同来源的莲样品
序号 样品编号 样品名称
１
２
３
４
５
６
７
８
９
１０
１１
ＨＢ
ＨＮ
Ｊ
ＴＫ３６
ＴＫ３
ＧＳ
Ｚ３
Ｚ８
Ｚ６
Ｇ
ＨＰ
湖北芙蓉莲
湖南芙蓉莲
建莲
太空莲３６号
太空莲３号
观赏莲
杂交莲３６３号
杂交莲８２３６号
杂交莲６２３６号
赣莲６２号
花牌莲
１２ 方法
１２１ 总 ＤＮＡ的提取 总 ＤＮＡ的提取采用 ＰＶＰ
法。取新鲜叶片０２ｇ，加入１ｍＬＰＶＰ提取缓冲液
（０４ｍｏｌ·Ｌ－１葡萄糖，３％可溶性ＰＶＰ，临用前加入
００１ｍｏｌ·Ｌ－１β巯基乙醇），匀浆后，倒入２ｍＬ离
心管中，４℃下１万 ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ；弃上清，
重悬于１ｍＬ提取缓冲液，以同样条件离心１０ｍｉｎ；
加入１ｍＬ经６５℃预热的裂解缓冲液（０１ｍｏｌ·
Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８０，００２ｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ，０５ｍｏｌ
·Ｌ－１ ＮａＣｌ，１５％ＳＤＳ）悬浮沉淀，６５℃水浴
３０～６０ｍｉｎ，并不时轻轻摇动；加入１ｍＬ氯仿异戊
醇乙醇（２０∶１∶４）溶液，室温下静置１０ｍｉｎ，４℃下１
万 ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ；将上清液移到新的２ｍＬ离
心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置 １０
ｍｉｎ，此时出现絮状 ＤＮＡ；用灭菌的牙签挑出 ＤＮＡ
絮团，转入含０５ｍＬＴＥ缓冲液的１５ｍＬ离心管
中；加入ＲＮａｓｅ（无ＤＮａｓｅ）酶液至质量浓度为１０μｇ
·ｍＬ－１，３７℃处理１０ｍｉｎ。加入等体积的酚氯仿
溶液，轻轻混匀，在室温下静置１０ｍｉｎ，４℃１２万 ｒ
·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ；将上清液移入新的离心管中，
加入１／１０体积的３ｍｏｌ·Ｌ－１醋酸钠（ｐＨ５２）溶液，
混匀后加入２倍体积的冰浴的无水乙醇，颠倒混匀，
－２０℃放置３０ｍｉｎ，ＤＮＡ形成絮状沉淀；挑出 ＤＮＡ
絮团，在７０％乙醇中漂洗，无菌滤纸上吸干，重新溶
解于５０μＬＴＥ缓冲液中，－２０℃保存。
１２２ 引物设计 根据人参属１８Ｓ２６ＳｒＤＮＡ［１１，１２］
序列设计扩增引物：Ｃ１：５′ＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＣＴ
３′，Ｃ２：５′ＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧ３′。
１２３ ＩＴＳ区的扩增与纯化
１２３１ ＰＣＲ扩增 引物采用Ｃ１，Ｃ２；扩增程序为
９４℃预变性４ｍｉｎ，然后进入如下循环：９４℃变性１
ｍｉｎ，５０℃退火 ２ｍｉｎ，７２℃延伸 ２ｍｉｎ，２５个循环
后，７２℃延伸 １０ｍｉｎ；ＰＣＲ反应体系总体积为 ２５
μＬ，其中包含：ＤＮＡ模板 １０μＬ，ｄＮＴＰ２０μＬ，
１０×ｂｕｆｅｒ２５μＬ，引物１０μＬ，Ｔａｑ酶０５μＬ。最
后用含ＥＢ的１５％琼脂糖凝胶 ＡｇａｒｏｓｅＩＡ（购自上
海生工生物工程有限公司）电泳检测扩增结果，在
ＧｅｌＤｏｃ２０００凝胶成像系统（ＢｉｏＲａｄ）上观察并贮存
图像。
１２３２ ＰＣＲ扩增产物的纯化 将扩增的 ＤＮＡ
ＩＴＳ片段按Ｏｍｅｇａ公司纯化试剂盒提供的方法进行
纯化。
１２４ ＰＣＲ扩增产物的直接测序 纯化后的１８Ｓ
２６ＳｒＤＮＡ基因及其间隔序列片段由厦门泰京生物技
术公司测序。
１２５ ＰＣＲ扩增产物的克隆
１２５１ 重组、转化、克隆及鉴定 取适量 ＰＣＲ扩
增的ＤＮＡ加人ｐＭＤ１８Ｔ载体与连接液，１６℃反应
１５ｈ并且连接过夜。取上述连接产物转化入新鲜
