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Effects of puerarin on ADRP gene expression in fatty tissue of type 2 diabetes mellitus rats

葛根素对2型糖尿病大鼠脂肪组织ADRP基因表达的影响



全 文 :葛根素对2型糖尿病大鼠脂肪组织
ADRP基因表达的影响
孙 卫,郑学芝,徐秋玲,念 红,刘桂莲
(牡丹江医学院 生理教研室,黑龙江 牡丹江 157011)
[摘要] 目的:观察葛根素(Pue)对实验性2型糖尿病(2DM)大鼠脂肪组织中脂肪分化相关蛋白(ADRP)基
因mRNA表达的影响。方法:Wistar大鼠喂以高糖高脂饮食伴尾静脉注射小剂量链脲佐菌素(STZ)25mg·kg-1复
制2DM大鼠模型,将造模大鼠随机分为模型组(腹腔注射丙二醇)和3个 Pue治疗组(腹腔注射40,80,160mg·
kg-1),另选10只大鼠为正常组。各组大鼠连续腹腔注射6周后,空腹取材,测定空腹血糖(FBG)、血清胰岛素
(FINS)水平,并计算胰岛素抵抗指数(IR);同时以RTPCR法检测脂肪组织ADRP基因mRNA的表达。结果:与2
DM模型组比较,Pue高、中剂量组大鼠脂肪组织ADRP基因 mRNA表达显著降低(P<005);Pue高、中、低剂量组
大鼠FBG,IR及Pue高、中剂量组大鼠 FINS显著降低(P<005或 P<001)。结论:Pue可通过降低2DM大鼠
ADRP基因mRNA表达,降低胰岛素抵抗水平,从而降低2DM大鼠血糖。
[关键词] 葛根素;2型糖尿病;脂肪分化相关蛋白;基因表达
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)16202604
[收稿日期] 20071220
[基金项目] 黑龙江省卫生厅科研项目(2006392);牡丹江医
学院科研项目(C200603)
[通讯作者] 孙卫,Tel:(0453)6582156,Email:sunwei36@
126.com
  2型糖尿病(2diabetesmelitus,2DM)是一种
常见的内分泌代谢紊乱疾病,临床常以其并发症为
主要表现,其中脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗为2型
糖尿病患者的主要特征[1]。脂肪分化相关蛋白(ad
iposediferentiationrelatedprotein,ADRP)是一种反
映细胞内脂质积聚及与脂肪积聚相关疾病的灵敏而
特异的指标,该基因对脂肪组织的分化和功能非常
重要,包括能量储存及其内分泌功能,特别是与肥
胖、胰岛素抵抗的形成有关[2]。
葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取的单
体,其化学结构为8βD吡喃葡萄糖4,7二羟基异
黄酮苷。笔者的前期实验已证实葛根素具有降糖、
降脂等作用。本实验通过复制2DM模型,观察2
DM大鼠脂肪组织 ADRP基因 mRNA的表达,以探
讨葛根素降糖、降脂,改善胰岛素抵抗作用的机制。
1 材料
1.1 动物 健康Wistar大鼠60只,2月龄,雌雄各
半,体重180~240g,哈尔滨医科大学实验动物中心
提供,动物合格证号黑动字第 P00102008。实验前
置安静、避强光、洁净、室温20~25℃的环境中适应
性饲养3d。
1.2 药品与试剂 葛根素注射液,海南斯达制药有
限公司,批号H20023176;链脲佐菌素(streptozotocin,
STZ),Sigma公司;胰岛素放射免疫分析试剂盒,北京
北方生物技术研究所,批号 S10930046;RNA抽提试
剂盒、RTPCR试剂盒,上海生工生物工程公司。
1.3 仪器 德国 Eppendorf5331型 PCR扩增仪;
UVPGDS-8000型凝胶成像分析系统;北京六一电
泳仪、电泳槽。
2 方法
2.1 动物模型的制备及分组给药 随机留取10只
大鼠作为正常组,给予基础饲料,其余50只大鼠给
以高糖高脂饲料。持续喂养4周后,尾静脉一次性
注射STZ溶液25mg·kg-1,而正常组注射相同体
积的柠檬酸钠柠檬酸缓冲液,72h后测空腹血糖,
以血糖值高于111mmol·L-1而低于333mmol·