制备的感受态菌株 ＤＨ５α，培养过夜后挑取白色菌
落培养，少量提取质粒。重组质粒的提取采用改良
碱裂解法进行，提取的重组质粒分别进行质粒电泳
分析鉴定以及 ＥｃｏＲＩ和 ＰｓｔＩ（购自 Ｐｒｏｍｅｇａ公司）
双酶切鉴定。
１２５２ 克隆测序 将莲１８Ｓ２６ＳｒＤＮＡ基因及其
间隔序列的克隆阳性转菌液寄往厦门泰京生物有限
公司进行测序。
２ 结果
２１ ＤＮＡ提取
从１１份样品提取的 ＤＮＡ经１５％的琼脂糖凝
胶电泳，均得到一条大于４５００ｂｐ的条带（图１）。
２２ ＰＣＲ扩增产物
用引物Ｃ１，Ｃ２进行ＰＣＲ扩增，均得到约８００ｂｐ
的ｎｒＤＮＡ的扩增产物（图２）。
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图１ ＤＮＡ提取物电泳图谱
１～１１样品；ＭＤＮＡＭａｒｋｅｒ（图２～４同）
图２ ＰＣＲ产物电泳图谱
２３ ＰＣＲ扩增产物的克隆鉴定
通过蓝白斑筛选初步鉴定出转化子。测序前通
过提取质粒 ＤＮＡ和双酶切，进一步确定转化的效
果。
本实验所用的连接载体为２６９２ｂｐ，目的片断
约为８００ｂｐ，所以连接后的载体应为３４９２ｂｐ。重
组质粒的电泳图谱表明，有大于 ３０００ｂｐ的条带
（图 ３），初步说明目的片断已经转入大肠杆菌
ＤＨ５α中。ＥｃｏＲＩ和 ＰｓｔＩ双酶切重组质粒的电泳
图谱出现小于３０００ｂｐ和８００ｂｐ左右的酶切条带
（图４），进一步说明目的片断已经转入到大肠杆菌
ＤＨ５α中。
图３ 重组质粒鉴定图
图４ 重组质粒的ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ双酶切鉴定图
２４ ＤＮＡ序列
２４１ ＤＮＡ序列结果 用 ＰＣＲ扩增的 ＤＮＡ片段
直接进行测序，虽然能便捷地从样品中得到ＤＮＡ序
列的信息，但是用 ｓｅｑｔｏｏｌｓ８２软件查找不到引物序
列。因此为保证测序的准确性，最后采用克隆测序
的方法。将所测得的莲１８Ｓ２６ＳｒＤＮＡ序列输入到
ＮＣＢＩ上的Ｇｅｎｂａｎｋ中用Ｂｌａｓｔｎ进行比对，发现供试
的１１个莲样品与已登录的莲种的１８Ｓ２６ＳｒＤＮＡ序
列具有高度的同源性，并且界定出莲样品的 １８Ｓ
ｒＲＮＡ２６ＳｒＲＮＡ基因及其间隔序列各部分的序列。
用ＤＮＡＭＡＮ５２软件对不同来源的莲样品（表１）进
行对位排列，然后人工比对，并构建系统发生树（图
５）。
图５ 不同来源莲的ＩＴＳ１，５８ＳｒＤＮＡ和
ＩＴＳ２序列构建的系统发育树
２４２ 碱基序列大小 共测得１１个莲样品ＩＴＳ１，
５８ＳｒＤＮＡ和ＩＴＳ２全序列，１８ＳｒＤＮＡ基因３′端和
２６ＳｒＤＮＡ基因５′端部分碱基序列，共约７５０ｂｐ。其
中ＩＴＳ１约为２７４ｂｐ，５８ＳｒＤＮＡ约为１６２ｂｐ，ＩＴＳ２
约为２７０ｂｐ。
３ 讨论
３１ 序列结果分析 由序列的结果可知，所有参试
的样品，在 ＩＴＳ１，５８Ｓ，ＩＴＳ２区上都有碱基序列的
差异，序列信息位点较为丰富，不同品种的莲均有特
异性的变异位点。ＩＴＳ１区的变异位点有 ｌ１个，
５８ＳｒＤＮＡ区有７个，ＩＴＳ２区有１３个。碱基的变
异类型有ＴＣ转换，ＡＧ转换以及碱基的缺失（以上
碱基位置的标序以建莲１８２６ＳｒＤＮＡ为准，从１至
７５０ｂｐ）。Ｊ，ＧＳ，ＨＢ，Ｚ３，Ｚ６，ＨＰ，ＴＫ３在序列结果中
分别在第４７５位、第６２７位、第６９３位、第４４６位、第
４４２位、第９９位、第５３位碱基，与其他１０个样品有
差异。Ｇ和 ＨＮ序列比较一致，碱基差异存在于
ＩＴＳ１和ＩＴＳ２中。ＴＫ３６和 Ｚ３序列比较一致，碱基
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差异存在于５８Ｓ和 ＩＴＳ２中。Ｚ８和 ＨＢ序列比较
一致，碱基差异存在于ＩＴＳ２中。
序列结果表明不同地区莲的ＩＴＳ区序列有一定
的差异，所以莲样品的 ＩＴＳ区序列即其 ＩＴＳ及５８Ｓ
ｒＤＮＡ的序列分析资料可为莲的品种鉴别及分类提
供新的手段，所得的 ＩＴＳ区序列为莲的分子标记的
确定提供了依据，说明核糖体 ＤＮＡＩＴＳ区序列用于
莲的分子鉴定是可行的。
３２ 系统发生树分析 采用ＤＮＡＭＡＮ软件进行系
统发育分析表明，来自不同地区的莲样品同源性均
在９８％以上。说明不同分布区（来源）的莲间只有
个别碱基的差异，来自同一地区的样品并不一定聚
类于同一组，而来自不同地区的样品则可能属于同
一组。这种变异可能只是种内变异。系统发生树上
看花莲ＧＳ与其他籽莲没有聚在一类，而在籽莲之
间，来自同一地区福建的样品即 Ｊ与 ＴＫ３，Ｚ６，Ｚ８与
ＴＫ３６，Ｚ３与ＨＰ并不处于同一组；而来自不同地区
的样品即Ｊ，ＨＮ，Ｇ也能处于一组。这可能是由于处
于同一分布区（或栽培区域）的莲样品可能是从不
同地区引种来的；而不同分布区（或栽培区域）的莲
样品可能是由同一种莲的原产地引种而来的。本试
验选用栽培种来源于湖南、湖北、江西、福建等地，为
当地莲子长期种植的主要栽培种。由于对资源的人
为干预，或经过长期的人工驯化、加上环境因素的
作用，某一栽培区域的莲的基因型发生变化（如某
个位点的突变）的可能性也不能排除。
３３ 不同来源莲的ＩＴＳ区序列的意义 近年来，随
着分子生物学技术的发展，植物ＤＮＡ序列由于进化
速率上的差异被广泛用于不同分类阶元的系统发育
研究［１３１６］。其中核糖体ＤＮＡＩＴＳ区中ＩＴＳ因其基因
片段短，扩增和测序容易而越来越广泛的用于分类学
研究，而其在被子植物中既有核苷酸序列的高度变异
又有长度上的保守性，也使其序列很容易在近缘类群
间排序，另外其丰富的变异还可在较低的分类阶元
（属间、种间及种下等级）解决植物系统发育问题。
中药材有许多同一类群植物，其外形很相似，药
效却大不相同，而实际鉴定比较困难，分子遗传标记
技术的应用是解决此类难题的很好途径。ＤＮＡ序列
分析技术通过比较ＤＮＡ分子中４种碱基序列排列的
变化，反映生物体在遗传上的变异，直观性强，重现性
好。其中ＩＴＳ区由于其进化速度较快，碱基变异大，
通过比较该段序列，可以很容易地鉴别其真伪。可将
本研究序列结果用于中药莲子的品种鉴定，通过ＩＴＳ
的序列比较，可准确、迅速鉴别莲子的品种。尤其是
在一些中药资源管理不规范、品种来源不清的地区，
ＩＴＳ分析技术可以从分子水平上理清其遗传背景，克
服由于品种混杂导致产量品质下降和种质退化等问
题，指导中药材的资源管理和栽培利用。
［参考文献］
［１］ ＳｔｅｎｓｒｕｄＯ，ＨｙｗｅｌＪｏｎｅｓＮＬ，ＳｃｈｕｍａｃｈｅｒＴＴｏｗａｒｄｓａｐｈｙｌｏｇｅ
ｎｅｔｉｃｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓ：ＩＴＳｎｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｃｏｎ
ｆｉｒｍｄｉｖｅｒｇｅｎｔｌｉｎｅａｇｅｓａｎｄｐａｒａｐｈｙｌｙ［Ｊ］．ＭｙｃｏｌＲｅｓ，２００５，１０９
（１）：４１．
［２］ ＷａｎｇＣＺ，ＬｉＰ，ＤｉｎｇＪＹ，ｅｔａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｒｉｔｉｌａｒｉａｐａｌ
ｌｉｄｉｆｌｏｒａｕｓｉｎｇｄｉａｇｎｏｓｔｉｃＰＣＲａｎｄＰＣＲＲＦＬＰｂａｓｅｄｏｎｎｕｃｌｅａｒｒｉ
ｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］Ｐｌａｎｔａ
Ｍｅｄ，２００５，７１（４）：３８４
［３］ 蔡金娜，周亚开，徐珞珊，等中国不同地区蛇床的 ｒＤＮＡＩＴＳ
序列分析［Ｊ］药学学报，２０００，３５（１）：５６．
［４］ 诸葛强，丁雨龙，续 晨，等广义青竹属（Ａｒｕｎｄｉｎａｒｉａ）核糖体
ＤＮＡＩＴＳ序列及亲属关系研究［Ｊ］遗传学报，２００４，３１（４）：
３４９
［５］ 王建波，张文驹，陈家宽，等．核 ｒＤＮＡ的 ＩＴＳ序列在被子植物
系统与进化研究中的应用［Ｊ］．植物分类学报，１９９９，３７（２）：
４０７．
［６］ 汪 岚，韩延闯，彭欲率，等ＩＳＳＲ标记技术在莲藕遗传研究