L-1为造模成功。成模大鼠继续喂以高糖高脂饲料,
并随机分为糖尿病模型组、Pue高、中、低剂量治疗
组(160,80,40mg·kg-1·d-1),每组10只大鼠,连
续腹腔注射6周,模型组及正常组同时注射等体积
丙二醇。
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2.2 标本收集与生化指标检测 各组大鼠乙醚麻
醉,眼内眦静脉丛采血;腹正中切口,迅速剖开腹腔,
取大网膜脂肪组织。以葡萄糖氧化酶法测定FBG;以
放射免疫方法测定FINS;计算胰岛素抵抗指数[3]。
IR=FBG×FINS/225
2.3 总 RNA的提取和鉴定 按 RNA抽提试剂盒
说明书提取大网膜脂肪组织总 RNA,采用甲醛变性
琼脂糖凝胶电泳方法鉴定 RNA的完整性。电泳结
束凝胶上出现清晰的18S和28S两条电泳条带,而
且28S条带亮度应是18S的2倍。否则表明 RNA
有降解,因为 28SrRNA可特征性也降解为类似的
18SrRNA。
2.4 RTPCR反应 以提取的总 RNA为模板,用
RTPCR法检测 ADRP基因表达。ADRP基因引物
序列为:上游 P15′CCAAGGATTCTGTAGCCAGCA
3;下游P25′ACAGTGGGACTCATCGGTGTC3;扩增
产物长度约523bp;以GAPDH基因为内参照,扩增
产物长度280bp,引物序列为上游P35′GGTGGAC
CTGACCTGCCGTCTAGA3;下游P45′TTACTCCTT
GGAGGCCATGTGGG3。PCR反应进行 30个循环
(94℃ 5min,50℃ 30s;72℃ 30s)和1个72℃
10min的循环。设空白对照,GAPDH作为阳性对
照。PCR产物做10%琼脂糖凝胶电泳,然后用凝
胶分析软件TotalLab20进行吸光度分析,ADRP和
GAPDH基因PCR产物电泳条带吸光度(A)的比值
作为ADRP基因表达水平的相对值,即 ADRPmR
NA表达相对值=ADRPmRNAA/GAPDHmRNAA。
2.5 统计学分析 采用 SPSS100软件进行统计
学分析,计量资料用 珋x±s表示,多组间均数比较采
用F检验,组间两两比较采用 LSD检验,P<005
为差别有统计学意义。
3 结果
3.1 Pue对2DM大鼠 FBG,FINS水平及 IR的影
响 与正常组相比,2DM大鼠FBG,FINS含量及IR
明显升高(P<001),经 Pue治疗后,Pue高、中、低
剂量组大鼠FBG,IR及 Pue高、中剂量组大鼠 FINS
显著降低(P<005或P<0.01)(表1)。
3.2 总RNA检测 RNA经1%甲醛变性琼脂糖凝
胶电泳观察可见清晰的28S,18S两条核糖体 RNA
条带,且28S和18S条带亮度约为2∶1,说明RNA完
整性好,未被降解,符合下一步逆转录反应模板的要
求,可以进一步实验(图1)。
表1 Pue对2DM大鼠FBG,FINS水平
及IR的影响(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/mg·kg-1
FBG
/mmol·L-1
FINS
/g·L-1
IR
正常 - 447±099 1688±305 395±071
模型 - 1377±3051) 4406±7951)1869±3381)
Pue 160 872±1933) 2971±5363)1281±2323)
  80 945±2132) 3631±6062)1578±3862)
  40 1091±2762) 3984±719 1601±3892)
  注:与正常组比较1)P<0.01;与模型组比较2)P<0.05,
3)P<0.01(表2同)
图1 脂肪组织总RNA凝胶电泳
3.3 Pue对2DM大鼠大网膜脂肪组织ADRP基因
mRNA表达情况 扩增后得到 GAPDH280bp和
ADRP523bp2个片段。图像分析结果显示,与正
常组相比2DM模型组大鼠大网膜脂肪组织 ADRP
基因 mRNA表达显著增高(P<001);给 Pue后,
高、中剂量组ADRP基因mRNA表达显著降低(P<
005),低剂量组无统计学意义(表2,图2)。
表2 Pue对2DM大鼠脂肪组织ADRP基因
mRNA表达的影响(珋x±s,n=10)
组别 剂量/mg·kg-1 ADRP/GAPDH
正常 - 058±009
模型 - 080±0121)
Pue 160 067±0122)
  80 069±0112)
  40 073±011
1.正常对照组;2.糖尿病模型组;3.低剂量Pue治疗组;
4.中剂量Pue治疗组;5.高剂量Pue治疗组
图2 各组脂肪组织中ADRP基因mRNARTPCR
产物电泳图
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4 讨论
近年来脂毒性在2型糖尿病发病中的作用逐渐
受到重视,肌肉中脂质的积聚可引起胰岛素抵抗,脂
质在胰腺的积聚会损害胰岛 β细胞胰岛素分泌功
能。β细胞的胰岛素分泌不仅取决于血葡萄糖水
平,也受到游离脂肪酸水平的影响,同时后者又可影
响肌肉、脂肪组织对胰岛素的反应性。脂肪组织是
胰岛素敏感的重要靶组织,也是最早胰岛素抵抗的
部位[4]。ADRP是一种存在于灵长类脂肪细胞的相
对分子质量为53000的蛋白质,在脂肪细胞分化的
早期,ADRP就有表达(早于脂肪酸结合蛋白、脂蛋
白脂酶),ADRP高水平的表达出现在成熟的脂肪细
胞[5]。ADRP基因表达的蛋白质 adipophilin是形成
细胞内脂质小滴囊泡的主要成分,也是巨嗜细胞、脂
肪细胞内脂质沉积的标志[6]。adipophilin可促进脂
肪酸的吸收,最终导致细胞浆内自由脂肪酸增多。
游离脂肪酸增多可造成胞内长链脂肪酰辅酶 A堆
积,浓度增加,可直接影响胰岛细胞对葡萄糖刺激下
的胰岛素释放反应。adipophilin还能通过增加胰岛
β细胞、肌肉和脂肪细胞内的脂肪积聚,引起胰岛素
分泌异常和胰岛素抵抗。
本实验通过高糖高脂饮食伴尾静脉注射小剂量
链脲佐菌素复制2DM大鼠模型,由于长期高糖高
脂饮食,模型组大鼠出现了 FPG,FINS水平及计算
IR显著增加,说明大鼠发生了胰岛素抵抗,2DM大
鼠模型制备成功。而葛根素各剂量治疗组上述指标
明显减轻,表明葛根素在一定程度上可改善 2DM
大鼠的胰岛素抵抗。葛根素注射液作为一种纯中药
制剂,很早就被应用于糖尿病的治疗。本实验还观
察到,2DM大鼠大网膜脂肪组织ADRP基因mRNA
的表达明显增加,葛根素治疗后,高、中剂量组 AD
RP的表达显著降低。说明葛根素可通过抑制脂肪
组织ADRP基因的表达,降低胰岛素抵抗水平,从而
降低2型糖尿病大鼠血糖和改善体内脂代谢紊乱,
达到治疗糖尿病的目的。有研究表明,ADRP基因
表达受过氧化物酶增值体激活的受体 PPARγ,
PPARα,PPARδ调控,脂肪酸经由 PPAR介导促进
adipophilin的高表达[7];另外阻止蛋白激酶 C的活
性,将导致PPAR基因的高表达和细胞内脂滴增多,
变大,使用药物使PPAR基因表达下降时,将使脂滴
融解、消失[8]。葛根素改变PPARγ的表达的可能作
用机制尚有待于下一步的实验研究加以验证。
[参考文献]
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EfectsofpuerarinonADRPgeneexpressioninfatytissueof
type2diabetesmelitusrats
SUNWei,ZHENGXuezhi,XUQiuling,NIANHong,LIUGuilian
(PhysiologyDepartmentofMudanjiangMedicalColege,HeilongjiangMudanjiang157011,China)
[Abstract] Objective:ToobservetheefectsofpuerarinonADRPgenemRNAexpressioninfatytissueoftype2diabetes
(下转第2060页)
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   表2 流式细胞仪检测结果(珋x±s,n=3)
组别
剂量
/μmol·L-1
早期细胞凋亡率
/%
晚期细胞凋亡率
/%
对照组 - 11±03 46±07
皂苷Ⅰ 062 129±051) 363±261)
皂苷Ⅱ 045 137±031) 411±241)
皂苷Ⅲ 102 68±021) 323±301)
皂苷Ⅳ 171 54±061) 200±101)
皂苷Ⅴ 10651 13±01 182±041)