中的运用［Ｊ］氨基酸和生物资源，２００４，２６（３）：２０
［７］ 韩延闯，周 立，滕彩珠，等莲藕品种ＤＮＡ多态性的初步研
究［Ｊ］分子植物育种，２００４，２（３）：３８０
［８］ 刁 英莲藕染色体上荧光原位杂交方法的初探［Ｊ］氨基酸
杂志，２００４，２６（２）：２３
［９］ 彭欲率，韩延闯，汪 岚，等应用ＡＦＬＰ技术检测莲藕遗传多
样性的初步研究［Ｊ］分子植物育种，２００４，２（６）：８２３
［１０］ 刘艳玲，徐立铭，倪学明，等基于 ＩＴＳ序列探讨睡莲属植物
的系统发育［Ｊ］武汉大学学报（理学版），２００５，５１（２）：２５８
［１１］ ＷｅｎＪ，ＺｉｍｍｅｒＥＰｈｙｌｏｇｅｎｙａｎｄｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｏｆＰａｎａｘＬ（ｔｈｅ
Ｇｉｎｓｅｎｇｇｅｎｕｓ，Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）：ｉｎｆｅｒｅｎｃｅｓｆｒｏｍＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｎｕ
ｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ［Ｊ］ＭｏｌＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔＥｖｏｌ，１９９６，６：１６６．
［１２］ 唐先华，张晓艳，施苏华，等睡莲类植物 ＩＴＳｎｒＤＮＡ序列的
分子系统发育分析［Ｊ］地球科学———中国地质大学学报，
２００３，２８（１）：９７
［１３］ 郝明干，刘忠权，王加连ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析在中药材白花
蛇舌草鉴定中的应用［Ｊ］安徽师范大学学报（自然科学版），
２００４，２７（２）：１８８．
［１４］ 余永邦，秦民坚，梁之桃，等不同产区太子参的ｒＤＮＡＩＴＳ区
序列的比较［Ｊ］植物资源与环境学报，２００３，１２（４）：１．
［１５］ 王淑美，梁生旺，周开亚，等 牛膝的 ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析
［Ｊ］．中草药，２００４，３５（５）：５５９．
［１６］ 马玉花，杨吉安，贾万忠，等中国不同地区杜仲ｒＤＮＡ的ＩＴＳ
序列分析［Ｊ］西北林学院学报，２００４，１９（４）：１６．
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ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７
ＰＣＲ，ｃｌｏｎｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒＤＮＡＩＴＳｏｆＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａｆｒｏｍ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｏｒｉｇｉｎｓｉｎＣｈｉｎａ
ＬＩＮＳｈａｎ１，２，ＺＨＥＮＧＷｅｉｗｅｎ２，ＷＵＪｉｎｚｈｏｎｇ１，ＺＨＯＵＬｉｊｕａｎ２，ＳＯＮＧＹａｎａ２
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＦｕｊｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦｕｊｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｐｒｏｖｉｄｅＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａｂｙｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆ
ｎｒＤＮＡＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＮｎｕｃｉｆｅｒａｏｒｉｇｉｎａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｆｅｒｅｎｔｈａｂｉｔａｔｓＭｅｔｈｏｄ：ＴｏｃｏｍｐａｒｅｎｒＤＮＡＩＴＳｂａｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅｕｓｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃ
ＰＣＲＩＴＳＲｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＩＴＳａｎｄ５８ＳｒＤＮＡ，ａｎｄｔｈｅｐａｒｔｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１８ＳｒＤＮＡａｎｄ２６ＳｒＤＮＡ，ｔｏｔａｌｙ７５０
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｎｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ；ＩＴＳｒｅｇｉｏｎ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ
［责任编辑 张宁宁］
吡虫啉在麻黄中残留的分析方法
陈美艳，陈 君，薛 健，于 晶，程惠珍
（中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 １０００９４）
［摘要］ 目的：研究建立吡虫啉在麻黄中残留的液相分析方法。方法：样品经二氯甲烷提取，色谱柱净化，采
用十八烷基键合硅胶柱，流动相为甲醇水（２０∶８０）；检测波长２７０ｎｍ。结果与结论：该方法的最小检出量为０４×
１０－９ｇ，最低检出质量分数为００２ｍｇ·ｋｇ－１，平均回收率为８５３７％ ～９０６５％，ＲＳＤ为２２３％ ～３４５％；该方法的
灵敏度、精密度和准确度符合农药残留分析的要求。
［关键词］ 高效液相色谱法；吡虫啉；麻黄；残留
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）０８０６７５０３
［收稿日期］ ２００６０１１９
［基金项目］ 国家中医药管理局项目（０２０３ＺＰ０３）
［通讯作者］ 陈君，Ｔｅｌ：（０１０）６２８９９７３１
中药材生长过程中经常遭受多种害虫的危害，
其中蚜虫由于其个体小、繁殖速度快等特点，成为目
前生产上较难防治的一种害虫。麻黄蚜 Ａｐｈｉｓｅｐｈｅ
ｄｒａｐｏｓｉｓｓｐ．ｎｏｖ是近年来危害麻黄的一种主要害
虫，在宁夏种植基地发生十分普遍。试验表明吡虫
啉对麻黄蚜具有良好的防治效果，种植基地比较普
遍地使用吡虫啉［１］。
吡虫啉（ｉｍｉｄａｃｌｏｐｒｉｄ）化学名称１（６氯３吡啶
甲基）Ｎ硝基亚咪唑烷２基胺，又名一遍净、蚜虱
净、大功臣、康复多、必林等，是德国拜尔公司开发生
产的一种新型超高效、强内吸、广谱、低毒杀虫剂，它
对蚜虫、稻飞虱、叶蝉、蓟马等害虫及稻纵卷叶螟具
有很好的防治效果［２４］。有关吡虫啉残留分析方法，
国内外报道的较多，但其在麻黄中的残留分析方法
尚未见报道，本试验拟采用高效液相色谱法建立一
套前处理简便，又具有较好灵敏度、准确度和精密度
的吡虫啉残留分析方法，为科学控制农药使用、安全
生产中药材提供科学依据。
１ 材料与仪器
１．１ 材料 麻黄样品采自宁夏沿山路麻黄基地，喷
施２０００倍１０％吡虫啉可湿性粉剂样品及清水空白
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第３２卷第８期
２００７年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７