皂苷Ⅵ 130 37±011) 135±171)
  注:与对照组比较1)P<001
咽清毒颗粒为鼻咽癌放疗患者良好的辅助药物,楼
莲胶囊配合化疗治疗中晚期消化道肿瘤[3]。为进
一步证实重楼皂苷的抗肿瘤活性,确定细胞毒谱,作
者选用10种不同组织类型的肿瘤细胞为靶细胞,以
滇重楼皂苷为干预药物,进行了体外抑瘤实验。研
究结果表明,滇重楼皂苷体外对10种不同类型的肿
瘤细胞均有较为明显的抑制增殖效应,其中,对
LA795,A549,Hela,CaCo2细胞抑制效果最为显著,
HL60,A498,A431次之,HepG2,BEL7402,KB细胞
抑制较弱。结果表明滇重楼皂苷体外对多种不同类
型的肿瘤细胞并无明显的选择性毒性作用,但其抑
瘤程度存在着一定的差别,这些差别似乎可用不同
类型的肿瘤细胞具有不同生物学特征来解释。而滇
重楼皂苷能够抑制多种肿瘤细胞增殖效应也许存在
着不同的作用机制,需要今后进一步深入研究。并
且,皂苷的结构与细胞毒活性间具有一定的结构药
效关系,可为将来获得更强活性的皂苷化合物进行
结构修饰提供理论指导。
近年来人们认为,肿瘤是细胞增殖和死亡失衡
所致。细胞凋亡不同于细胞坏死。细胞的凋亡与肿
瘤的发生、发展和消退有密切关系,具有独特的生化
和形态特征。虽然许多化合物具有细胞毒活性,可
以抑制肿瘤细胞的增殖,并引起肿瘤细胞的死亡,但
并不是所有这些化合物都是通过诱导细胞凋亡来起
到这种作用[4]。已有研究表明重楼皂苷类通过影
响线粒体功能诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡[57]。
本研究针对LA795细胞株,采用流式细胞检测法对
滇重楼皂苷的诱导细胞凋亡作用进行了研究,结果
显示其在极低的浓度下便可诱导肿瘤细胞的凋亡,
是其抗肿瘤作用的机制之一。
目前从中草药中寻找天然抗肿瘤活性成分是抗
癌药物研究的一个重要途径和研究热点[8]。随着
对滇重楼活性成分皂苷的深入研究,有望获得高效
低毒并具有明确抗肿瘤作用和机制的抗癌药物。
[参考文献]
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[责任编辑 古云侠]
(上接第2028页)
melitusrats(T2DM).Method:WiastarratsofT2DMmodelweremadebyfeedingwithhighglucoseandfatdietandinjectingwith
smaldoseofstreptozocin(25mg·kg-1).40modelratswererandomlydividedintomodelcontrolgroupandthreepueraringroups
(40,80,160mg·kg-1),another10ratswereselectedasnormalcontrolgroup.FBGandFINSweremeasuredtocalculateIRafter
ratswereinjectedconsecutivelyfor6weeks.ThelevelofADRPgenemRNAinfatytissuewasdeterminedbyRTPCRafterratswere
injectedeightweeks.Result:Comparedwithmodelcontrolgroup,highandmiddledosageofpuerarincandecreasedADRPgenemR
NAexpressioninfatytissueobviously,FBG,IRlevelineachpueraringroupandFINSinhighandmiddledosagepueraringroupsde
creasedobviously.Conclusion:PuerarincandecreasethebloodglucoselevelofT2DMbydownregulatingADRPmRNAexpression
anddepressingtheinsulinresistance.
[Keywords] puerarin;T2DM;ADRP;geneexpression
[责任编辑 古云侠]
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